骨桥蛋白对人膝骨关节炎软骨细胞透明质酸表达的影响

骨桥蛋白对人膝骨关节炎软骨细胞透明质酸表达的影响罗伟;张方杰;李宇晟;雷光华【摘要】BACKGROUND:Bothosteopontinandhyaluronicacidinvolveinthepathologicalprocessofosteoarthritis,resultingintheabnormalexpressionlevelsofvariouscytokinesandenzymes.However,therelationshipbetweenthehighexpressionofosteopontinandhyaluronicacidinchondrocytesremainsunclear.<br>OBJECTIVE:Toinvestigatetheeffectofosteopontinontheexpressionofhyaluronicacidinhumankneeosteoarthriticchondrocytesinvitrobymodulatingthelevelofosteopontin.<br>METHODS:Chondrocytesfromhumankneeosteoarthriticcartilagewereculturedinvitro,andwerethendividedintothreegroups:blankcontrolgroupwithoutanytreatment;osteopontingroupandandpontinsiRNAgroupweretreatedwith1mg/LrecombinanthumanosteopontinandosteopontinsiRNA,respectively.Expressionlevelsofosteopontin,hyaluronicacidsynthase1,2and3mRNAweredetectedbyreal-timePCR,andthelevelsofhyaluronicacidweremeasuredusingELISA.<br>RESULTSANDCONCLUSION:Comparedwiththeblankcontrolgroup,themRNAexpressionsofhyaluronicacidsynthase1,2and3wereremarkablyincreasedintheosteopontingroup,whilesiRNAmadethesignificantlyinhibitoryeffectsonthehyaluronicacidsynthase1,2and3mRNAexpressions(P<0.05).Thelevelofhyaluronicacidinchondrocytesintheosteopontingroupwassignificantlyhigherthanthatintheothertwogroups(P<0.05).Ourresultssuggestthatosteopontininducesthesynthesisofhyaluronicacidinosteoarthriticchondrocytesthroughupregulatingthehyaluronicacidsynthasesexpressionlevels.%背景：在骨关节炎病程中，骨桥蛋白水平和透明质酸水平的改变可以使一系列细胞因子和酶表水平改变，但是软骨细胞中骨桥蛋白高表达是否与透明质酸高表达相关目前尚不楚。<br> 目的：通过调节体外培养人膝骨关节炎软骨细胞的骨桥蛋白水平，观察其对软骨细胞透明质酸表达水平的影响。<br> 方法：从人膝骨关节炎软骨组织标本中获取并体外培养软骨细胞，实验分为3组：空白对照组不进行任何干预，骨桥蛋白干预组以1mg/L重组人骨桥蛋白干预，骨桥蛋白siRNA组以骨桥蛋白siRNA进行干预。采用realtimePCR法检测各组骨桥蛋白，透明质酸合成酶1，透明质酸合成酶2和透明质酸合成酶3mRNA表达，ELISA法检测透明质酸水平。<br> 结果与结论：①与空白对照组相比，重组人骨桥蛋白干预组透明质酸合成酶1，2，3表达升高，而骨桥蛋白siRNA干预组透明质酸合成酶1，2，3表达下降，3组间透明质酸合成酶1，2，3表达比较差异均有显著性意义(P<0.05)；②重组人骨桥蛋白干预组软骨细胞透明质酸表达显著高于空白对照组和骨桥蛋白siRNA干预组(P<0.05)。③结果说明，提示骨桥蛋白可以通过刺激透明质酸合成酶分泌进而诱导骨关节炎软骨细胞透明质酸表达。【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2016(020)042【总页数】8页(P6244-6251)【关键词】组织构建;软骨细胞;骨桥蛋白;透明质酸;透明质酸酶;骨关节炎;国家自然科学基金【作者】罗伟;张方杰;李宇晟;雷光华【作者单位】中南大学湘雅医院骨科，湖南省长沙市410008;中南大学湘雅医院骨科，湖南省长沙市410008;中南大学湘雅医院骨科，湖南省长沙市410008;中南大学湘雅医院骨科，湖南省长沙市410008;中南大学骨科研究所，湖南省长沙市410008【正文语种】中文R318引用本文：罗伟，张方杰，李宇晟，雷光华.骨桥蛋白对人膝骨关节炎软骨细胞透明质酸表达的影响[J].中国组织工程研究，2016，20(42):6244-6251.文章快速阅读：罗伟，男，1983年生，湖北省广水市人，汉族，2009年北京大学毕业，博士，主治医师，主要从事骨关节外科，关节镜，骨肿瘤的研究。(2016)42-06244-08稿件接受：2016-07-20文题释义：骨桥蛋白：1979SengerRGD相似，人们将其命名为OPN。后来一些学者在不同的组织细胞中发现了骨桥蛋白，因此骨桥蛋白曾被称为44kD骨酸蛋白，PP69、骨延蛋白1、尿蛋白、分泌的磷蛋白、骨唾液酸蛋白、44kD骨磷蛋白和2aR。自1986年来相继克隆了大、小鼠骨桥蛋白，人骨桥蛋白，猪骨桥蛋白，牛骨桥蛋白，鸡骨桥蛋白和兔骨桥蛋白cDNA。近年来，骨桥蛋白在早期细胞免疫应答、肉芽肿炎症、肿瘤发生及转移的作用中倍受关注。反转录酶：是一种存在于部分RNA病毒中具有反转录活性、能以单链RNA作为DNADNADNA(cDNA)。反转RT-PCRRNADNARNA背景：在骨关节炎病程中，骨桥蛋白水平和透明质酸水平的改变可以使一系列细胞因子和酶表达水平改变，但是软骨细胞中骨桥蛋白高表达是否与透明质酸高表达相关目前尚不清楚。胞透明质酸表达水平的影响。方法：从人膝骨关节炎软骨组织标本中获取并体外培养软骨细胞，实验分为 3组空白对照组不进行任何干预，骨桥蛋白干预组以1mg/L重组人骨桥蛋白干预，骨桥蛋白siRNA组以骨桥蛋白siRNA进行干预。采用realtimePCR法检测各组骨桥蛋白，透明质酸合成酶1，透明质酸合成酶2和透明质酸合成酶3mRNA表达ELISA法检测透明质酸水平。结果与结论：①与空白对照组相比，重组人骨桥蛋白干预组透明质酸合成酶1，2，3表达升高，而骨桥蛋白siRNA干预组透明质酸合成酶1，2，3表达下降，3组1，2，3P＜0.05siRNA组织构建；软骨细胞；骨桥蛋白；透明质酸；透明质酸酶；骨关节炎；国家自然科学基金主题词：骨桥蛋白；软骨细胞；透明质酸；骨关节炎；组织工程国家自然科学基金资助项目(81401838)；中南大学自由探索计划(2012QNZT095)BACKGROUND:Bothosteopontinandhyaluronicacidinvolveinthepathologicalprocessofosteoarthritis,resultingintheabnormalexpressionlevelsofvariouscytokinesandenzymes.However,therelationshipbetweenthehighexpressionofosteopontinandhyaluronicacidinchondrocytesremainsunclear.OBJECTIVE:Toinvestigatetheeffectofosteopontinontheexpressionofhyaluronicacidinhumankneeosteoarthriticchondrocytesinvitrobymodulatingthelevelofosteopontin.METHODS:Chondrocytesfromhumankneeosteoarthriticcartilagewereculturedinvitro,andwerethendividedintothreegroups:blankcontrolgroupwithoutanytreatment;osteopontingroupandandpontinsiRNAgroupweretreatedwith1mg/LrecombinanthumanosteopontinandosteopontinsiRNA,respectively.Expressionlevelsofosteopontin,hyaluronicacidsynthase1,2and3mRNAweredetectedbyreal-timePCR,andthelevelsofhyaluronicacidweremeasuredusingELISA.RESULTSANDCONCLUSION:Comparedwiththeblankcontrolgroup,themRNAexpressionsofhyaluronicacidsynthase1,2and3wereremarkablyincreasedintheosteopontingroup,whilesiRNAmadethesignificantlyinhibitoryeffectsonthehyaluronicacidsynthase1,2and3mRNAexpressions(P＜0.05).Thelevelofhyaluronicacidinchondrocytesintheosteopontingroupwassignificantlyhigherthanthatintheothertwogroups(P＜0.05).Ourresultssuggestthatosteopontininducesthesynthesisofhyaluronicacidinosteoarthriticchondrocytesthroughupregulatingthehyaluronicacidsynthasesexpressionlevels.Subjectheadings:Osteopontin;Chondrocytes;HyaluronicAcid;Osteoarthritis;TissueEngineeringFunding:theNationalNaturalScienceFoundationofChina,No.81401838;theFreeExplorationProgramofCentralSouthUniversity,No.2012QNZT095Citethisarticle:LuoW,ZhangFJ,LiYS,LeiGH.Effectofosteopontinontheexpressionofhyaluronicacidinhumankneeosteoarthriticchondrocytes.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(42):6244-6251.LuoWei,M.D.,Attendingphysician,DepartmentofOrthopedics,XiangyaHospitalofCentralSouthUniversity,Changsha410008,HunanProvince,China透明质酸(hyaluronicacid，HA)是一种高分子量的葡萄糖胺聚糖(GAG)，在机体泌合成的细胞外基质组成，除了水之外，细胞外基质的主要成分是胶原框架(主要是Ⅱ型胶原)、蛋白聚糖及透明质酸。由大分子聚合物组成的透明质酸，可连接软本生物化学特性[1]。透明质酸产量的调节主要依赖于透明质酸合成酶的代谢。有31和透明质酸合成酶2聚合形成大分子量透明质酸，而透明质酸合成酶3则生成低2免疫细胞的功能和炎性递质的表达[3]，组织中表达的透明质酸的分子量和浓度发生改变，其作为炎性递质产生抗炎作用的功能也随之发生改变[4-5]。骨桥蛋白是一类小的整联蛋白结合配体N端联结糖蛋白(SIBLINGs)家族的一员，它广泛存在于矿化组织的细胞外基质、细胞外液、炎性区域中[6]。软骨细胞、成骨细胞、骨细胞及破骨细胞均可分泌骨桥蛋白。在胚胎骨骺生长板中的肥大软骨细胞和骨形成细胞中也发现有骨桥蛋白存在，研究表明，骨桥蛋白参与了正常关节软骨的发生、修复以及代谢稳态的维持过程，并都发挥了重要作用[7-8]。透明质酸是关节滑液的主要成分之一，透明质酸由关节软骨细胞和滑膜细胞合成后即被释放进入关节腔，积聚在软骨和韧带表面，在关节润滑和维持关节内稳态方面发挥主要作用[1，9]。研究表明，在骨关节炎关节滑液中透明质酸的浓度和相对分子质量均发生了改变，且在疾病慢性低度炎性反应中发挥作用。透明质酸可以通过降低肿瘤坏死因子α和白细胞介素8等而在骨关节炎中发挥抗炎作用[10-11]。血清透明质酸水平可作为放射学骨关节炎的生物学标志[12]。关节内注射大分子透明质酸已被临床用于补充膝骨关节炎关节内黏弹性，并可延缓骨关节炎病情进展[13mRNA[14]。骨桥蛋白可通过促进双水焦磷酸钙在关节软骨中沉着，形成病理性钙沉积，从而引起骨关节炎关节软骨变性[15]；随后，研究发现，在人膝骨关节炎患者的血浆、滑液和关节软骨中骨桥蛋白水平上升并与关节破坏程度相关[16-17]。可受骨桥蛋白调控的金属基质蛋白酶13、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖等在骨关节炎的病理过程中也具有重要地位。然而，骨桥蛋白和透明质酸的关系以及在人骨关节炎关节软骨中，骨桥蛋白能否影响透明质酸的表达仍不明确。实验拟通过调节体外培养的人膝骨关节炎软骨细胞的骨桥蛋白水平，观察其对软骨细胞透明质酸的表达水平的影响。设计 分组对比设计。时间及地点 实验于2014年1至4月于中南大学湘雅医院医学遗传学国家重点实验室完成。材料 共计7例骨关节炎软骨标本，均来自于中南大学湘雅医院住院患者人工表面膝关节置换中切除的软骨。以上标本的取材均先告知患者并征得同意。纳入标准 ①采用中华医学会骨科学分会制定的《骨关节炎诊治指南(2007版)》中的膝骨关节炎诊断标准；②原发性膝骨关节炎患者，近6个月内未进行膝关节腔内透明质酸或其他药物注射治疗，未口服治疗骨关节炎的相关药物；③年55-65岁。6实验方法人膝骨关节炎软骨细胞体外培养 取膝关节置换术中胫骨平台侧标本，以用PBS漂洗干净后，削取表面软骨块并剪碎成1mm×1mm大小，再装至15mL离心管，每管中加入两三倍组织体积量Ⅱ型胶原酶，充分混匀后置入37℃，体积分数5%CO2培养箱中，12-16h后见软骨组织大部分消融后取出。将离心管内含软骨组织混合液倒入60目滤网过滤，再将滤液以吸管转移至15mL离心管并加入PBS至12mL，再以800r/min离心6min后取出离心管，弃上清液，取最下层浑浊液约3mL即为含软骨细胞的滤液。在滤液中加入6-8mL体积分数15%的FBS，DMEM/F12完全培养基(含1%链霉素和青霉素)使软骨细胞一般以1×108L-1细胞浓度分装至25mm2培养瓶后放入37℃，体积分数5%CO2培养箱。以后3-5d更换1次培养基，每次用量3-5mL。80%时即可传代。传代5mLPBS的培养基中和胰蛋白酶-EDTA)1mL0.05%胰蛋白酶-EDTA并使之布满瓶底，放入37℃，体积分数5%CO2培养箱中5min后取出，显微镜见细胞成圆形漂浮流动时加入8-10mL含15%FBSDMEM/F12完全培养基(含1%链霉素和青霉素)，混匀后分装至两个25mm2培养瓶后放入37℃，体积分数5%CO2培养箱中。siRNA骨桥蛋白特异性siRNA片段按照ReynoldsA[18]总结出理性设计有效siRNA的8条原则：①GC含量在30%-52%之间；②正义链15-19位至少有3个A或U；19A310U19GC；⑧13G。由上海InvitrogenSiRNA1。siRNARNase-freeH2O20μmol/L(lipo2000siRNA6nmol/LsiRNA-lipo20001500μL(v2，含15%FBSDMEM/F124-6hsiRNA-lipo200037℃，5%CO224h。倒置荧光显微镜中观察带荧光Anoligonucleotide(阴性对照)片段转染效率。软骨细胞骨桥蛋白siRNA转染效率的鉴定和筛选 干预24h后，提取软骨细胞总RNA，检测其A值，测算RNA浓度和总量。RNA纯度为A260/A280=1.8-2.0由于A260为1的RNA溶液中约含有40mg/L。因此所提取的RNA浓度为(mg/L)=A260值×40mg/L×稀释倍数。RNA总量(μg)=RNA浓度×总体积(mL)。RNA反转录制造cDNA，然后进行RealtimeQPCR检测骨桥蛋白mRNA表达。细胞活性检测(MTT法)检测细胞活性。筛选转染效率最高的一组应用于下一步实验。分组干预实验 取第1代软骨细胞进行试验，先予以含1%FBSDMEM/F12培养24h，从而使细胞同步化出现在非活动期和非增殖期。然后再继续给予含体积分数10%FBS的DMEM/F12完全培养基孵育。每个样本3份，随机分为3组：空白对照组不进行任何干预，重组人骨桥蛋白干预组以1mg/L干24h，骨桥蛋白siRNA组以筛选出从骨桥蛋白siRNA进行干预24h。总RNA样本制备 取对数生长期细胞，按照RNAsimpleTotalRNAKit总RNA提取试剂盒操作步骤进行提取。琼脂糖凝胶电泳确定总RNA质量；紫外分光光度仪测，A260/A280＞1.8，检验总RNA纯度并计算其浓度符合实验要求。RNA(RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit，Fermentas.)，按照说明书进行操作。人骨桥蛋白、β-actin、透明1，2，3RealtimeQPCRInvitrogen2。RealtimeQPCR反应 25μL反应体系，操作步骤按照Maxima➅SYBR➅Green/ROXqPCRMasterMix(2X)，Fermentas.说明进行实验结果以cDNA分别和3对引物进行RealtimeQPCR反应，获得扩增曲线、熔解曲线，依据Ct值计算2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=[样本A(目的基因Ct值-内参基因Ct值)-样本B(目的基因Ct值-内参基因Ct值)]，得出骨桥蛋白，透明质酸合成酶1，透明质酸合成酶2和透明质酸合成酶3的mRNA相对水平。Westernblot检测蛋白表达 分析结果以Gelpro4.0版凝胶吸光度分软件进行分析，测其IOD(integratedopticaldensity)累积吸光度参考值。ELISA0，50，100，500，1000，2000ng/L)应用固相夹心酶联免疫吸附实验技术的透明质酸检测试实验过程中加入标准品、待测样品、生物素标记物和酶标记物与包被在微孔上的抗体一起温育反应使其充分结合在微孔壁上，若样品中含有该因子的抗原则会形成抗体，抗原，抗体复合物。反应过后冲洗掉未结合的部分，再加入底物反应，底物在酶的作用下变为蓝色，并在酸的作用下转化为最终的黄色。通过读取吸光度值来绘制出标准曲线，并在标准曲线上反算出待测样品的浓度。主要观察指标①不同干预组间骨关节炎软骨细胞中目的基因骨桥蛋白，透1，2，3mRNA预组间骨关节炎软骨细胞中透明质酸表达水平的差异。SPSS17.0Student-Newman-Keuls人膝骨性关节炎软骨细胞形态及骨桥蛋白siRNA转染鉴定 ①原代骨关节炎软骨细胞贴壁后，成团生长，以此为中心向四周扩散生长，软骨细胞多呈椭圆形短梭形或三角形(图1A)；②抗Ⅱ型胶原抗体1∶1000染色(图1B)；③荧光显微镜示大多数软骨细胞已转染siRNA(＞90%)(图1C)；④MTT检测示各组间细胞生存率差异无显著性意义(P＞0.05)(图1D)；⑤mRNA鉴定示mRNA完整(图1E)；⑥RealtimePCRNC-siRNAsiRNAmRNAP＜0.05siRNA-11F)siRNA-1标准曲线绘制及分析RealtimePCRβ-Actin1232A-ESmRNA1，2，3以及透明质酸表达的差异与空白对照组相比，重组人骨桥蛋白干预组骨桥蛋白mRNA升高(3.53±0.17)倍，骨桥蛋白siRNA干预组骨桥蛋白mRNA水平降低(0.62±0.21)倍，3组之间差异有显著性意义(P＜0.05)，见图3A。与空白对照组相比，重组人骨桥蛋白干预组骨桥蛋白表达水平升高(1.68±0.23)倍，骨桥蛋白siRNA干预组骨桥蛋白表达水平降低(0.72±0.20)倍，3组之间差异有显著性意义(P＜0.05)，见图3B。1mRNA高(2.32±0.23)siRNA1mRNAP＜0.053C。2mRNA高(3.31±0.10)siRNA2mRNAP＜0.053D。3mRNA高(7.28±0.31)siRNA3mRNAP＜0.053E。与空白对照组(299.7±3.00)ng/L相比，重组人骨桥蛋白干预组透明质酸表达水平升高(884.00±7.61)ng/L，骨桥蛋白siRNA干预组透明质酸表达水平降低(207.02±4.07)ng/L，3组之间差异有显著性意义(P＜0.05)，见图3F。实验研究发现，在体外培养的人膝骨关节炎软骨细胞中，透明质酸合成酶1mRNA，透明质酸合成酶2mRNA及透明质酸合成酶3mRNA都有表达，ELISA法显示其中透明质酸表达浓度(299.7±3.00)ng/L。软骨细胞予1mg/L重组人骨桥蛋白干预24h后，其透明质酸合成酶1mRNA，透明质酸合成酶2mRNA及透明质酸合成酶3mRNA表达水平分别升高(2.32±0.23)倍，(3.31±0.10)倍和(7.28±0.31)倍；透明质酸表达浓度升高为(884.00±7.61)ng/L。软骨细胞予骨桥蛋白siRNA干预24h后，其透明质酸合成酶1mRNA，透明质酸合成酶2mRNA及透明质酸合成酶3mRNA表达水平分别降低为(0.51±0.05)倍，(0.59±0.02)倍和(0.37±0.06)倍；透明质酸表达浓度降低为(207.02±4.07)ng/L。且3组之间差异有显著性意义。的行为，也可直接与细胞发生作用从而影响细胞行为[1，9]，在关节润滑和维持关节内稳态方面发挥主要作用，参与骨关节炎发病的重要过程[1，10]。研究证实，人膝骨关节炎软骨细胞中，骨桥蛋白水平的变化可同时影响透明质酸合成酶mRNAmRNA病理过程；在多种疾病中，骨桥蛋白与透明质酸水平都存在一致性[19-20]；有研2不明确。3mRNA3mRNA12mRNA32N5C80%相同序列的中心细胞质区域。实验发现，31105-106u，而透明质酸合成酶2和透明质酸合成酶3的产物分子量约为其2倍，22×106u[1]2织所必需的透明质酸和维持正常软骨基质方面具有关键作用[2，22]。透明质酸合32，22-23]，但是表达水2，而体外培养的软骨细胞则不一定可以表达透明质酸合成1[223mRNA2mRNA实验研究发现，骨桥蛋白和透明质酸均参与了骨关节炎一系列病理过程：在人膝骨关节炎患者的血浆，滑液和关节软骨中骨桥蛋白水平上升并与关节破坏程度相关[16-17]。可受骨桥蛋白调控的金属基质蛋白酶13、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖等在骨关节炎的病理过程中也具有重要地位。透明质酸可以通过降低肿瘤坏死因子α和白细胞介素8等而在骨关节炎中发挥抗炎作用[10-11]。血清透明质酸水平可作为放射学骨关节炎的生物学标志[12]。最近有研究发现滑膜成纤维细胞中，骨桥蛋白和透明质酸共同参与了骨关节炎滑膜炎的发病病理过程。然而，骨桥蛋白和透明质酸研究证实，在人膝骨关节炎软骨细胞中，骨桥蛋白可以通过调控透明质酸合成酶分泌进而诱导骨关节炎软骨细胞中透明质酸的表达，初步揭示了骨桥蛋白和透明质酸的共同作用参与了骨关节炎发病病理过程。实验中发现骨桥蛋白可以诱导骨关节炎软骨细胞中透明质酸的表达，目前，尚未见相关类似研究报道。然而，有关两者共同作用的具体机制并不清楚，亟需进一步研究探索。结论：骨桥蛋白可以通过调控透明质酸合成酶分泌进而诱导骨关节炎软骨细胞透明质酸表达。作者贡献：第一作者进行实验设计、实施和成文，通讯作者审校。利益冲突：所有作者共同认可文章内容不涉及相关利益冲突。伦理问题：受试者对本研究有一定了解，并在自由意志下同意获取实验标本，对所提供标本者无人身损害，并签署术中无偿提供软骨组织知情同意书。研究方案获医院伦理委员会批准。CNKI3文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。【相关文献】PavlovićM,AdamičM,SchullerPetrovićS.Theactualroleofhyaluronicacid-basedandcalciumhydroxylapatitesofttissuefillers:aguideforapracticingdermatologist.GItalDermatolVenereol.2012;147(3):295-314.NeumanMG,NanauRM,Oruña-SanchezL,etal.Hyaluronicacidandwoundhealing.JPharmPharmSci.2015;18(1):53-60.NonakaT,KikuchiH,IkedaT,etal.Hyaluronicacidinhibitstheexpressionofu-PA,PAI-1,andu-PARinhumansynovialfibroblastsofosteoarthritisandrheumatoidarthritis.JRheumatol.2000;27(4):997-1004.CantorJO,NadkarniPP.Hyaluronan:theJekyllandHydemolecule.InflammAllergyDrugTargets.2006;5(4):257-260.SternR,AsariAA,SugaharaKN.Hyaluronanfragments:aninformation-richsystem.EurJCellBiol.2006;85(8):699-715.RittlingSR,SinghR.OsteopontininImmune-mediatedDiseases.JDentRes.2015;94(12):1638-1645.El-TananiMK.Roleofosteopontinincellularsignalingandmetastaticphenotype.FrontBiosci.2008;13:4276-4284.StandalT,BorsetM,SundanA.Roleofosteopontininadhesion,migration,cellsurvivalandboneremodeling.ExpOncol.2004;26(3):179-184.MiglioreA,ProcopioS.Effectivenessandutilityofhyaluronicacidinosteoarthritis.ClinCasesMinerBoneMetab.2015;12(1):31-33.HenrotinY,RamanR,RichetteP,etal.Consensusstatementonviscosupplementationwithhyaluronicacidforthemanagementofosteoarthritis.SeminArthritisRheum.2015;45(2):140-149.WangCT,LinYT,ChiangBL,etal.Highmolecularweighthyaluronicaciddown-regulatesthegeneexpressionofosteoarthritis-associatedcytokinesandenzymesinfibroblast-likesynoviocytesfrompatientswithearlyosteoarthritis.OsteoarthritisCartilage.2006;14(12):1237-1247.ElliottAL,KrausVB,LutaG,etal.SerumhyaluronanlevelsandradiographickneeandhiposteoarthritisinAfricanAmericansandCaucasiansintheJohnstonCountyOsteoarthritisProject.ArthritisRheum.2005;52(1):105-111.WangCT,LinJ,ChangCJ,etal.Therapeuticeffectsofhyaluronicacidonosteoarthritisoftheknee.Ameta-analysisofrandomizedcontrolledtrials.JBoneJointSurgAm.2004;86-A(3):538-545.ZhangZ,FanJ,BeckerKG,etal.Comparisonofgeneexpressionprofilebetweenhumanchondronsandchondrocytes:acDNAmicroa