微生物纯度验证

1范围本规程规定了古菌、细菌、真菌、病毒（种）纯度检测的程序和方法。本规程适用于从事微生物菌种资源保藏及研究的机构、大学、企业、个人等。2术语、定义下列术语和定义适用于本规程2.1纯度检测puritycheck指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。2.2纯培养pureculture由单个细胞的后代组成的培养物，即单细胞培养物或无性繁殖系。通常是由挑取单个菌落或利用单胞分离技术，移种繁殖获得。3.菌种的纯度检测3.1古菌和细菌的纯度检测3.1.1菌落形态在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。3.1.2细胞形态对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜等特征应相似3.1.3芽抱大小、位置、形状宜检测样品是否形成芽抱，对形成芽抱的菌种，其芽抱大小、位置、形状应相似。3.2放线菌菌种纯度检测3.2.1菌落形态在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，挑取单菌落，适宜培养后，在同一平板上单菌落形状、大小、表面状况、质地、光泽、颜色等应相似。如怀疑为细菌污染，则30°C液体培养24小时，培养液不应浑浊，如浑浊则视为细菌污染。3.2.2培养特征分别接种三种以上培养基，在三种以上培养基上的培养特征应相同，包括气生菌丝、基内菌丝、可溶性色素的颜色等。3.2.3抱子丝及抱囊在特定的培养基、培养温度及培养时间等条件下，抱子着生方式、抱子丝形态及其颜色或抱囊着生位置（气丝或基丝）、抱囊的形状，大小应呈现出一致性。3.3酵母菌种纯度检测3.3.1菌落形态应对菌落形态相似性进行检测。在特定的培养基上，通过对待检测菌株进行稀释或划线涂布平板获取单菌落，一定的培养条件下，比较同一平板内，菌落的大小、形状、颜色、隆起、表面状况、质地、光泽等应一致。3.3.2个体形态应对检测样品的个体形态进行检测。在指定的培养基及培养条件下，细胞形状、大小及细胞的增殖方式应一致。3.3.3繁殖方式酵母繁殖的方式应一致，如是芽殖，出芽的方位、数量应一致。3.4丝状真菌菌种纯度检测3.4.1菌落特征菌落的形态等表观特征应一致。3.4.2菌丝特征在特定的培养基和培养条件下，菌丝分隔、菌丝形态等应一致。3.4.3其他主要显微特征应一致3.4.4检测是否有细菌污染3.4.5对于外观上不能确定菌种纯度的，利用单胞分离技术获得纯培养物进行对比，其菌丝、抱子等特征应与原始菌株的描述一致。3.5病毒的纯度检测3.5.1纯粹检查应将待检病毒液直接接种含硫乙醇酸盐培养基（T.G）、酪蛋白胨琼脂培养基（G.A）、葡萄糖蛋白胨汤。通过一定温度时间培养后，检查结果应无细菌生长为纯粹。3.5.2支原体检查检测由禽胚组织或其细胞所培养的病毒应用改良Frey氏培养基。检测其它培养方法所得病毒应用支原体培养基。任何一次琼脂平板上出现支原体菌落，判为阳性。阳性对照中至少有一个平板长菌落，而阴性对照中无菌落生长，则检验有效。3.5.3外源病毒检查病毒类制品在毒种选育和生产过程中，经常使用动物或细胞基质培养，因此，有可能造成外源因子（特别是外源病毒因子）的污染。为了保证制品质量，需要对毒种和细胞进行外源因子检测。3.5.3.1对病毒主种子批或工作种子批，应抽取足够检测试验需要量的供试品进行病毒外源因子检测。在试验前应用特异性抗体（血清）中和本病毒（或单克隆抗体），所用的抗体免疫源应采用与生产疫苗（或制品）不同种而且无外源因子污染的细胞（或动物）制品。如果病毒曾在禽类组织或细胞中繁殖过，则抗体不能用禽类来制备。若用鸡胚，应来自SPF鸡群。以下方法可以选择一种或多种进行。3.5.3.1.1动物试验法3.5.3.1.1.1小鼠试验法取15-20g小鼠至少10只，用经抗血清中和后的病毒悬液，每只脑内接种0.03ml，同时腹腔接种0.5m1。至少观察21天。在观察期内至少有80%最初接种的小鼠存活，试验才有效。如果没有小鼠出现病毒感染，为符合要求。解剖所用在试验24小时后死亡或有患病体征的小鼠，直接观察期病理改变，并将有病变的相应的组织悬液通过脑内和颅腔接种另外至少5只15-20g小鼠，并观察21天，如果没有小鼠出现病毒感染，则符合要求。3.5.3.1.1.2乳鼠试验法取出生后24小时内的乳鼠至少10只，用经抗血清中和后的病毒悬液，脑内接种0.01ml,同时腹腔接种至少0.1m1。每天观察，至少14天。在观察内至少有80%最初接种的乳鼠存活，试验才有效。如果没有小鼠出现病毒感染，为符合要求。解剖所有在试验24小时后死亡或有患病体征的乳鼠，直接肉眼观察其病理改变，并取有病变的相应的组织和脑、脾制备成悬液通过脑内和腹腔接种另外至少5只出生后24小时内乳鼠，并每天观察至接种第14天，如果没有小鼠出现病毒感染，则符合要求。3.5.3.1.2细胞培养法3.5.3.1.2.1非血吸附检查用经抗血清中和后的病毒悬液，接种于生产用的同种的细胞。细胞至少接种6瓶，每瓶病毒悬液接种量不少于培养液总量的25%。于36±1°C培养，观察14天，必要时可更换细胞培养液，未见细胞病变（CPE）为阴性，符合要求。3.5.3.1.2.2血吸附病毒检查上述接种病毒的各个细胞于第6-8天后和第14天，取出2瓶进行血吸附病毒检查。用0.2%—0.5%鸡和豚鼠红细胞混合菌悬液覆盖于细胞表面，分别置于2—8°C,20—25°C,30分钟后显微镜下观察，未见血球吸附现象为阴性，符合要求。3.5.3.1.3鸡胚检查法在禽类组织或细胞中繁殖过的病毒种子需用鸡胚检查禽类病毒的污染。选用9—11日和5—7日龄两组SPF鸡胚，每组至少5只，分别于尿囊腔和卵黄囊接种经抗体血清中和后的病毒悬液，每胚0.5m1。孵育7日后，取尿囊液用豚鼠和鸡血细胞混合悬液做血球凝集试验应为阴性。被接种的鸡胚至少80%存活7天，试验有效。3.5.3.2生产用细胞外源因子检查3.5.321细胞直接观察每批生产用细胞应留取5%（或不少于500ml），细胞悬液不接种病毒，作为对照细胞加入与疫苗生产相同的细胞维持液，置于与疫苗生产相同的条件下培养，观察14天，在显微镜下观察是否有细胞病变（CPE）出现，