木犀草素对急性肺损伤的干预和保护作用,药学论文

木犀草素对急性肺损伤的干预和保护作用,药学论文急性肺损伤(acutelunginjury，ALI)是由多种原因引起的以肺泡毛细血管膜通透性增高为特征的肺损伤，是临床重症监护患者主要的死亡原因，病死率到达30%～50%［1－3］。ALI病因复杂，多种疾病可并发ALI，致病环节诸多，华而不实过度失控的炎性反响和促炎、抗炎反响失衡是该疾病的主要发病机制，炎性细胞因子和趋化因子间的复杂网络调控在启动、放大和促进病理进程中起到重大作用［4］，迄今仍无有效治疗ALI的方式方法和药物。木犀草属属于黄酮类化合物，因最初从木犀草科木犀草属草本植物木犀草的叶、茎、枝中分离出而得名，是一种天然色素组分，具有很高的生物活性，如抗炎、抗氧化、抗肿瘤、免疫调剂、抑菌等作用［5］。木犀草素的抗炎作用与抑制炎性介质的释放与核因子B(nuclearfactorB，NF-B)介导的基因表示出有关。本文旨在讨论木犀草素对ALI能否有干涉和保卫作用及其在体内的可能作用机制。1材料与方式方法1．1动物健康雄性ICＲ小鼠，体重18～22g，上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，许可证号码:SCXK(沪)2008-0016。饲养于室温、充分给水和食物。1．2试剂及药物脂多糖(LPS)(大肠杆菌O111:B4，Sigma公司，076K4020);木犀草素(Sigma公司);地塞米松磷酸钠注射液(金陵药业股份有限公司，080201);戊巴比妥钠(国药集团化学试剂有限公司，WS20060401);小鼠白介素-1(IL-1)ELISA试剂盒(A6071384)、IL-6ELISA试剂盒(A6071377)、肿瘤坏死因子-(TNF-)ELISA试剂盒(A6071379)均购自Ｒ＆D公司;Braford蛋白含量检测试剂盒、NF-Bp65Antibody、IB-Antibody、IB-(Phospho-ser32)Anti-body、内参一抗(-Actin)、内参一抗(LaminB)、辣根过氧化酶标记的二抗均购于南京凯基生物科技发展有限公司;其他试剂均为国产分析纯。1．3主要仪器动物肺功能分析系统(AniＲes2005型，北京贝兰博科技有限公司);酶标仪(680型，美国BIO-ＲAD公司);低温离心机(SH03014型，美国科俊仪器公司);超低温冰箱(1500型，日本SANYO公司)，Western电泳仪(164-5051型，美国Bio-Ｒad公司)，分光光度计(UV-2540型，日本SHIMADZ公司)。1．4方式方法1．4．1实验分组和模型的制备:96只小鼠随机平均分为两批，每批随机平均分为6组，分别为正常组、模型组、木犀草素低剂量组、木犀草素中剂量组、木犀草素高剂量组及地塞米松组，每组8只。木犀草素低、中、高剂量组于造模前4d分别灌胃给予25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg的木犀草素，正常组和模型组均灌胃给予一样体积的0．9%氯化钠溶液。小鼠腹腔注射1%的戊巴比妥钠(80mg/kg)后暴露气管，除正常组外，其余组气管内缓慢注入5%的LPS溶液(5mg/kg)，造成小鼠急性肺损伤，正常组以一样方式注入一样体积的0．9%氯化钠溶液。1．4．2肺功能相关指标的检测造模6h后，取一批小鼠腹腔注射1%的戊巴比妥钠(90mg/kg)深度麻醉，气管插管，将小鼠置于体描箱中。设置呼吸机的频率为90次/min，潮气量为5ml/kg，呼吸比为15∶10。通过对动物气道压力(Press)、肺容积变化(Volume)的测量，计算出呼吸流速(Flow)、平均吸气气道阻力(Ｒi)、呼气气道阻力(Ｒe)、肺动态顺应性(Cdyn)，经AniＲes2005软件进行分析，40min后取出小鼠。1．4．3支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞因子的测定:取另一批小鼠，造模3h后，结扎右肺，暴露气管并插管，向左肺注入4℃0．9%氯化钠溶液1ml进行支气管肺泡灌洗，重复3次。收集肺泡灌洗液并混匀，于4℃、1500r/min离心15min。收集上清液，分装后保存于－70℃超低温冰箱中，ELISA试剂盒检测检测IL-1、IL-6和TNF-的浓度。1．4．4肺组织病理检测:灌洗结束后，立即取右肺上叶以10%甲醛溶液固定，HE染色，制作常规石蜡病理切片。观察肺泡壁有无增厚、充血、炎性细胞浸润，间质有无炎症、水肿，肺泡有无坏死、出血等情况。1．4．5Westernblot测定肺组织中p65、IB-、pIB-的表示出:将100mg右肺组织置于0．5ml冰预冷裂解缓冲液中，用十字匀浆器匀浆，充分裂解。4℃，13000g，离心10min，保存上清液。Braford法测定上清液中总蛋白浓度后，进行SDS电泳。转膜、封闭并参加相应的一抗(NF-Bp65抗体，1∶400;IB-抗体，1∶200;pIB-抗体，1∶200)4℃孵育过夜。PBST漂洗后，将膜与HＲP结合的二抗(辣根过氧化酶标记抗体，1∶5000)室温下摇荡孵育1h。用PBST充分洗膜，然后将显影液加于PVDF膜上，室温放置1min。暗室中迅速曝光、显影、洗像。1．5统计学分析应用SPSS11．5统计软件，计量资料以xs表示，采用单因素方差分析，P＜0．05为差异有统计学意义。2结果2．1木犀草素对肺功能的影响造模6h后，6组小鼠的Ｒi、Ｒe随时间的延长呈增长趋势，华而不实模型组的增长百分比涨幅最大，正常组涨幅最小;6组小鼠的Cdyn随时间的延长呈下降趋势，华而不实模型组的下降百分比降幅最大，正常组降幅最小。木犀草素呈剂量依靠性的抑制Ｒi、Ｒe的增长和Cdyn的下降。地塞米松可以明显抑制Ｒi、Ｒe的增长和Cdyn的下降。见图1。2．2木犀草素对BALF中IL-1、IL-6和TNF-的影响与正常组相比，模型组的IL-1、IL-6和TNF-均明显增加(P＜0．01)。和模型组相比，地塞米松和木犀草素较明显的降低了IL-1、IL-6和TNF-等细胞因子的含量(均P＜0．01)，华而不实，木犀草素200mg/kg组作用效果更显着。见表1。2．3木犀草素对LPS诱导的小鼠ALI的保卫作用在解剖经过中发现，模型组肺部水肿严重，肺外表粗糙有出血点，且气管内有泡沫状分泌物流出，正常组无这些异常感觉和状态。组织病理切片可见，被感染的肺出现重度炎症，大量的中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等炎症细胞浸润肺部。肺组织构造发生改变，肺泡腔大面积消失，肺泡壁增厚。木犀草素200mg/kg组和地塞米松组病变较模型组有所改善，肺泡腔逐步清楚明晰，肺组织间炎性细胞浸润明显减轻。见图2。2．4木犀草素对肺组织中p65、IB-、pIB-的表示出的影响NFB信号通路调控了诸多炎性细胞因子基因的表示出，NFBp65和IB-、pIB-的Westernblot结果显示如此图3。造模3h后，和正常组相比，模型组中P65的表示出量显着提高;和模型组相比，木犀草素和地塞米松不同程度的降低了P65的表示出。进一步研究发现，ALI模型组中启动炎性反响的pIB-表示出量显着增加，IB-表示出量显着降低，而木犀草素和地塞米松却抑制了pIB-的表示出，促进了IB-的表示出。见图3。3讨论内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁外膜上的脂多糖(LPS)成分，可作为抗原激活机体的免疫应答，激活白细胞，诱使TNF、IL-1、IL-6等炎性因子的释放［6］。LPS直接作用于肺组织，毁坏肺泡引起出血、肺水肿，使坏死组织、炎性细胞堆积，促使肺泡巨噬细胞和炎性反响链的激活，导致肺内炎性反响［7］。近年来，为研究吸入性急性肺损伤，动物模型大多数是用LPS气道穿剌滴入造模。来源于革兰阴性菌外壁的LPS滴注小鼠后，BALF中细胞因子含量显着升高，毛细血管通透性增加和肺功能的变化等表示清楚ALI造模成功［8，9］。后两项指标的变化可间接表示清楚肺外表活性物质的代谢发生改变。王旭光等［10］采用ELISA检测木犀草素对PGE2生成的影响，结果发现木犀草素抑制LPS诱导的ＲAW264．7细胞(小鼠单核/巨噬细胞系)PGE2的生成，同时下调LPS诱导的ＲAW264．7细胞环氧合酶2(COX-2)及mPGES-1mＲNA和蛋白的表示出，这可能是木犀草素抗炎的机制之一。范文辉等［11，12］通过建立哮喘气道重塑模型，分别使用地塞米松及木犀草素进行干涉，观察支气管肺泡灌洗液中白细胞介素-5和干扰素水平的变化，得出结论木犀草素有显着的抗气道重塑作用。同时发现木犀草素抑制气道重塑的作用机制为抑制气道白细胞介质13受体2(IL-13Ｒ2)的表示出。张毅等［13］研究木犀草素对LPS诱导的ＲAW264．7细胞核因子B(NF-B)和COX-2表示出及NF-BDNA结合活性的影响，结果发现木犀草素能显着性抑制LPS诱导的ＲAW264．7细胞PGE2的生成，降低NF-B的DNA结合活性，下调LPS诱导的ＲAW264．7细胞COX-2mＲNA、NF-B和COX-2蛋白的表示出。这些研究结果提示，木犀草素可能对ALI具有保卫作用。本研究结果显示，木犀草素能明显抑制脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠的Ｒi、Ｒe增长和Cdyn降低，抑制BALF中IL-1、IL-6、TNF-的释放，减轻了肺部病变，抑制了NFBp65和pIB-的活化。这表示清楚木犀草素对LPS诱导的小鼠急性肺损伤具有保卫作用。TNF-和IL-1是ALI早期两个重要的前炎性因子［14］。在炎性反响初期，TNF-除能发动血循环中的PMN向炎症部位聚集外，还能发动骨髓白细胞进入血液循环，同时激活内皮细胞。内皮细胞受TNF-刺激时，释放E选素、L选择素、细胞间黏附分子1和血管黏附因子1等黏附因子，进一步诱导IL-1、IL-6、IL-8、CSF等细胞因子的分泌，共同介入炎性反响。当PMN被激活后，TNF-又能加强PMN的吞噬能力，促进PMN脱颗粒和释放溶酶体，加强PMN呼吸爆发，产生大量脂质代谢产物，毁坏毛细管内皮细胞的屏障功能，增加肺毛细血管的通透性，刺激内皮细胞释放大量组织因子，同时抑制纤溶活性，损害毛细血管的抗凝功能。这些促炎因子作为重要的信号因子，进一步启动、放大和延续全身或局部炎性反响，呈现级联反响，最终导致炎症失控。本研究表示清楚木犀草素能明显的降低了TNF-、IL-1和IL-6等细胞因子的含量，其中200mg/kg作用效果更显着。当前研究证实，与炎症和免疫反响关系密切的很多细胞因子、黏附分子基因启动部位均含有核因子NF-B位点。NF-B对细胞因子网络具有广泛的调控作用，能够调控多种细胞因子的基因转录。NF-B的主要形式为p50和p65组成的二聚体，p50是与DNA结合的部位，p65介入基因转录的超始调节，p65是NF-B的主要活性形式，并可促进p50与DNA结合，当p65与细胞质内抑制蛋白IB结合，可掩盖p50上核定位信号，仅有p65蛋白C末含有转录激活区域，能够直接启动基因的转录［15，16］。NF-B一般存在于细胞质中，同IB仅严密结合，却不发挥作用。在IL-1、TNF、LPS等炎性介质作用下，细胞质内IB激酶被激活，导致IB被磷酸化，进而由蛋白酶降解，使IB发生降解、磷酸化，多聚体上的IB分子的2个丝氨酸磷酸化、泛素化而降解，NF-B则从多聚体上释放，进入细胞核与DNA特定靶B部位结合，调控特定基因转录［17］。本研究提示木犀草素保卫急性肺损伤中降低了P65的表示出同时抑制了pIB-的表示出，同时促进了IB-的表示出。本研究讲明木犀草素对NFB信号通路的调控在急性肺损伤的保卫中起到了重要作用，能否和其他细胞信号通路有关当前尚不清楚，有待进一步研究。以下为参考文献1MatthayMA，UchidaT，FangX．Clinicalacutelunginjuryandacutere-spiratorydistresssyndrome．CurrTreatOptionsCardiovascMed，2002，4:139-149．2