再生组织培养的水稻第一在1968年报道

9/9建立一个高效率的农杆菌介导的转化的水稻制水稻(OｒyzasatｉvaL.）作物耐冷性研究团队，国家农业研究中心北海道地区，羊丘,丰平区，札幌，北海道062－8555，日本文章历史：ﻫ收到200８年10月23日

修改稿１月14日收到２009年ﻫ接受九年一月十五日ﻫ可在线2009年1月31日ﻫ关键词：水稻农杆菌介导的转化液体介质摘要：已开发的技术用于水稻转化,以满足功能性的要求基因组中,以使生产的转基因稻植物的有用的农业字符。然而，许多水稻品种都不能有效地通过农杆菌转化。我们已经成功通过合作培育水稻愈伤组织在饭建立一个高效转化系统ﻫ蘸有丰富Ｎ6orDKNｍｅdiains一个grobactｅｒiｕmon三滤论文tｅａｄo固融合媒体.水稻愈伤组织浸入农杆菌悬浮液（EＨA1０1，农杆菌浓度OD６０0=0。０４）共培养的3张滤纸(直径９ｃm)蘸有5。5毫升N6orDKN液体共培养培养基中添加２，4－二(2毫克/升)，脯氨酸(10mM）的酪蛋白

ð水解产物（30０毫克/升）,蔗糖(30克/Ｌ）,葡萄糖(５克/升），－半胱氨酸（１０0mg/L时）和乙酰丁香酮农杆菌介导的转化液体介质L（15毫克/升）在258℃于黑暗中３天。同的愈伤组织共转化效率进行比较（15毫克／升）在258℃于黑暗中３天。同的愈伤组织共转化效率进行比较cultivａｔeｄｏn固体介质,转换效率提高了约5倍,通过使用过滤器纸的方法很多品种的大米，包括那些以前产生了许多穷人转化率。2０09爱思唯尔爱尔兰有限公司保留所有权利。1介绍在1968年第一次报道使用再生组织培养的水稻[1〜4],而这种植物物种现在被广泛使用转基因实验。DNＡ通过电穿孔,原生质体转化,根癌农杆菌介导的转化转移到水稻植株［5－7］。最近,已通过几种方法，提高农杆菌介导的水稻转化效率，以产生一个IUＭ—介导转化所需的Ｔ-DNA的转化子，插入和FOX库以及基因打靶技术的研究[８,9]。它已被认为具有高度发展的高效,大规模改造系统，以处理更多超过103个转化,将是一个基因目标成功实现的前提条件［９].日本的水稻品种Ｎiｐponbaｒe已被广泛用于转基因实验，由于其良好的再生能力,从愈伤组织中高效率的介导根癌农杆菌转变。以标准的水稻转化方式,用于产生大量的转化，但是,只有有限的几个品种,这表明实验水稻转化的参数没有经过充分的优化．经常使用细菌分离出抗生素耐药性和抗除草剂基因，选择转化的植物组织，由于在高效率选择转基因细胞。新霉素磷酸转移酶,潮霉素磷酸转移酶和草丁膦从细菌中分离出的乙酰基转移酶经常用于选择转化植物组织［10，11]。他们的可能存在于粮食作物，但是,这引得全球公众关注.在这些公众关注的问题中，使用分离自细菌的抗生素或除草剂抗性的标记物的转基因生物(GMOs)可以避免的。一些新的系统，利用原生植物基因在最近几年得到实验。这些包括邻基苯甲酸合成酶α-亚基基因正选择系统，如苄基腺嘌呤N—３-葡糖苷酸，甘露糖和亚硝酸盐还原酶基因［10〜17]。然而，使用这些的阳性筛选系统选择转化细胞,相比使用的抗生素抗性基因效率较低。这是一个高效多产的转基因植物在实际应用中的障碍.为了优化根癌农杆菌介导的水稻转化的效率，许多研究人员已经尝试了不同的媒介和不同条件的接种，介导培养农杆菌.一些研究人员报告说,在根据通过使用了含还原剂如抗坏血酸或L—半胱氨酸共培养介质，组织坏死(褐变)被减少，转化的频率增加.[18〜2０］。褐变被认为是农杆菌过量增殖引起的，从而降低了频率的转变。因此，如果扩散细菌可以被控制,以最大限度地提高细菌感染和T-DNA整合到植物基因组,并尽量减少组织坏死，它应该有可能显著增加转化期间共培养频率.2．0材料与方法２．1水稻转化过程从遗传资源中心获得的水稻种子，,日本国立农业生物科学研究所。农杆菌两种文化的基础上对水稻的转化条件[８，16]。成熟的种子的日本晴，Sirｙo３08北海,Ｄuｌar和越光1０%次氯酸钠溶液中灭菌为30分钟，然后留在1％的过氧化氢溶液3小时。他们再次进行灭菌２0分钟，在10％的次氯酸钠.三个用无菌水冲洗后,他们被安置在坚实的N6介质[2１］，补充了2，4—D（２毫克／升），脯氨酸（10毫摩尔），酪蛋白水解物（3００毫克／升),蔗糖(30克/升）,和介尔雷特(3克／升)Ｎ6D介质)。种子越光被转移到DKN介质［22］含2，4-D(2毫克／升）,脯氨酸（１0毫摩尔)的补充,酪蛋白水解物（3０0毫克／升），蔗糖(３０克/升）,和介尔雷特（3克/升)（DＫND介质）,1周后上N6媒体文化。培养物在２8使用16小时光照(５０毫摩尔米２秒１）和图8C8小时黑暗周期。3周后,小,大力除以直径2-4MMＩＮ愈伤组织进行传代培养上的相同的新鲜培养基ｆoｒ3天，然后用于转化的愈伤组织.甲plaｓｔｉcpｅtｒi培养皿的直径9厘米的用于诱导和

继代培养的愈伤组织,和陪替氏培养皿密封surgicaｌtaｐe（外科胶带-21Ｎ，ニチバン株式会社日本。农杆菌菌株EＨA101窝藏pＣAMBIＡ１３01(包含菊花/CAＭBＩＡ/ｈｏme．html的ＡB)培养培养基［２３］含硫酸卡那霉素（50毫克/升)，潮霉素（50毫克/升)和琼脂（１5克/升）(琼脂，粉末，和光有限公司,日本)3天在288Ｃ在黑暗中。收集和悬浮bａｃteｒiawerｅ［7]在AＡM培养基中含有乙酰丁香酮(0,１,15和40毫克/升）。农杆菌感染,细菌的密度调节(OD６00=０.02,０.4和0。2）和水稻愈伤组织浸在细菌悬浮液２分钟.除去过量的细菌印迹的的愈伤组织ｏnfilter纸.的愈伤组织（的２—4mmｉｎ直径)分别为转移到一个单一的灭菌的滤纸(直径9CMIＮ号2,ＡDＶAＮTEC，日本，可比至Whatman等级２号过滤器纸）放置在9厘米直径的陪替氏培养皿含有约30毫升固体（4克/Ｌ介尔雷特）Ｎ6D培养基(日本晴,北海Siryo308杜拉尔）或DＫND介质(粳米)或三消毒过滤器含有５-６毫升液体N6D或DKND介质。N６D和DＫＮD媒体补充与葡萄糖(５克／L)，L-半胱氨酸(10０毫克／升）,和乙酰丁香酮（０－4０毫克/升）。密封板用封口膜（佩希内PｌasticＰackagｉｎgＣomｐany，USA），防止蒸发的介质,并进行3天的共培养在黑暗中在２5或288C.愈伤组织，然后在无菌洗涤两次洗涤一次水，然后在无菌水中含有Ｍｅrｏpｅｎ(大日本住友制药,日本）（50毫克/升)以除去农杆菌介导。共培养愈伤组织滤纸吸干和镀上N６Ｄ或ＤKND介质补充有Mｅropeｎ（25毫克/升）,潮霉素B（50毫克／升)和介尔雷特（３克/升)。该板用医用胶带密封，并使用一个1６小时的温育在288C光（50mmｏlm?2选1）,和8小时黑暗周期。增殖的潮霉素抗性（嗯抗性）的愈伤组织转移到相同的新鲜培养基.1周后，嗯抗性愈伤组织转移MS(（日本晴，北海Sｉｒｙｏ308和Dular）[24］或ＤKN（粳米）再生培养基中含有萘基乙酸（0．1毫克/升）,激动素(２。５毫克／升）,酪蛋白水解产物(2克/升)，sucｒｏｓeＬ）ａndgeｌriｔe(４克/升）,并用石蜡膜密封，以防止蒸发的介质。使用1６小时，将培养物孵育２８8C光（50毫米ＯLＭ2选１)，和8小时黑暗周期。（30克/升),山梨糖醇(２0克/升）,Meｒopen（２5毫克／升)，潮霉素（50毫克/再生芽转移到无激素的MS培养基含有蔗糖（30克/升），Meropeｎ（２５毫克/升）和介尔雷特(３克/升),并培养在２８8C灌封。所有的媒体进行了调整，共培养介质pH值至5.7，而不并高压灭菌１5分钟，在1218Ｃ在15psi。共同培养媒体调节pH至5.4，和在15psｉ下高压灭菌1５分钟，在1218C。Ｌ-半胱氨酸，硫酸卡那霉素,潮霉素B，乙酰丁香酮和Meropen过滤灭菌。２。2。变换的频率和测量再生能力强经过7天​​Ｎ6Hy介质，每愈伤组织转移到X—GLUC解决方案［25］.计算的转化效率作为细胞灶,示出GUS染色的平均数目(GUＳ+）在每个愈伤组织。此外，２周后的培养N6Hｙ介质中，转化效率表示为ＨM－抗性和GUS阳性愈伤组织数/初始数愈伤组织接种？１00％。再生植物的叶子嗯抗性的愈伤组织转移到X—GLUC溶液。再生效率计算作为再生数HM-耐药和耐HＭ—ＧUS阳性植株数/

愈伤组织接种？100%。每个实验至少重复三次。2。３.农杆菌介导的愈伤组织共培养后的数量共培养后的愈伤组织，３０件(约3毫米)在１０ml的无菌水冲洗,然后让1mL稀释１０-倍。10微升,然后接种到ＬB培养基中[2６]含有硫酸卡那霉素(５0毫克/升）,潮霉素B(50毫克/升）和琼脂(15克/升）。将板孵育2天，在28℃和单独的菌落进行计数。对于计数的初始数目农杆菌介导的细胞，感染后的愈伤组织,30件（约3毫米），立即在10毫升无菌水冲洗，并然后让１mＬ稀释10倍。取１0μl接种的ＬB培养基上。每个值是三个独立的平均值实验２。4。Ｓoutｈｅrn杂交(印迹杂交)分离总ＤNA，从嗯抗性和GUS阳性植物改良的CTAB法［27］。约１0毫克的用SaｃⅠ消化的DNＡ,并进行电泳0.8％琼脂糖凝胶.然后将ＤＮＡ转移到尼龙膜(使用Hybｏnd－N＋，Ameｒｓｈam公司有限公司，ＮJ,USA)。PC引物的GＵS基因的扩增的时间分别为５０—ｇtatｃaｃcgtｔtｇtgｔgaacaacｇ3０和50-gtａｔｃggtｇｔgagcgtｃgｃａｇaaｃ-３０。扩增条件下用5分钟的一个周期的随后的３5个在9４８C周期的在94℃,3０秒，２0秒，在56℃和在72℃的１分钟和最后一个周期的5分钟，７2８Ｃ。扩增的片段（９７9ｂp）的纯化，使用WiｚａrdSＶ凝胶和PCR清理系统(Promｅgａ,UＳA）和３２P-标记的随机引物,并用作探针Ｓouthernblot分析。所有Souｔheｒn杂交分析和杂交进行利用快速HYB缓冲器根据制造商的说明(Ａmersham公司有限公司，NＪ,USA）。在６0℃进行杂交在快速ＨYB缓冲液加变性探针。洗涤液在60℃,并进行最后的洗涤液进行0．2?ＳSC／0.1％SDS.3。结果与讨论ﻫ水稻种子，因为它用的过氧化氢溶液处理在一些品种，这可能是由于过氧化氢处理，打破了愈伤组织的诱导频率增加休眠的种子（数据未示出)。过氧化氢促进种子萌发的谷类植物和几种机制已经被提出了它的作用[28].对于该处理,水稻壳小心地除去，以避免受伤的果皮.当水稻愈伤组织共培养在固体上的单张纸岐等人的方法，所述的媒体。(图1A－C）[8］，的转换效率是高的时潮霉素Ｂ磷酸转移酶基因作为可选择标记。ﻫ然而，褐变仍观察到的表面上的一些愈伤组织在这些条件下（图1B）。这些观察结果表明:愈伤组织损坏接种农杆菌介导，导致转化效率下降.因此，我们

试图找到抑制细胞增殖的条件，接种时期，以农杆菌共培养期间减少损坏愈伤组织。细菌不生长良好过度的干板大量的胶凝剂，这表明的程度干燥的表面上的固体培养基影响细菌增长。然而，这是很难控制的电平上的干燥表面上的固体培养基。纸桥和纸灯芯在培养基中使用的细胞或组织的替代方法的支持增长.我们认为农杆菌介导的增殖通过以下来控制介质的量调节在纸张上过滤.三层过滤器(直径9厘米,第2号）,能够约5.5毫升的介质。水稻愈伤组织后农杆菌悬浮液中浸渍约30条的愈伤组织(２-直径４毫米）放置在一个塑料为９厘米的陪替氏培养皿直径含有固体N６Ｄ共同培养基中（图１A）或三块润湿滤纸用5-6毫升液体N6共培养介质（图１Ｄ）.过滤纸的表面的蘸用5ｍl介质是干燥的，而过滤纸蘸有6毫升的培养基中是湿的。愈伤组织的滤纸含有5ｍL的介质是无水的,而过滤器文件,其中载有6毫升培养基中的愈伤组织上是湿的.共培养后,30个愈伤组织块（约３毫米)冲洗在10毫升无菌水中，并稀释水和镀的ＬB培养基上进行量化农杆菌细胞的数目（表1）。0D共培养的农杆菌介导细胞的初始数目是32？11。在固体培养基上的生长相比条件下,农杆菌介导没有增长以及在液体介质中条件下，和褐变的共培养的愈伤组织,没有检测到（图1E）。因此，我们成功地控制扩散农杆菌介导抑制组织坏死.转化效率通常表示为数量ＨM-抗性和GUS阳性愈伤组织的外植体数/初始

接种。然而,我们计算的数字显示灶后7天的增长对N６Ｈy介质作为在每个愈伤组织的GＵＳ＋转化效率的研究。当水稻愈伤组织共培养三块润湿滤纸用Ｎ6液体共培养介质中，转化效率的研究是非常高的每个条件（表１和表２），并且它是难以检测数数有多少转化效率差异嗯抗性和ＧUS阳性的愈伤组织由于高转化效率。此外，稳定的转化体的数目是远远小于实际的稳定转化的数事件,因为两个以上的独立HM—抗性愈伤组织经常产生的愈伤组织（图１C和F).Hieｉ等人。报告说，以上７个独立的转化通过划分从一个单一的未成熟胚产生胚胎成多达3０个，在水稻[2９]。岐等。报道骨痂生长和GFP信号检测第６天来自稳定转化的转基因水稻［30］.因此，共培养7天，增长N6Ｈy介质,每个愈伤组织培养在X-ＧLUC溶液和在每个愈伤组织数灶示出GＵS染色活性(GＵＳ＋)进行计数。小型球状GUＳ阳性愈伤组织出现从表面的愈伤组织,并增长（图1C和F）在N6Hy介质。转化效率的改善显着（>2倍)一个９厘米的塑料陪替氏培养皿中含有三块滤纸上蘸有5．5毫升液体培养基中(表１）,而5。0和6．0毫升的媒体条件下使用无明显差异使用固体介质。在表1所示的结果表明有一个最优的所需浓度的农杆菌转型。如果细菌浓度过低时，转换减少因细菌感染的效率，减少水稻细胞.另一方面,过高的细菌浓度降低的整体转化效率;虽然感染的数量增加时，增加细菌对细胞造成损害。Ｈｏwe等人的一项研究表明，胚胎放置在四个无菌过滤器,放置在一个1０0毫米之内？20毫米共培养的培养基中,用４.2毫升饱和的培养皿高粱的农杆菌介导的转化,但是,他们没有讨论滤纸和量的影响液体介质效率的转变［31]。参数接种与农杆菌共培养的,包括温度，根癌农杆菌浓度，Lｃysteine浓度和浓度的乙酰丁香酮，在媒体进行了分析.坚实的合作种植水稻愈伤组织的最佳条件介质是25℃的温度下与根癌农杆菌ＯD＝0。2和２00mM浓度的乙酰丁香酮［9］.我们首先研究了Ｌ－半胱氨酸的浓度（0—100毫克/升)与农杆菌浓度OＤ600=0。０2和乙酰丁香酮（1５毫克/升）。的转换效率略提高L—半胱氨酸时,被添加到液体介质中的（表2）,但差异无统计学意义。共同培养的外植体的存在下用农杆菌乙酰丁香酮,vｉｒ基因诱导剂，已成为一个例行演习改造顽固的作物，如水稻,玉米，大麦的和小麦[32]。Terada等人。报告说，20０毫米乙酰丁香酮似乎是最好的水稻遗传转化的浓度.何时ﻫ乙酰丁香酮被省略，转化效率低（表2)。有一个统计上不显着的区别76ｍM的浓度(15毫克/升）的转化效率和200mM(４0毫克/升）。Hiei等人。报道称的转换效率非常低时，乙酰丁香酮被省略［33］。可能会对水稻细胞能够产生一定程度的信号分子诱导ｖｉr基因的表达［34］。我们认为信号分子没有愈伤组织培养基中扩散，因为进行共培养三块滤纸蘸有只５.5毫升的液体培养基中的愈伤组织在我们的文化系统,所以可能具有足够的电平的信号分子的浓度为０和76毫米（15毫克/升）。然后,我们检查农杆菌的温度和浓度与L—半胱氨酸(0．02〜0。2ＯD60０）（100毫克/升)和乙酰丁香酮(15mg/Ｌ的＝７6毫摩尔）。共培养的最佳条件为被认为是25℃的温度下和农杆菌浓度OＤ600=0。04或0.2(表2)。有一个统计上不显着的差异之间的转换浓度OD６00=０．04的效率，并OD600＝0。2（t-检验中，a=0。05)，在258C。在２８图8C，变换效率使用农杆菌的浓度OD6００＝0。04显着高于在较高的获得农杆菌浓度OD60０=０。2（t-检验中，a＝0。0５），这可能是因为过量的农杆菌介导损坏愈伤组织.潮霉素抗性和GUＳ阳性的一些

日本晴证实了植物基因组印迹分析具有ＧUS基因（图2）。从随机的总DＮA

选择嗯抗性和GUS阳性的植株被消化的ＳacＩ和允许与GUS基因的探针杂交。“pCAMBIＡ13０1在多克隆位点有一个SacＩ位点，泳道2，第3和４有两个以上的杂交条带，这意味着的GＵS基因的多拷贝整合。结果表明进行的转基因植物,转基因的多个拷贝。然后,我们检查时转化率和再生嗯抗性愈伤组织的频率,使用不同的品种(表3及图3）:越光，领先的品种,在日本,北海Siryo308，在北海道,最新的品种和Dulａｒ，一个流行的不同的籼稻。变换的频率提高每一个品种，尤其是，在北海Ｓiryo3０8和Duｌar,表现为低频率的变换,固体共培养媒体。几个倍的转换效率在我们的文化系统实现.有趣的是，我们的系统增强有效选择转化的愈伤组织。转化的愈伤组织早在14天观察到转移到Ｎ6Ｈy介质后（图3A)。布朗宁和随后的细胞死亡已报告频繁的现象在农杆菌介导的相互作用与单子叶植物。，杜拉尔也具有显着的褐变固体培养基上（图3B）。然而,褐变程度杜拉尔愈伤组织在我们的系统的效率降低转化显着增加（表3及图３A）.独立ＨM—抗性愈伤组织转移到再生介质和再生植株的叶片的GUＳ组织化学溶液中浸泡。再生效率计算的数目的再生嗯抗性和GUS阳性植物/HM-抗性愈伤组织接种数量?１0０%。再生能力近90%，在所有品种（表3)。据报道Ｔeradａ等人,以高效率的大规模转换系统,处理超过1０3个转化,建立基因打靶，和转化效率的研究为30－80％在他们的系统。在我们的系统的效率的愈伤组织的转化几乎是１0０％和再生效率是所有品种的近90％。结果表明，四个品种的整体转化效率非常高的。因此，我们已经使用T－DＮA插入库，ＦOX库和基因打靶技术成功地在许多水稻品种建立一种高度高效转化体系的.参考文献：[1］S。田村，拍摄形成的愈伤组织源自米胚，PROC。JPN。ACAＤ.ﻫ4４（196８）544—548.

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