量子点免疫层析检测技术

精品文档.量子点免疫层析检测技术方兴未艾免疫层析技术是一种快速、简便、灵敏、直观、价格低廉、可真正实现现场检测的检测方法。具有很多气相色谱、高效液相色谱、气质联用色谱、液质联用色谱、毛细管电泳等仪器检测方法以及其他传统方法无法企及的优点。在检测领域中处于特殊重要的地位，同时也是传统检测和仪器检测的良好补充。尤其在经济高速发展，生活水平提高的今天，人类重大疾病，环境污染，食品安全等问题日益受到极大的关注，让免疫层析检测技术更具有巨大的潜力和蓬勃的生命力。目前，免疫层析产品主要为胶体金免疫层析试纸条，其最早应用于医学检验，在早孕检测中的应用取得了极大的成功，随后在各个领域迅速渗透漫延，其在毒品检测、环境检测、以及食品安全检测领域得到了迅速的发展，但是又出现新的问题，在很多方面，尤其是食品安全检测领域，有些农兽药残留限度极度苛刻，甚至要求0.1ng/ml的检测限度，同时食品类物质如肉类、禽类、果蔬、谷物等成分复杂，前处理难度也很大，造成胶体金免疫层析检测灵敏度无法胜任。除了进一步提高前处理方法以外，寻求高灵敏度的免疫层析方法也显得尤为重要。量子点是近20年来发展起来的半导体纳米晶材料，因为它的优良特性，受到了很大的关注，并且已经显示出一定的潜力，近几年来从细胞标记等应用已逐渐开始向多个领域的检测与诊断方向渗透。量子点特性量子点(简称QDs,又称半导体纳米粒子)是由Ⅱ～Ⅵ族或Ⅲ～V族元素组成的，半径小于或接近于激光玻尔半径，能够接受激发光产生荧光的一类半导体纳米颗粒，其中研究较多的主要是CdX(x=S、Se、Te)，直径约为2nm-6nm。量子点由于存在显著的量子尺寸效应和表面效应，从而使它具有常规材料所不具备的光吸收特性，使其应用领域越来越广泛，特别是其在免疫生物学和临床检验学等研究中的潜在的应用价值，已引起了广大科学工作者的极大关注，发光量子点作为荧光试剂探针标记生物大分子，正是近年来迅速发展的纳米材料在生物分析领域的重要应用之一。与普通的荧光染料相比较，量子点具有以下特点：(1)有机染料荧光分子激光谱带较窄，每一种荧光分子必须用合适能量的光来激发，而且产生的荧光峰较宽，不对称，有些拖尾。这给区分不同的探针分子带来困难，很难利用有机染料分子同时检测多种组分。量子点由于量子限域效应使其激发波长的范围很宽，可以被波长短于发射光的光(一般短10nm以上)激发，并产生窄(半波宽约13nm)而对称的发射光谱，从而避免了相邻探测通道的串扰。(2)量子点具有“调色”功能，不同粒径大小的量子点具有不同的颜色，激发量子点的激发波长范围很宽，且连续分布，所以可以用同一波长的光激发不同大小的量子点而获得多种颜色标记，是一类理想的荧光探针。(3)量子点的荧光强度强，稳定性好，抗漂白能力强，Chan和Nie通过实验证明ZnS包覆的CdSe比罗丹明6G分子要亮20倍和稳定100-200倍，可以经受多次激发，且标记后对生物大分子的生理活性影响很小，因此为研究生物大分子之间的长期作用提供了可能。(4)生物相容性好，尤其是经过各种化学修饰之后，可以进行特异性连接，细胞毒性低，对生物体危害小，可进行生物活体标记和检测，而传统的有机荧光染料一般毒性较大，生物相容性差。(5)荧光寿命长，典型的有机荧光染料的荧光寿命仅为几纳秒(ns)，这与很多样本的自发荧光衰减的时间相当。而量子点的荧光寿命可持续长达数十纳秒(20ns-50ns)，这使得当光激发数纳秒以后，大多数的自发荧光背景已经衰减，而量子点荧光仍然存在，此时即可获得无背景干扰的荧光信号。图1.量子点二、量子点的合成方法目前合成量子点的方法主要有两种，一种是在有机体系中合成，即用金属有机化合物在具有较强配位能力的有机溶剂中制备；另一种是在水溶液中直接合成。有机相合成法量子点最早采用胶体化学方法在有机体系中制备的方法，将金属和有机化合物混合在有配位性质的有机溶剂中，在一定的温度条件下就能生长出纳米晶体。这类方法制备的量子点分散性、稳定性都较好，不容易聚沉，表面修饰容易。早期合成的量子点往往存在量子点粒径分布较广、荧光产率偏低等缺点。1993年，Bawendi及其同事用二甲基镉和硒的三辛基膦（TOP）配合物作为前驱体，将其依次注入剧烈搅拌的三辛基氧化膦（TOPO）溶液中，合成了高荧光产率的CdSe量子点，这种方法合成的量子点结晶性好、尺寸单分散、量子产率约为10%。这种方法较以前来说是一种突破，但当量子点制成水溶性时，其荧光产率会大大下图2.1996年，Hines成功合成了ZnS包覆的CdSe量子点降。后来人们发现，当把ZnS或CdS包覆在CdSe纳米晶体表面后，荧光产率会大大提高。1996年，Hines等就用二甲基锌和六甲基二硅硫烷作为量子点壳层前驱体制备了CdSe/ZnS核壳式量子点，其量子荧光产率在室温可达50%。但上述合成方法均采用(CH3)2Cd作为原料，而(CH3)2Cd的毒性很大，具有易燃、昂贵、室温下不稳定等特性；且当(CH3)2Cd注入热的TOPO后，可能产生金属沉淀，这些缺点限制了上述方法的推广使用。2001年Peng等对以前的方法进行了改进，用毒性低安全友好的CdO代替原来有机相法中的剧毒原料二甲基镉，在温和的条件下制备了CdS包覆的CdSe量子点，并且其荧光量子产率可以达到50%以上。虽然有机相法合成的量子点有尺寸单分散，荧光量子产率高等优点，但是因为油性量子点与生物环境不相容，并且制备方法不环保。如果要用在生物分析领域需要将油相量子点转相为水溶性量子点。油相量子点经过水溶性基团饰转移到水相中后，其量子产率会降低，因而在生物分析领域的应用甚少。2.水相合成法图3图3.1998年Gao等用TGA作稳定剂，制备出水溶性CdTe量子点三、量子点在免疫层析技术中的应用量子点免疫层析技术利用量子点荧光探针做为标记物，不仅充分体现了免疫层析技术的简便，快速，特异性强的优点，而且展示了量子点的高灵敏度，以及它的荧光特性，显示出巨大的发展潜力和广阔的应用前景。目前深圳市金准生物医学工程有限公司开发的量子点免疫荧光层析定量测试平台----干式荧光免疫分析仪（KF-Q001-A）是国内首创。在此平台上研发的降钙素原（PCT）定量测定试剂盒——量子点（QD）免疫荧光层析法也是国内唯一一家成功实现产业化并取得注册证号(粤械注准20152400386)的量子点诊断试剂。随着发展和应用趋势，越来越多的生物诊断试剂公司加入了量子点这个新兴行业。与此同时，量子点免疫分析技术也在不断地发展与改进，就其发展趋势来看，主要有以下几个方面：1.优化量子点荧光探针的制备，得到荧光强度高的QDs，检测信号会随着QDs的荧光增强而大大提高。单独的量子点颗粒容易受到杂质和晶格缺陷的影响，荧光量子产率很低，目前广泛应用的是以QDs为核心，用另一种半导体材料包覆形成核壳结构后，如CdTe/ZnS，可将量子产率提高到约50％甚至更高，并在消光系数上有数倍的增加，因而有很强的荧光发射,可大大提高检测灵敏度，有利于信号的检测。2.实现定量检测。至今已有部分实验室或公司研制出QDs荧光定量的仪器，从而可以定量检测出待测物的浓度，这将使量子点免疫层析技术得到更广泛的应用，打破了传统的胶体金免疫层析技术不能定量的限制。3.量子点的多色检测。QDs其中一个优点就是具有可精确调谐的发射波长。可以通过调整粒子尺寸来得到不同发射的荧光QDs，无需改变粒子的组成和表面性质。使得量子点可以用于多种组分的多色标记，实现多组份的同时检测。这将比传统的胶体金免疫层析技术的多元检测体现出更大的优势，减少了不同抗体间的交叉反应，特异性更强，相互间不会产生干扰。总而言之，对免疫层析分析技术的要求是