云南大学微生物课件,期末考试完整版

Chapter6MicrobialGrowthandGrowthControlMicrobialGrowth微生物生长→代谢的结果。当同化﹥异化作用，细胞物质量↑，个体重量↑和体积↑，就是生长个体生长→个体繁殖→群体生长；群体生长＝个体生长＋个体繁殖MeasurementofMicrobialGrowthandReproductionMeasurementofCellMassMeasurementofCellNumberMeasurementofMicrobialGrowthandReproductionMeasurementofCellMass细胞干重法总氮量测定法DNA含量测定法代谢活性法MeasurementofMicrobialGrowthandReproductionMeasurementofCellNumber直接测数法或总菌数测定法比浊法Turbidity稀释平板计数法

血球计数板示意图Turbidity

Theturbidityofaliquidmediumincreasesasbacteriamultiply&canbemeasuredonaspectrophotometer.Theamountoflightreachingthedetectorisinverselyproportionaltothenumberofbacteriaunderstandardizedconditions.TurbidityTheabsorbencyofthesample(opticaldensity)isdependentonthenumberofcells,theirsize&shape,&isusedtoplotbacterialgrowth.Ifabsorbencyreadingsarematchedwithadirectcountofthesameculture,itsproteincontentordrymass,thecorrelationcanbeusedinafutureestimateofbacterialnumbersorbiomassbaseddirectlyonturbiditymeasurements.Turbidity稀释平板菌落计数法

3）Viablecountusingserialdilutionsofthesample液体稀释法（或然率法）

将样品作10倍系列稀释，接种液体试管，培养后记录出现生长的试管数，查表并计算。例：某一细菌在稀释法中的生长情况如下稀释度-4-5-6-7-8

重复数55555

生长管数55410

数量指标“541”，查统计分配表17

原菌液中的活菌数=1.7×106个/毫升

稀释度

lO-3

10-4

10-5

lO-6

10-7

10-重复数

5

5

5

5

5

5出现生长的管数

5

5

5

4

1

0最大或然值法（mostpossiblenumber,MPN法，或称稀释法）

MPN法是一种采用数学理论推算这是一种应用概率理论来估算细菌浓度的方法，适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群。其特点是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度。本法特别适合于测定土壤微生物中的特定生理群（如氨化、硝化、纤维素分解、固氮、硫化和反硫化细菌等）的数量和检测污水、牛奶及其他食品中特殊微生物类群（如大肠菌群）的数量。平板菌落计数和最大或然值法应用实例东湖细菌生理群间的相关性和优势生理群的分析（河北大学学报(自然科学版)Vol.18(3):265-269）研究了武汉东湖异养菌及7种细菌生理类群(产淀粉酶细菌、产蛋白酶细菌、产脂肪酶细菌、有机磷细菌、无机磷细菌、硝化细菌及反硝化细菌间的相关性异养菌、产蛋白酶细菌、产脂肪酶细菌、产淀粉酶细菌及磷细菌采用倾注平板计数法硝化细菌、反硝化细菌采用最大可能计数法平板菌落计数和最大或然值法应用实例杭州西湖水体中微生物生理群生态分布的初步研究（生态学报Vol.19(3):435-440)异养性细菌、无机磷分解菌用稀释涂平板法计数好气性纤维素分解菌、氨氧化细菌、硝酸氧化细菌、硝酸还原菌、脱氮菌、有机磷分解菌MPN法培养计数太湖反硝化、硝化、亚硝化及氨化细菌分布及其作用（应用与环境生物学报Vol.5(2):190~194)用最大可能数法测定水样中硝化、亚硝化、氨化及反硝化细菌的数量平板菌落计数和最大或然值法应用实例秸秆还田对植烟土壤中微生物结构和数量的影响沙涛程立忠王国华赵之伟(中国烟草科学2000,(3):40—42)测定了施加小麦秆糠、玉米秆糠后植烟土壤中细菌、霉菌、放线菌、解磷菌、解钾菌、硝化细菌和反硝化细菌7类菌群的分布及数量;应用生物统计分析法比较了施加不同秸秆对烤烟试验田土壤微生物结构和数量的影响细菌、霉菌、放线菌、解磷菌和解钾菌采用平板稀释分离法硝化细菌和反硝化细菌用最或然数(MPN)法进行计数方法应用涂片染色法

血球计数板法

比浊法可同时计数不同类型的微生物数量，常用于牛奶、土壤中的细菌计数

可用于不同类型微生物的计数

微生物学分析，肉汤培养物或水悬浮液中的细菌数估计平皿菌落计数法液体稀释法

薄膜过滤计数法食品、水、土壤、医学、卫生以及培养物中的细菌计数

因某种原因而不能用琼脂平皿活菌计数时被采用，如牛奶等

适用于量大而且含菌数很低的材料，如空气、水等定氮法测DNA法测定细胞干重法生理指标测定法

主要用于代谢研究，适于细胞浓度高的样品

同上

用于调查研究，适用于细胞浓度高的材料

微生物学分析研究细菌生长测定法

MicrobialGrowth细胞生长的标志：外观上是细胞由小长大包括：染色体（或DNA）的复制、核糖体的生物合成、线粒体的生物合成、细胞壁的生物合成等MicrobialGrowth

IndividualGrowthandSynchronousGrowthofMicroorganismsSynchronousGrowth同步生长使培养基中细菌同时分裂，处于相同的生长阶段（处于分裂步调一致的生长状态）叫同步生长。环境条件诱导法机械筛选法其它方法机械法

离心方法过滤分离法硝酸纤维素滤膜法优点：不打乱细胞原有的代谢环境条件控制法温度调节法培养基成分控制控制限制因子的量或添加某些抑制剂（氯霉素抑制菌体蛋白合成）其它方法

用交替见光和黑暗处理光合细菌缺点：打乱细胞原有的正常代谢。GrowthofMicrobialPopulation

微生物群体生长规律群体生长：包含了个体生长和繁殖微生物生长的表示通常以细胞重量或细胞数倍增所需要的时间为表征

细菌群体形成的过程（图中的数字为小时）

酵母群体形成的过程

各类微生物倍增时间出现的频度

TypicalGrowthCurveTypicalGrowthCurveDeterminationofBacterialGrowthCurve

细菌生长曲线的测定分批培养（单批培养，密闭培养）曲线的测定：液体将少量细菌接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，定时取样测定细胞密度，以活细胞数的对数对培养时间所作出的曲线称为生长曲线。微生物的典型生长曲线：延滞期、指数期、稳定期、衰亡期微生物的非典型生长曲线：延滞期、快速生长期、生长衰退期LagphaseWhenanorganismisinoculatedintoafreshmedium,itneedstoadapttothenewnutrientsavailable,synthesizeRNA,proteinandfinallyreplicateitsDNAbeforestartingdivision.Theseprocessestaketimeandthereisnonetincreaseincellnumbers,thusalagphaseisobserved.LagphaseOccursimmediatelyafterinoculationandisaperiodofadaptationforthecellstotheirnewenvironmentNewenzymesaresynthesized,synthesisofotherenzymesisrepressedIntracellularmachineryadaptstothenewconditionsMaybeaslightincreaseincellmassandvolume,butnoincreaseincellnumberThelagphasecanbeprolongedbylowinoculumvolume,poorinoculumcondition(high%ofdeadcells),ageofinoculum,nutrient-poormediumLagphase调整期、适应期、停滞期细胞生理特点：分裂迟缓、菌体大、DNA含量高代谢活跃出现的原因：为了调整代谢（需要合成多种酶，辅酶和某些中间代谢产物）影响因素：菌种的遗传性、菌龄、接种量、及移种前后所处的环境条件等。缩短意义：可以缩短生产周期，提高设备利用率缩短措施：增加接种量调整营养成分采用对数期的种子接种选用繁殖快的菌种延滞期延滞期特点：生长速率等于零细胞合成新的成分微生物细胞特点：补充消耗的材料适应新的培养基或别的培养条件细胞形态变大或变长对外界不良环境敏感。影响延滞期长短的因素与实践意义

接种龄对数期“种子”，延滞期较短；延滞期或衰亡期“种子”,延滞期较长接种量接种量大，延滞期较短；接种量小，延滞期较长；培养基成分培养基成分丰富的，延滞期较短；培养基成分与种子培养基一致,延滞期较短

把细菌接种到新鲜的培养基中培养时，并不立即进行分裂繁殖，细菌增殖数为０，这时需要合成多种酶，辅酶和某些中间代谢产物，要经过一个调整和适应过程。Microbiology延滞期出现原因Logorexponentialgrowthphase

Inthesubsequentdiscussion,thenumbersrefertothefigureabove.Oncetheappropriateenzymesforgrowthinaparticularmediumhavebeenexpressedcellsbegintomultiply.Thisperiodofmaximaldivisioncanlastforseveralhoursordays,dependingupontheorganism,andiscalledthelogorexponentialgrowthphase

生长曲线的指数期LogorexponentialgrowthphaseAtthispointthecellsmultiplyrapidly(exponentially)Balancedgrowth–allcomponentsofacellgrowatthesamerateGrowthrateisindependentofnutrientconcentration,asnutrientsareinexcessLogPhase(指数期）细胞数呈几何级数增加细胞的生理特点：细胞生长速率R最大，均衡生长：个体形态、化学组成和生理特性等均一致，代时（G，世代时间，增代时间）或倍增时间：最短酶系活跃，代谢旺盛出现原因：细胞完成生理调整，基质营养和环境适宜

代谢生理等研究材料，增殖酵母菌的最适材料，作为发酵的种子可缩短延迟期。繁殖代数和世代时间

n=G=R=3.322(lgx2-lgx1)t2-t1n：繁殖代数G：世代时间R：生长速率常数X0：在对数期第一次取样时的细胞密度个/mlXt：在对数期第二次取样时的细胞密度个/mlt：两次取样的时间间隔（分）lgXt－lgX0lg2tlg2lgXt－lgX0菌名培养基温度(℃)时间(min)大肠杆菌肉汤3717荧光假单胞菌肉汤3734～34.5菜豆火疫病假单胞菌肉汤25150白菜软腐病欧氏杆菌肉汤3771～94甘蓝黑腐病黄杆菌肉汤2598大豆根瘤菌葡萄糖25343.8～460.8枯草杆菌葡萄糖肉汤2526～32巨大芽孢杆菌肉汤3031霉状芽孢杆菌肉汤3728腊状芽孢杆菌肉汤3018.8丁酸梭菌玉米醪3051保加利亚乳酸杆菌牛乳3739～74肉毒梭菌葡萄糖肉汤3735乳酸链球菌牛乳3723.5～26园褐固氮菌葡萄糖25240霍乱孤菌肉汤3721～38某些微生物的生长代时影响指数期代时长短的因素菌种营养成分营养物浓度培养温度StationaryPhase

Eventuallytheincreaseincellnumberceases,eitherbecausecellsstopdividingortherateofdivisionequalstherateofcelldeath,resultinginastationaryphase

Thisisusuallycausedbylimitationofanutrientortheaccumulationofatoxicwasteproduct.Dependingonthebacterium,stationaryphasecanlastforseveralhourstomanydays.StationaryPhase稳定期细胞数变化：活细胞数保持动态平衡（正生长和负生长相等），总细胞数开始时仍呈上升趋势。菌体产量与营养物质的消耗间呈有规律的比例关系（生长产量常数Y，或称生长得率）：

Y=x-x0

C0-C

还有更精确的计算方法。出现原因：营养尤其生长限制因子的消耗，营养物比例失调，有害代谢产物积累，pH值EH值等理化条件不适细胞生理特点：分裂速度降低活细胞数达到最大值开始积累储藏物质积累发酵产物（次生代谢物，对数期-菌体生长期，稳定期-代谢产物合成期）芽孢细菌产生芽孢*实践意义：生产收获时期（菌体及相平行的代谢产物）；细胞物质生物测定；促进连续培养原理提出和工艺技术创建StationaryPhaseDeathphase

Thefinalchapterofagrowthcurveisthedeathphase

Anexponentialdecreaseinthenumberoforganismsduetocelldeathoccursduringthisphase.Somemicroorganismsneverexperienceadeathphaseoritisgreatlydelayedduetotheirabilitytosurviveforlongperiodswithoutnutrients.Deathphase衰亡期细胞数变化：活细胞数逐渐下降细胞生理特点：细胞内颗粒更加明显,出现液泡细胞出现异常形态细胞死亡伴随自溶产生原因：遗传，培养条件和环境不适宜细菌生长曲线的用途：研究上生产上细菌的生长曲线微生物的生长曲线，反映一种微生物在一定的生活环境中(如试管、摇瓶、发酵罐)生长繁殖和死亡的规律。它既可作为营养物和环境因素对生长繁殖影响的理论研究指标，也可用为调控微生物生长代谢的依据，以指导微生物生产实践。分批培养与连续培养分批培养在一个相对独立密闭的系统中，一次性投入培养基对微生物进行接种培养的方式一般称为分批培养(batchculture)

连续培养

连续培养是指在深入研究分批培养中生长曲线形成的内在机制的基础上，开放培养系统，不断补充营养液、解除抑制因子、优化生长代谢环境的培养方式分批培养batchculture

将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获的培养方法。摇瓶培养分批培养与连续培养比较MicrobialcontinuouscultureMicrobialcontinuouscultureTurbidostatChemostatOne-stepcontinuousfermentorMulti-stepcontinuousfermentorContinuousculture恒浊连续培养(恒浊器

turbidostat):不断调节流速使培养液浊度保持恒定。

适用：收获菌体及与菌体相平行的产物。

恒浊连续发酵与单批发酵相比的优点：

1）缩短发酵周期，提高设备利用率；

2）便于自动控制；

3）降低动力消耗及体力劳动强度；

4）产品质量较稳定；恒浊器：turbidostat根据培养器内微生物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养基的流速（可变），而使培养液的浊度保持恒定的连续培养方法。采用养料浓度较高的完全培养基，无限制因子恒定细胞浓度（菌数）目的：不断提供具有一定生理状态的细胞，得到以最高生长速率进行生长的培养物。应用：获得大量的菌体，获得与菌体生长相平衡的代谢产物（乙醇、乳酸。Continuousculture

chemostat

Turbidostat

恒浊器

Continuousculture恒化连续培养(恒化器chemostat)

恒定流速，及时补充营养，营养物浓度基本恒定，从而保持恒定生长速率。又称恒组成连续培养。培养基成分中，必须将某种必需的营养物控制在较低的浓度，以作为限制性因子，而其它营养物过量。常用的有氨、氨基酸、葡萄糖、生长因子、无机盐等。

适用：科研连续培养的优点：高效，便于自动控制，产品质量稳定。缺点：菌种易退化，易污染杂菌，培养基利用率低。

恒化器：chemostat一种设法使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下，进行生长繁殖的连续培养装置。恒定化学环境，获得细胞保持恒定生长速率,低于最高菌体产量而密度稳定的菌体.采用恒定的低浓度的限制性因子条件：菌体生长提供所必需的营养物质；在一定的浓度范围内,生长速率与其浓度呈正比关系，调节它的浓度获得不同生长速度的微生物。实验室科研较多限制因子的种类：氨基酸葡萄糖生长因子无机盐等Areservoirofsterilemediumisaddedtothecultureataconstantrate.Spentmediumleavesthecultureatthesamerate.FreshnutrientsareconstantlyenteringthecultureandwasteproductsarecontinuouslyremovedAchemostat连续培养处于稳定状态时的条件D=F/V=μF：培养基流入(流出)培养器的速度（l/h）V：培养基中培养液的体积(l)D：稀释率,单位时间内单位体积的培养基中流入流出的量μ：比生长速率,单位时间内单位重量的微生物所形成的新的菌体的重量μ=μmaxSKs+S

连续培养的稳定状态

当D=μ时,处于稳定状态，菌体密度稳定

当D＜μ时,μ减小,但培养物中细胞密度加大。当D＞μ时,μ增大,但培养物中细胞密度减小。当D＞μmax时,细胞被“洗出”,连续培养系统遭破坏连续发酵的应用丙酮丁醇发酵、酒精发酵(D=0.05-0.1)

优点：缩短发酵周期，提高设备利用率，节省培菌工作，便于自动控制等，产品质量稳定。高效、节约缺点：营养物利用率一般低于单批培养染菌问题菌种退化问题等Microbiology指微生物在液体培养基中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术。现代高密度培养技术主要由基因工程菌生产多肽类药物中发展来的。（目前最高记录：174g（湿重）/L，175.4g（湿重）/L）选取最佳培养基成分和各成分含量补料提高溶解氧的浓度防止有害代谢产物的生成微生物的高密度培养（highcell-densityculture,HCDC）意义：可减少培养容器的体积、培养基的消耗和提高下游工程中分离、提取的效率，缩短生产周期、减少设备投入和降低生产成本。环境因子对微生物生长及代谢的影响环境因子对微生物的影响可以分为三类适宜环境：微生物能正常地进行生命活动不适宜环境：微生物的正常生命活动受到抑制或被迫暂时改变原有的一些特征。恶劣环境：微生物死亡或发生遗传变易。TheinfluenceofenvironmentalfactorsongrowthTemperature温度通过影响膜的液晶结构、酶和蛋白质的合成及活性、RNA的结构、转录等影响微生物的生命活动。物质溶解度ThreecardinalpointOptimumgrowthtemperature微生物的生长温度范围

Ø最低温度：微生物能生长的温度低限Ø最适温度：微生物生长繁殖速度最快的温度Ø最高温度：微生物能生长的温度高限

致死温度ACBvT℃不同生物的温度上限一般有以下规律：

原核生物高于真核生物；原核生物中古生菌高于真细菌；非光能营养细菌高于光能营养细菌；单细胞生物高于多细胞生物。Temperatureandgrowth三大类微生物最低、最适、最高生长温度及其范围

最适发酵温度发酵速率和代谢产物积累速率最大时的温度。各种微生物的最适生长温度按照最适生长温度范围的不同分类：嗜冷微生物嗜温微生物嗜热微生物不同温度下的菌例TheinfluenceofenvironmentalfactorsongrowthOxygenconcentrationObligateorstrictaerobes专性好氧菌Facultativeanaerobes兼性厌氧菌Microaerophilicbacteria微好氧菌Aerotolerantanaerobes耐氧菌Anaerobes厌氧菌

好氧微生物兼性好氧微生物耐氧厌氧微生物厌氧微生物微好氧微生物含酶组成好氧微生物兼性好氧微生物耐氧厌氧微生物厌氧微生物微好氧微生物SOD超氧化物歧化酶+++-+Catalase过氧化氢酶++--+/-低水平氧对厌氧菌毒害的机制超氧阴离子是活性氧的形式之一，带奇数电子，负电荷。它即有分子性质，也有离子性质，反应力极强，性质极不稳定。在体内可破坏各种重要生物高分子和膜，也可形成其他活性氧化物。在体内，超氧阴离子自由基可以自由酶促（如黄嘌呤氧化酶）或非酶促方式形成。生物体针对氧毒害的防治措施超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）是其中之一。好氧、耐氧微生物的超氧化物歧化酶将超氧阴离子转化为毒性稍低的过氧化氢，过氧化氢酶再将过氧化氢转化为无毒的水。厌氧微生物因为没有超氧化物歧化酶，超氧阴离子自由基可造成其损害。2O2

.-+2HSOD好氧、耐氧微生物

H2O2+O2过氧化氢酶过氧化物酶好氧菌H2O+½O22H2O耐氧菌NADH2

NAD实验证明：大肠杆菌的超氧化物歧化酶突变，就变成“严格厌氧菌”实验证明：大肠杆菌的超氧化物歧化酶突变，就变成“严格厌氧菌”专性好氧微生物：strictaerobes

分子氧作为最终电子受体，氧参与合成固醇及不饱和脂肪酸；细胞含有超氧化物歧化酶和过氧化氢酶。对氧化还原电位的要求

Eh＞+0.1v

可生长，最适在+0.3—0.4v

如:霉菌、大部分放线菌及部分细菌兼性须氧微生物：facultativeaerobes

Eh＞+0.1v通过好氧呼吸获取能量

Eh＜+0.1v

通过发酵或无氧呼吸获取能量细胞含有SOD和过氧化氢酶如：许多酵母和细菌酿酒酵母、大肠杆菌、产气杆菌等微好氧菌：microaerophilicbacteria

只能在较低的氧分压（0.01—0.03巴）下才能正常生长；也通过有氧呼吸获取能量。

如：霍乱弧菌、氢单胞菌属等耐氧微生物：aerotolerantanaerobe

一类可在分子氧存在条件下进行厌氧生活的厌氧菌。仅依靠发酵获得能量细胞内有SOD和过氧化物酶，但无过氧化氢酶。如：乳链球菌、乳酸乳杆菌、膜明串珠菌厌氧微生物：anaerobe

只能在无氧或低Eh值时,

才能生长。分子氧可抑制生长或导致死亡。通过发酵或无氧呼吸等获取能量。细胞内缺乏SOD细胞色素氧化酶、过氧化氢酶*等

如：梭状芽孢杆菌属、双歧杆菌属、丁酸弧菌属等TheinfluenceofenvironmentalfactorsongrowthHydrogenionconcentration

pHpHAcidophiles

pHoptimaintherangeof1-5.5,includemanyfungiandsomeobligateacidophilicbacteriasuchasThiobacillus,SulfolobusandThermoplasma

pHNeutrophiles

preferapHintherangeof5.5-8.0mostorganismsfallintothiscategory.PathogensofmammalsusuallyhaveextraordinarilynarrowpHrangesverycloseto7.0wheretheywillgrowwell.pHAlkalophiles

preferapHintherangeof8.0-11arefoundinhighlybasicsodalakesandhighcarbonatesoils.OrganismHabitatMinimumpHOptimumpHMaximumpHThiobacillus

thiooxidansAreasrichinsulfur,oftenacidic0.52.0-2.84.0-6.0Sulfolobus

acidocaldariusAcidicsulfursprings1.02.0-3.05.0BacillusacidocaldariusAcidichotsprings2.04.06.0Zymomonas

lindneriHighsugarenvironments(sugarcane,wine,honey)3.55.5-6.07.5LactobacillusacidophilusAnimals,plants,decayingmatter4.0-4.65.8-6.66.8StaphylococcusaureusSurfacesofanimals,nasalcavity,skin4.27.0-7.59.3EscherichiacoliIntestinesofanimals4.46.0-7.09.0ClostridiumsporogenesSoilsandsedimentsthatareanaerobic5.0-5.86.0-7.68.5-9.0Erwinia

caratovoraPlantpathogenPseudomonasaeruginosaUbiquitous5.66.6-7.08.0StreptococcuspneumoniaePathogenofanimalsNitrobacter

spp.Ubiquitous6.67.6-8.610.0ControlofmicroorganismsbyphysicalandchemicalagentsDefinitionoffrequentlyusedtermsSterilization杀死物品中的一切微生物的措施Disinfection杀死一切病原微生物的措施Antisepsis任何抑制或阻止微生物在有机物质中生长繁殖，避免引起变质的处理Chemotherapy几个基本概念根据控制作用的效果分类灭菌（sterilization）:

凡是能够杀死或消除材料或物体上全部微生物的方法——杀菌、溶菌；消毒（disinfection）:

能够杀死、消除或降低材料或物体上的病原微生物，使之不致引起疾病的方法；防腐（antisepsis）:

能够防止或抑制微生物生长，但不能杀死微生物群体的方法——低温、缺氧、干燥、高渗、高酸度、高醇度、加防腐剂。化疗（chemotherapy）：利用具有高度选择毒力（selectivetoxicity）即对病原菌具高度毒力而对其宿主基本无毒的化学物质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗该宿主传染病的一种措施——磺胺类、抗生素、生物药剂等。根据控制作用原理、方式和方法分类物理控制方法化学控制方法抑菌、杀菌、溶菌作用的比较当处于指数生长期时，在箭头处加入可抑制生长的某因素影响灭菌作用效果的因素（时间）作用时间长短

起始微生物总数微生物的抗性

作用方式TheuseofphysicalmethodsincontrolHeat高温杀菌机理：高温使蛋白质、核酸等重要生物大分子发生变性、破坏，以及破坏细胞膜上的类脂成分，导致微生物死亡。DryheatsterilizationMoistheatsterilization高温灭菌或消毒的方法1、干热灭菌法干热灭菌：150℃～170℃下处理1-2小时。适用于玻璃器皿、金属用具等耐热物品的灭菌。优点：可保持物品的干燥火焰灭菌（灼烧灭菌）：常用于金属性接种工具、污染物品及实验材料等废弃物的处理。Theuseofphysicalmethodsincontrol为何同样条件下湿热比干热灭菌效果好？蒸汽穿透力强细胞物质在含水量高时易变性凝固(更易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构

)汽化潜热湿热对一般营养体和孢子的杀灭条件：多数细菌和真菌的营养细胞：在60℃左右处理5-10分钟；酵母菌和真菌的孢子：用80℃以上温度处理；细菌的芽孢：121℃处理15分钟以上。

蛋白质含水量(％)蛋白质凝固温度(℃)灭菌时间（min）50

25

18

6

056

74~80

80~90

145

160~17030

30

30

30

30蛋白质含水量与其凝固温度的关系

1.巴氏消毒法：

设备原理适用：高温易破坏营养或风味物质处理巴氏消毒单位：

在60℃经历1分钟所引起的消毒效应称为一个巴氏消毒单位Pu=Z*1.393LTH法：63℃30minHTST法：72℃15s

2.放射线灭菌法：原理：利用放射性同位素60Co和137Cs产生的γ射线可以进行放射线灭菌

适用：

不耐热或受热易变质、变味的物质灭菌与消毒。

每次可以对较多物品进行灭菌，而且可以对密封包装后的物品进行灭菌。（2）加压法常规加压蒸汽灭菌法：

121.3℃，压力为1kg/cm2或15磅/英寸2，维持15~30min115℃，压力为0.7kg/cm2或10磅/英寸2，维持10~20min（过高温度容易被破坏）使用于一切微生物学实验，医疗机构或发酵工厂中对培养基等多种器材、物料的灭菌。连续加压蒸汽灭菌法（连消法）：发酵工业和食品加工生产中使用，让培养基在管道的流动过程中快速升温、维持和冷却，然后流进发酵罐（热交换）。

135~140℃下维持5~15秒热死时间——最短时间（温度恒定）热死温度——最低温度（时间恒定，10min）高压蒸汽灭菌的原理高压蒸汽灭菌器是利用加压的饱和蒸汽（潜热）对物品、器械、药液等灭菌的设备，适用于科学研究、医疗卫生、食品等实验室或工厂使用——造成蛋白质等变性失活。潜热是指当1g100℃的水蒸汽变成1g100℃水时，释放出2255.2J的热量区别只在于自动化程度的高低（水位控制、温度恒定控制、时间控制、自动排放冷空气、程序化显示）饱和蒸汽压压力指示温度直接利用温度探测器指示温度典型的高压蒸汽灭菌锅纵剖面结构压力调节器安全阀排气口控制柄记录仪门垫圈放电器蒸汽阀蒸汽夹层阻板蒸汽供给蒸汽供应阀温度感应器蒸汽凝汽瓣废汽冷凝器蒸汽通入夹层蒸汽由夹层到灭菌室夹层冷凝水收集口蒸汽由夹层进入灭菌室和蒸汽排出口卧式灭菌锅示意图（简图）蒸汽进口灭菌过程出气口（冷空气和蒸汽）灭菌时间到排汽口压力表蒸汽排气阀温度计阀蒸汽供应阀门消毒室夹套（层）立式压力灭菌器手提式灭菌锅卧式矩型和圆型压力蒸汽消毒器高压蒸汽灭菌过程先加水（一般用蒸馏水或去离子水）——淹过电发热管和内筒支架；放物（要求松散）；加盖（对称旋紧），加热，升温排除冷空气（放汽阀）加压（关闭放汽阀），保温，定时降温，至压力为“0”，打开放汽阀开盖取物（注意蒸汽烫伤）（二）影响加压蒸汽灭菌效果的因素1、灭菌物体的含菌量2、灭菌锅内空气排除程度灭菌锅是靠蒸汽的温度而不是单纯靠压力来达到灭菌效果。3、灭菌对象的pHpH小于6.0时，微生物易死亡，

pH在6.0~8.0时，不易死亡。4、灭菌对象的体积。5、加热与散热速度。空气排除度对灭菌温度的影响压力表读数锅内温度（℃）kg/cm2磅/吋2MPa饱和蒸汽排除1/2空气不排除空气0.3550.031108.894720.70110.076115.6110901.05150.108121.31121001.40200.142126.21181091.75250.172130.01241152.10300.213134.6128121一些细菌芽孢湿热灭菌所需时间消毒、灭菌的生物指示菌嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillusstearothermophilus）结核分枝杆菌——致病菌指示菌（Mycobacteriumtuberculosis沙门氏菌——致病菌指示菌（通用检测）（Salmonellaspp）高压蒸汽灭菌效果的监测方法

（3种）1、工艺（程序）监测——压力表、温度计等，最常见，每次都使用，定期校正；2、化学指示监测——特定化合物熔点（熔化前后晶体形态不同，硫磺熔点115℃、乙酰替苯胺116℃、脱水琥珀酸120℃、苯甲酸122.4℃等结晶）、灭菌指示胶带（变色反应）；3、生物指示剂监测

——特定微生物（需经培养）。（三）高温对培养基成分的有害影响

及其防止1、有害影响：形成沉淀物、破坏营养、改变pH等2、防止法特殊加热灭菌：分别灭菌（用前后混合）、低压灭菌（降低温度）、缩短时间等过滤除菌法其他方法：逐一加入法或加螯合剂FiltrationRemovesmicrobesfromheat-sensitiveliquidsandcirculatingairusingafilter.Asfluidpassesthrough,theorganismsaretrappedintheporesofthefilteringmaterial.

（a）注射式微孔滤器（b）小型过滤装置（c）层流生物安全柜

图6—16常用膜滤器过滤除菌法原理：气体或液体中微生物被微孔过滤介质除去。用具：滤膜过滤装置、石棉板过滤器和硅藻土过滤器等。适用：对热不稳定的物质对于蛋白质、酶、血清、维生素等热敏性物质，常采用过滤除菌法。其它消毒灭菌方法辐射杀菌——紫外光、电离辐射、某种条件下的强可见光、微波等，可用作控制微生物的生长和保存食品。化学药剂的熏蒸（后述）——环氧乙烷、甲醛等辐射的作用紫外光200—300nm范围的紫外光杀菌作用最好。杀菌作用机制：嘧啶二聚体、自由基、O3等紫外光穿透能力很差，主要用作物体表面或室内空气的杀菌。（饮用水的最后一级，自动化）电离辐射（穿透力强、能量较高）主要使用x射线和γ射线（60Co）。当x射线或γ射线撞击分子时，形成离子和自由基分子，故可称电离辐射。电离辐射产生H2O2，使蛋白质发生变化，细胞受到损伤或死亡。电离辐射主要用于其他方法所不能解决的塑料制品、医疗设备、药品和食品的灭菌。强可见光400—700nm波长范围的强可见光也具有直接的杀菌效应，它们能够氧化细菌细胞内的光敏感分子，如核黄素和卟啉环（构成氧化酶的成分）。实验室应注意避免将细菌培养物暴露于强光下。此外，曙红和四甲基蓝能够吸收强可见光使蛋白质和核酸氧化，因此常将两者结合用作灭活病毒和细菌。微波微波是一种红外线。微波并不直接影响微生物，但可通过被辐照物体产热而杀死微生物。然而由于微波加热食品通常存在不均匀问题，微生物逃逸微波加热现象常会发生。非常适合家庭器皿等消毒灭菌——加少量水但不密封。TheuseofphysicalmethodsincontrolMicrowave

不同灭菌方法对雪莲果口服液营养成分的影响6.28.docUltravioletray

紫外线杀菌效能的研究.pdf紫外线消毒工艺与应用概况.pdfTheUseofChemicalAgentsinControl（一）表面消毒剂（二）抗代谢药物的代表——磺胺类药物（三）抗生素化学因素表面消毒剂化学因素气体状态化学治疗剂抗代谢药物：磺胺类等生物药物等抗生素TheUseofChemicalAgentsinControlMinimuminhibitoryconcentration50%lethaldose,LD50Minimumlethaldose,MLDTheuseofchemicalagentsincontrolSurfacedisinfactantPhenolcofficient,P.C.Antimetabolite-sulphonamides,sulfadrugs三、化学杀菌剂、消毒剂和治疗剂（一）表面消毒剂（二）抗代谢药物的代表——磺胺类药物（三）抗生素化学因素表面消毒剂化学因素气体状态化学治疗剂抗代谢药物：磺胺类等生物药物等抗生素最低抑制浓度（Minimuminhibitoryconcentration，MIC）半致死剂量（50%lethaldose，LD50）最低致死剂量（Minimumlethaldose，MLD）（一）表面消毒剂（广谱毒性）是指对一切活细胞都有毒性，不能用作活细胞或机体内治疗用的化学药剂。石炭酸系数（Phenolcoeffcient，P.C.）：是表示表面消毒剂的相对杀菌强度，指在一定时间内，被试药剂能杀死全部供试菌的最高稀释度与达到同效的石炭酸的最高稀释度之比。——具备一定可比性一般而言，石炭酸系数越高，杀菌强度越强。见P179，表6-10若干重要表面消毒剂及其应用——作用于膜、蛋白质等。石炭酸系数的计算一般规定处理时间10min供试菌被全部杀死的稀释倍数之比（药剂和石炭酸）。供试菌：伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphi）某甲药剂稀释300倍（稀释度1：300）；石炭酸稀释100倍（稀释度1：100）。常见表面消毒剂（杀菌剂）的作用机制及应用

二.常用的化学消毒剂消毒剂：能杀死微生物的制剂防腐剂：能抑制微生物生命活动的制剂消毒剂的种类

氧化作用强氧化剂、漂白粉、氯等凝固蛋白甲醛、酚溶解类脂乙醇、酚、来苏尔脱水作用福尔马林、乙醇与巯基作用重金属、与核酸作用碱性染料与膜作用新洁尔灭常用的消毒剂

70%乙醇福尔马林

新洁尔灭（0.25%）漂白粉自来水0.2—0.5ppmCl2

发酵用水预防性1ppm

污染过的水10ppm

发酵设备外壁20—200ppm

空气1%漂白粉熏蒸发酵工厂常用防霉剂防霉涂料、硫磺、石灰

发酵工厂的灭菌消毒原料及发酵罐：实罐灭菌管道：蒸汽灭菌；化学消毒剂---甲醛、商品化消毒剂空罐：蒸汽灭菌化学消毒剂空气：过滤除菌空气过滤器：蒸汽灭菌，化学消毒剂水：过滤除菌、紫外线杀菌、加氯杀菌等化学药剂的熏蒸Antimetabolite

Sulphonamides,Sulfadrugs磺胺类药物（Sulfonamides,SAs）是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，是一类用于预防和治疗细菌感染性疾病的化学治疗药物（二）抗代谢药物的代表——磺胺类药物是一类在化学结构上与细胞内必要代谢物的结构相似，并可干扰正常代谢活动的化学物质，具有选择毒力。——竞争性抑制最常用的是磺胺类药物。磺胺与叶酸合成前体对氨基苯甲酸（PABA）的结构类似。叶酸是辅酶，在氨基酸、维生素、核酸和蛋白质合成中起重要作用，很多细菌需要自己合成叶酸才能生长。磺胺药具有选择毒力：因为人体由于缺乏相应的合成酶，不能自身合成四氢叶酸，必须由外界提供，所以对磺胺不敏感。（SAs）对氨基苯磺酰胺对氨基苯甲酸（PABA）Theantibioticsulfanilamideissimilarinstructuretopara-aminobenzoicacid(PABA),anintermediateinthebiosyntheticpathwayforfolicacid.SulfanilamidecancompetitivelyinhibittheenzymethathasPABAasit'snormalsubstratebycompetitivelyoccupyingtheactivesiteoftheenzyme.磺胺类药物发现和应用1932年，德国化学家合成了一种名为“百浪多息”的红色染料。德国生物化学家格哈特·杜马克在试验过程中发现，“百浪多息”对于感染溶血性链球菌的小白鼠具有很高的疗效。后来，他又用兔、狗进行试验，都获得成功。这时，他的女儿得了链球菌败血病，奄奄一息，他在焦急不安中，决定使用“百浪多息”，结果女儿得救。体外无效体内有效，特雷富埃尔和他的同事，研究证明了体内分解出“氨苯磺胺”是其有效成分。1937年制出“磺胺吡啶”，1939年制出“磺胺噻唑”，1941年制出了“磺胺嘧啶”……这样，医生就可以在一个“人丁兴旺”的“磺胺家族”中挑选适用于治疗各种感染的药了。1939年，格哈特·杜马克被授予诺贝尔医学与生理学奖。

磺胺的抑菌机制TMP——三甲基苄二氨嘧啶，磺胺增效剂磺胺的抑菌机制为什么磺胺对人体细胞无毒性？因为人缺乏从对氨基苯甲酸合成叶酸的相关酶二氢蝶酸合成酶、二氢叶酸合成酶和二氢叶酸还原酶，故不能用外界提供的对氨基苯甲酸自行合成叶酸，而必须直接利用营养物中的叶酸做为生长因子。需要注意的问题：为什么抗代谢药物抗性突变菌株也是可以大量合成相应代谢物的突变菌株？——磺胺失效的结果。TheuseofchemicalagentsincontrolAntibiotics

一类由微生物或其他生物生命活动过程中合成的次生代谢或其人工合成衍生物（半合成），在很低浓度时就能抑制或干扰它种生物的生命活动发现和半合成了几万种，临床使用五、六十种抗生素最初是由英国科学家弗来明（A.Fleming）在20世纪20年代末期偶然发现的，40年代初才作为化学治疗剂生产问世。

青霉素抑制藤黄微球菌的生长

抗生素的抗菌谱：抗生素的作用对象的范围。通常将对多种类群的细菌有作用的抗生素称为广谱抗生素，如四环素和土霉素既对G＋又对G-细菌有作用；而只对少数几种细菌有作用的抗生素则称为狭谱抗生素，如青霉素只对G＋菌有效。抗生素的效价单位就是指定量抗生素有效成分多少的一种计量单位——牛津单位——管蝶法测定。有的是以抗生素的相当生物活性单位的重量作为单位，如1μg游离碱=1单位（U），链霉素盐酸盐就是以此来表示的；有的则是以纯抗生素的活性单位相当的实际重量为1单位而加以折算的，如青霉素单位最初是以能在50ml肉汤培养基内完全抑制金黄色葡萄球菌的最小青霉素的量作为一个单位，以后青霉素纯化后确定这一量相当于青霉素钠盐0.5988μg，因而定0.5988μg青霉素钠盐为一个青霉素单位。抗生素的作用机制抑制细胞壁的合成；引起细胞壁降解；干扰细胞膜；抑制蛋白质的合成抑制DNA合成；抑制DNA复制；抑制RNA转录；抑制RNA合成。P183表6-11若干重要抗生素及其作用机制注意：D-环丝氨酸万古霉素杆菌肽青霉素头孢菌素氯霉素mechanismofactionofantibioticagentsSitesofactionofdifferentantimicrobialagents.PABA,paraminobenzoicacid;DHFA,dihydrofolicacid;THFA,tetrahydrofolicacid.

常用的抗生素及其作用机制

抑制细胞壁

万古霉素抑制糖肽聚合物的伸长阻止肽聚糖的合成青霉素抑制转肽作用阻止糖肽链之间的铰链头孢菌素同上干扰细胞膜短杆菌肽与膜结合，使氧化磷酸化解偶联；细胞内含物外漏。多粘菌素使细胞膜上的蛋白质释放细胞内含物外漏。抑制DNA合成萘啶酮酸作用于复制基因，切断DNA合成。

抑制DNA复制丝裂霉素使DNA的互补链相结合，抑制复制后的分离。抑制蛋白质的合成链霉素

与30s核糖体结合，抑制肽链延伸。卡那霉素

与30s核糖体结合，同上氯霉素

与50s结合，抑制氨基酰-tRNA附着核糖体。红霉素与50s结合，引起构像变化抑制RNA合成利福平与RNA聚合酶结合,阻止RNA合成

4、微生物产生抗药性的机制（6种）①结构发生改变导致某类药物作用的结构缺失，如某些细菌在青霉素存在时转变成细胞壁缺失的L型，使青霉素无法发挥作用；②细胞膜对药物的通透性和吸收能力降低，如委内瑞拉链霉菌细胞通过膜透性发生改变，阻止四环素进入细胞；③激活膜上抗药泵蛋白将进入到胞内的药物泵出胞外，如大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等抗性菌株就可通过膜上含有的质子/药物交换蛋白，将质子泵入，药物泵出；④合成某种酶将化学治疗剂被变为无活性的形式，如某些金黄色葡萄球菌耐药菌株产生β-内酰胺酶，使青霉素分子中的β-内酰胺环开裂而失去抑菌作用；⑤药物受体的亲和性或数量下降，如大肠杆菌耐药菌株的30S核糖体亚基发生改变，不再与链霉素结合，从而使链霉素失活；⑥被药物阻断的代谢途径（酶）发生遗传改变，如有的抗磺酸药物的菌株，改变了二氢叶酸合成酶的性质，合成了一种对磺酸药物不敏感的酶。抗药性的天然选择抗药性突变株无抗药性菌株暴露于含药培养基敏感细胞被杀死抗性突变株存活微生物细胞种群产生更多抗性突变株残存种群继续随时间生长抗性因子的传递和扩散Chapter7MicrobialGenetics

GenotypePhenotypeVariationModificationMaterialsrelatedtoHeredityandVariationThethreeclassicalexperimentsTtransformationofStreptococcus.PneumoniaeInfectionofphageT2ReconstructionofvirusesTheFirstdemonstrationofbacterialtransformation

ExperimentsdonebyFrederickGriffith(inLondon)in1928foundthereweretwodifferenttypesofthebacteriumStreptococcuspneumoniae

An"S"orSMOOTHcoatstrain,whichislethaltomice

An"R"orroughstrain,whichwillnothurtthemouseGriffithfoundthathecouldheatinactivatethesmoothstrain.

However,ifheweretotakeamixtureoftheheat-inactivatedSstrain,mixedwiththeRstrain,themousewoulddie.

Thustherewassomematerialintheheat-killedSstrainthatwasresponsiblefor“transforming”theRstrainintoalethalform.TheFirstdemonstrationofbacterialtransformationFredGriffith(andalabco-worker)waskilledintheirlaboratoryin1940fromaGermanbomb.

However,theirworkcontinuedonintheU.S.,andin1944,OswaldAvery,C.M.MacLeod,andM.McCartycarefullydemonstratedthattheONLYmaterialthatwasresponsibleforthetransformationwasDNA-thus,DNAwasthe"Geneticmaterial"-however,manyscientistswerestillnotsurethatitwasREALLYDNA(andnotproteins)thatwasthegeneticmaterial.

MixtureofRcells&cellmattersfromScellsCellextractRtypecellStypecellSaccharideproteinInfectionofphageT2In1952,AlfredHersheyandMarthaChase(UNDERGRADUATEatthetime!)demonstratedclearlythatDNAmustbethegeneticmaterial,usingbacteriophageT2.ReconstructionofvirusesFraenkel-Conratandhiscoworkersfurtherinvestigatedthisconclusionwithasimplebutcompellingexchangeexperiment.Firsttheychemicallydissociatedeachvirus,separatingitsproteincoatfromitsRNA.ReconstructionofvirusesTheythenmanufacturedhybridvirusesbycombiningtheproteinofonewiththeRNAoftheother.WhentheyinfectedhealthytobaccoplantswithahybridviruscomposedofHRVRNAandTMVprotein,thetobaccoleavesdevelopedlesionscharacteristicofHRV.Clearly,thehereditarypropertiesofthevirusweredeterminedbythenucleicacidinitscore,nottheproteininitscoat.TMVTMVHRVWild SeparationMixtureInfection IsolationHRVReconstructionofvirusesLocation&PatternofHeredityMaterialsinMicrobialCell七个水平细胞水平细胞核水平

染色体水平核酸水平基因水平密码子水平

核苷酸水平

原核生物的质粒PlasmidinProkaryotesplasmid电子显微镜下观察到的完整的细菌染色体和质粒(箭头所指处为质粒)

Plasmid&GeneengineeringpBR322:description&restrictionmap

pBR322is4361

bpinlengthandcontains

thereplicon

represponsibleforthereplicationofplasmid(source-plasmidpMB1)ropgenecodingfortheRopprotein,whichpromotesconversionoftheunstableRNA

I-RNA

IIcomplextoastablecomplexandservestodecreasecopynumber(source-plasmidpMB1)blagene,codingforbeta-lactamasethatconfersresistancetoampicillin(source-transposonTn3)tetgene,encodingtetracyclineresistanceprotein(source-plasmidpSC101).IsolationandidentificationofplasmidcesiumchloridegradientsRplasmidPlasmidColE16646bp

ColicinE1protein(cea)

PlasmidColIb-P993399bp

Bacteriocinproteins:Colicin

IbCrowngallTiplasmidRootinducingplasmidGeneMutationandBreedingbyInducedMutationGeneMutationAuxotrophResistantmutantConditionallethalmutantTemperaturesensitivemutant,TsmutantMorphologicalmutantAntigenicmutantMetabolitemutantMutationRateinBacteriathe"normal"mutationrateforageneinnatureisaboutonemutationineverymilliontoeverybilliondivisions.Let