基因克隆的载体

基因克隆的载体第一页，共一百七十二页，2022年，8月28日第二页，共一百七十二页，2022年，8月28日什么叫载体？哪些材料可以作为载体？为什么？载体的分类，以及不同类型载体间的区别？第三页，共一百七十二页，2022年，8月28日载体的总论质粒载体噬菌体载体人工载体本章主要内容第四页，共一百七十二页，2022年，8月28日载体的总论第五页，共一百七十二页，2022年，8月28日载体的定义载体的条件载体的分类载体的来源及其特征本节主要内容第六页，共一百七十二页，2022年，8月28日载体（vector）是由在细胞中能够自主复制的ＤＮＡ分子构成的一种遗传成分，通过实验手段可使其它的ＤＮＡ片段连接在它的上面，而进行复制。What?作为基因工程的载体，具备几个性能：第七页，共一百七十二页，2022年，8月28日载体的条件NecessaryconditionsforgeneralvectorNecessaryconditionsforperfectvector第八页，共一百七十二页，2022年，8月28日分子较小，可携带比较大的ＤＮＡ片段。能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点（多克隆位点multiplecloningsites，MCS）。有适合的标记，易于选择。有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。Necessaryconditionsforgeneralvector第九页，共一百七十二页，2022年，8月28日Necessaryconditionsforperfectvector具有较小的分子量和较高的拷贝数。低分子量的质粒易于操作，克隆外源片断后仍能有效的转化给受体细胞;低分子量的质粒对限制酶具有多重识别位点的几率也较低；较高的拷贝数可获得大量的克隆基因理想的选择性的标记；根据需要，加载一些特殊的元件；具有较大选择空间的MCS。第十页，共一百七十二页，2022年，8月28日Classificationbyfunction克隆载体:

克隆一个基因或DNA片断表达载体:用于一个基因的蛋白表达整合载体:把一个基因插入到染色体组中第十一页，共一百七十二页，2022年，8月28日载体的来源质粒载体噬菌体载体柯斯质粒载体真核细胞克隆载体第十二页，共一百七十二页，2022年，8月28日质粒*受体细胞结构插入片断举例E.coli环状〈8*pUC18/19,T-载体pGEM-3z等λ噬菌体E.coli线状9-24kbEMBL系列，Λgt系列丝状噬菌体及噬菌粒E.coli环状〈10kbM13mp系列粘粒载体E.coli环状35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)E.coli环状≈300kbPeloBAC系列PAC(P1-derivedArtificialchromosome)E.coli环状100-2000kbPCYPAC1YAC(YeastArtificialchromosome)酵母细胞线性染色体100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳类细胞线性染色体〉1000kb病毒载体动物细胞环状SV40载体，昆虫杆状病毒载体穿梭载体动物细胞和细菌环状pSVK3质粒，PBV,Ti质粒不同种类载体的特征第十三页，共一百七十二页，2022年，8月28日二、质粒载体第十四页，共一百七十二页，2022年，8月28日质粒简介质粒载体的构建及类型表达型质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体其他重要的质粒载体本节主要内容第十五页，共一百七十二页，2022年，8月28日质粒的定义质粒的生物学特性质粒的分离与纯化影响质粒DNA产量的因素质粒简介第十六页，共一百七十二页，2022年，8月28日质粒是一种独立于细菌染色体外的小分子双链环状DNA（数千碱基对），一般大小约106~108D，可自身复制和表达，有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药性基因，所以质粒经过适当改选后便可成为良好的载体。作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工改造而成的，目前已有多种经改造的良好的质粒载体。质粒的定义第十七页，共一百七十二页，2022年，8月28日1、质粒DNA的构型SC型共价闭合环形DNA（cccDNA）OC型开环DNA（ocDNA）L型线性DNA（cDNA）2、不同质粒的分子量大小差异相当显著：106~108D

3、作为载体的质粒都含有三种共同的组分：复制基因（replicator）、选择性记号、克隆位点

质粒的生物学特性第十八页，共一百七十二页，2022年，8月28日4、质粒DNA编码着一些重要的非染色体控制的遗传性状。

抗性特征、代谢特征、修饰寄主生活方式的因子都等（见选择标记）第十九页，共一百七十二页，2022年，8月28日按接合转移功能分类主要基因按抗性记号分类非接合型质粒自主复制基因，生长大肠杆菌素基因Col质粒自主复制基因，抗菌素抗性基因R质粒(R因子)

接合型质粒自主复制基因，转移基因，细菌染色体区段F质粒（F因子）自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因Col质粒自主复制基因，转移基因，抗菌素抗性基因R质粒(R因子)自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因Ent质粒Tragenecanmakecellformpillisandcellularsurfacesubstancewhichmakeaconjugationbetweenhostandvector.Finallygeneticmaterialcanmovefromacelltoanother.5、质粒的的接合转移第二十页，共一百七十二页，2022年，8月28日5、质粒的的接合转移第二十一页，共一百七十二页，2022年，8月28日5、质粒的的接合转移第二十二页，共一百七十二页，2022年，8月28日Someplasmidswithouttragenebothhavebomsite(oriTsite)andmobgene.Theseplasmidsmayownmobilization.Thereasonisthefollowing:Theproductofmobgenecanopennon-conjugativeplasmidoriTsitewhichleadstonon-conjugativeplasmidmovingbytrageneproduct.6、质粒的迁移作用第二十三页，共一百七十二页，2022年，8月28日6、质粒的迁移作用第二十四页，共一百七十二页，2022年，8月28日低拷贝的质粒(1-3):严紧型复制控制的质粒(接合型)

高拷贝的质粒(10~60)：松弛型复制控制的质粒（非接合型）7.质粒DNA的复制类型第二十五页，共一百七十二页，2022年，8月28日在同一个大肠杆菌细胞，不能同时含有两种不同的质粒。也称为质粒的不相容性。是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。质粒的不亲合性分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。8、质粒的不亲合性第二十六页，共一百七十二页，2022年，8月28日质粒不相容性的分子机制第二十七页，共一百七十二页，2022年，8月28日质粒不相容性现象图解第二十八页，共一百七十二页，2022年，8月28日1、氯化铯密度梯度离心法；2、碱变性法；3、微量碱变性法。

质粒DNA的分离与纯化第二十九页，共一百七十二页，2022年，8月28日

质粒DNA占总DNA的1%～2%；在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子量的细菌染色体易断裂成线性片断，而质粒DNA分子量小，结构紧密仍保持完整的状态；染色剂溴化乙锭（EB）能掺入到DNA链的碱基中，导致链的解旋；而且形成的EB-DNA复合物中，EB含量越高，密度会越低。1.氯化铯密度梯度离心法第三十页，共一百七十二页，2022年，8月28日首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（SDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解。将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的大肠杆菌裂解液中，EB会嵌入到DNA链的碱基中去。在EB达到饱和时，进行氯化铯密度梯度离心。流程第三十一页，共一百七十二页，2022年，8月28日第三十二页，共一百七十二页，2022年，8月28日

根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来的。在pH值12.0～12.5范围内时，线性的DNA会被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会被变性。通过冷却或恢复中性pH值使之复性，线性染色体形成网状结构，而cccDNA可以准确迅速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒DNA2.碱变性法第三十三页，共一百七十二页，2022年，8月28日质粒载体的构建与类型质粒载体的构建质粒载体的选择性标记质粒载体的分类重要的大肠杆菌质粒载体其他重要的质粒载体质粒载体的稳定性问题第三十四页，共一百七十二页，2022年，8月28日Ⅰ.质粒载体的构建

第三十五页，共一百七十二页，2022年，8月28日新陈代谢特性；对大肠杆菌素E1的免疫性；抗菌素抗性；四环素抗性、氨苄青霉素抗性、链霉素抗性、卡那霉素抗性

大多数质粒本身带有抗菌素基因；抗菌素抗性记号便于操作、易于选择。Ⅱ.质粒载体的选择记号第三十六页，共一百七十二页，2022年，8月28日第三十七页，共一百七十二页，2022年，8月28日Ⅲ.质粒载体的分类第三十八页，共一百七十二页，2022年，8月28日高拷贝的质粒载体克隆的目的是为分离大量的高纯度的克隆基因低拷贝的质粒载体有些克隆的编码基因，其产物含量过高会严重的干扰寄主细胞的正常新陈代谢活动。编码表面结构蛋白质的一些基因、调节细胞基础代谢活动的蛋白质编码基因以及囊纤维化跨膜传导调节蛋白质编码基因等。Ⅲ.质粒载体的分类第三十九页，共一百七十二页，2022年，8月28日失控的质粒载体（runawayplasmidvectors）是一些低拷贝的质粒，其复制控制是温度敏感型的，也就是说在不同的温度下，拷贝数会有显著的变化。

pBEU1和pBEU2质粒，在30度下，每个寄主细胞只含有适量的拷贝数，当培养温度超过35度时，质粒的复制将失去控制，每个细胞中的拷贝数便持续上升。在这种高温环境下，细胞的生长和蛋白质的合成可按正常的速率持续2~3小时。最后得到超量的基因编码产物，细胞生长受抑制失去存活能力，积累的质粒DNA占细胞总DNA的50%。Ⅲ.质粒载体的分类第四十页，共一百七十二页，2022年，8月28日插入失活型质粒载体将外源DNA片断插入在质粒上会导致选择记号基因失活的位点，就有可能通过抗菌素抗性的筛选，大幅度的提高获得阳性克隆的机会。Example：在pBR329质粒载体的EcoR1位点插入外源片断，会使氯霉素抗性基因失活，在筛选的氯霉素敏感的转化子细胞群体中，含有插入片断的重组体质粒的几率会显著上升。

Ⅲ.质粒载体的分类第四十一页，共一百七十二页，2022年，8月28日正选择的质粒载体正向选择：应用只有突变体或重组体才能正常生长的培养条件进行选择。这种质粒载体具有直接选择记号并可赋予寄主细胞相应的表型。Ⅲ.质粒载体的分类第四十二页，共一百七十二页，2022年，8月28日Example：

质粒pKN80有来自Mu噬菌体DNA的EcoR1-C的片断，编码一种致死功能的kil基因。该质粒在Mu噬菌体的溶源菌株中正常复制；在非溶源菌株中是致死的。在HindIII或HpaI位点插入外源DNA片断后，会产生具Ampr表型的Mu噬菌体的非溶源的转化子菌株。第四十三页，共一百七十二页，2022年，8月28日正向选择质粒载体的条件限制：

1、需要特殊的寄主菌株或选择培养基

2、可使用的克隆位点少

3、假阳性水平高

4、不能够调节插入序列表达活性第四十四页，共一百七十二页，2022年，8月28日表达型的质粒载体表达载体：按特殊设计构建的，能使克隆在其中特定位点的外源真核基因的编码序列，在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体。Ⅲ.质粒载体的分类第四十五页，共一百七十二页，2022年，8月28日主要包括：大肠杆菌的启动子、及操纵位点序列、多克隆位点、转录及转译信号、质粒载体的复制起点及抗菌素抗性基因。待表达的真核基因编码序列被克隆在紧挨于启动子下游的多克隆位点上，而且必须是其编码的蛋白质氨基酸末端这一头靠近启动子方向插入，才能在启动子控制下进行有效的转录。第四十六页，共一百七十二页，2022年，8月28日第四十七页，共一百七十二页，2022年，8月28日 1、pSC101质粒载体；

2、ColE质粒载体；

3、pBR322质粒载体；

4、pUC质粒载体；

5.其它的重要的质粒载体Ⅳ.重要的大肠杆菌质粒载体第四十八页，共一百七十二页，2022年，8月28日（1）一种严谨型复制控制的低拷贝数的大肠杆菌质粒载体。平均每个寄主细胞仅有1~2个拷贝；（2）分子量9.09kb，（3）编码有一个四环素抗性基因（tetr

）。（4）有Hind

、EcoR、BamH、Sal、Xho、Pvu、、Sma7种核酸内切限制酶。其中在Hind

、BamH、Sma3个位点克隆外源DNA，都会导致tetr

基因失活。（5）是第一个真核生物的克隆载体。1.pSC101质粒载体第四十九页，共一百七十二页，2022年，8月28日第五十页，共一百七十二页，2022年，8月28日（1）松弛型复制控制的多拷贝的质粒，（2）能产生细菌素。细菌素对大肠杆菌的正常生命活动有抑制作用（复制、转录、转译能量代谢等）。但含有对细菌素的免疫基因。2.ColE1质粒载体

用ColE1质粒特征为基础建立的转化细胞系，存在一定的缺陷性：

1、应用大肠杆菌素免疫作为标记操作上不方便；

2、在细菌群体中，能够以相当高的频率自发的产生出抗菌素的突变体细胞。第五十一页，共一百七十二页，2022年，8月28日第五十二页，共一百七十二页，2022年，8月28日3.pBR322质粒载体“P”表示是一种质粒；“BR”表示两位主要构建者姓氏的头一个字母“F.Bilivar和R.L.Rodriguez”;“322”表示实验编号。pBR322的构建：为改进转化子筛选技术，并具有相对小的分子量、高拷贝数、外源基因插入不影响质粒的复制功能、多克隆位点（多种限制酶的单一切割位点）、质粒的稳定性（克服质粒的结合转移能力）

第五十三页，共一百七十二页，2022年，8月28日pBR322的构建过程第五十四页，共一百七十二页，2022年，8月28日pBR322的结构来源第五十五页，共一百七十二页，2022年，8月28日pBR322的形体图第五十六页，共一百七十二页，2022年，8月28日1、具有较小的分子量；

它的分子量为4363bp。克隆载体的分子量大小不要超过10kb。

2、具有较多的MSC和有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。

pBR322DNA分子中总共有24种核酸内切酶只具有单一的酶切识别位点。其中7种内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶切位点插入外源片断可以导致tetr

基因的失活；另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因有单一的识别位点。pBR322质粒载体的优点第五十七页，共一百七十二页，2022年，8月28日a.在pBR322质粒的BamH或SalI位点插入外源DNA片断，切断了tetr基因编码序列的连续性，使之失去活性，产生出AmprTets表型的重组pBR322质粒，转化入AmpsTets的大肠杆菌细胞。先涂布在含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出具Ampr菌落，再将它们涂布Example:于含四环素的选择性培养基上。插入外源片断的重组质粒不能在这种培养基上生长。第五十八页，共一百七十二页，2022年，8月28日b.在Pst或Sca识别位点插入外源片断会导致Ampr基因的失活，产生AmpsTetr表型的质粒。转化大肠杆菌之后，获得的重组子可以比较快的检测出来。其依据是Ampr表型的细胞可以合成β-内酰胺酶，它能使青霉素转变成青霉酮酸，而这种青霉酮酸能与碘结合。在含有可溶性淀粉和四环素的富裕培养基上选择转化子，经37度培养过夜后，在此平板上加入少量的碘指示剂溶液产生青霉素β-内酰胺酶Ampr的菌落，其周围的碘指示剂溶液变得明亮，而Amps菌落无此反应。第五十九页，共一百七十二页，2022年，8月28日c、具有较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后每个细胞中可积累1000~3000个拷贝。当加入蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个,此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。

第六十页，共一百七十二页，2022年，8月28日人们应用多克隆位点技术，在pBR322的基础上，组入了一个在其5’-端带有一段多克隆位点的lacZ’基因，而发展的具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。

4.pUC质粒载体第六十一页，共一百七十二页，2022年，8月28日

一种典型的pUC系列的质粒载体，包括以下四个部分：

1、来自pBR322质粒的复制起点（ori）；

2、氨苄青霉素抗性基因（ampr

）,但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不在含有原来的核酸内切限制酶的但识别位点。

3、大肠杆菌β-半乳糖基因（lacZ）的启动子及编码α-肽链的DNA序列，此结构称之为lacZ’基因；

4、位于lacZ’基因中的靠近5’-端的一段多克隆位点（MCS）区段。但它并不破坏该基因的功能。典型的pUC系列的质粒载体特征第六十二页，共一百七十二页，2022年，8月28日pUC质粒载体的形体图第六十三页，共一百七十二页，2022年，8月28日具有较小的分子量和更高的拷贝数;

仅保留了pBR322的氨苄青霉素抗性基因和复制起点；在操作过程中复制起点内部发生了自发突变造成了基因rop的缺失，它是控制质粒的特殊因子，从而使拷贝数增加，平均每个细胞500~700个拷贝。适用于组织化学检测重组体；

具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ’基因，所编码的α-肽链可参与α-互补作用，用Xgal显色对重组子进行鉴定，而pBR322质粒的重组子要进行两步的选择。具有多克隆位点MCS区段．

方便具有不同粘性末端的外源片断的插入。pUC质粒载体的优点第六十四页，共一百七十二页，2022年，8月28日蓝白斑筛选的原理第六十五页，共一百七十二页，2022年，8月28日丧失迁移功能的质粒载体能在体外转录克隆基因的质粒载体穿梭质粒载体Ⅴ.其它的重要的质粒载体第六十六页，共一百七十二页，2022年，8月28日拥有较高水平的拷贝数,平均每个大肠杆菌寄主细胞可达30~45份;失去了bom位点，即便在共存的F质粒提供转移装置的条件下，也不可能发生迁移作用。丧失迁移功能的质粒载体第六十七页，共一百七十二页，2022年，8月28日第六十八页，共一百七十二页，2022年，8月28日pGEM-3Z是一种与pUC系列十分类似的小分子的质粒载体，总长度2743bp，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个lacZ’基因。pGEM-3Z与pUC质粒之间的主要区别是，它具有两个来自噬菌体的启动子，即T7启动子和SP6启动子，它们为RNA聚合酶的附着作用提供了特异的识别位点。能在体外转录克隆基因的质粒载体第六十九页，共一百七十二页，2022年，8月28日

现在以发展出了一大批在多克隆位点区附近参入噬菌体RNA聚合酶启动子的简单的质粒载体，它们都是由pUC系列载体派生而来的。

噬菌体的RNA聚合酶，所合成的RNA转录本除了可作为杂交探针之外，在兔网织红细胞裂解物转译体系或在麦胚无细胞转移体系中进行体外蛋白质的合成。在反应混合物中加入m7GpppG，能形成5’的帽子结构，进行有效的蛋白质合成。

第七十页，共一百七十二页，2022年，8月28日

是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞存活和复制的质粒载体。穿梭质粒载体（shuttleplasmidvector

）e.g.早期发现的大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒载体、大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体、大肠杆菌-牛乳头瘤病毒。迄今还没有发展出适用的大肠杆菌-植物细胞穿梭载体。第七十一页，共一百七十二页，2022年，8月28日第七十二页，共一百七十二页，2022年，8月28日1、质粒载体不稳定性的类型结构的不稳定性：主要指由转位和重组作用所引起的质粒DNA的重排与缺失。分离的不稳定性：在细胞分裂过程中，有一个子细胞没有获得质粒DNA拷贝，并最终增值成为无质粒的优势群体。六、质粒载体的稳定性问题第七十三页，共一百七十二页，2022年，8月28日 DNA的缺失、插入和重排是造成质粒载体结构不稳定性的原因。质粒的自发缺失：同向重复短序列之间的同源重组。寄主染色体及质粒载体上的IS因子或转位因子也会引起结构的不稳定性。结构的不稳定性

细胞分裂过程中发生的质粒不平均的分配，也是导致质粒不稳定性的重要原因，将这种起因于质粒的缺陷性分配所造成的质粒的丢失现象，叫作质粒分离的不稳定性。分离的不稳定性第七十四页，共一百七十二页，2022年，8月28日质粒分离方式要使质粒能够稳定的遗传，必须保证平均每个世代质粒最少复制一次；并且，细胞分裂过程中，质粒复制的拷贝必须分配到两个子细胞中去。主动分配：a.平均分配机理：使每个子细胞刚好获得一半数目的质粒拷贝b.配对位点分配机理：只有一半数目的质粒呈主动分配，其余是随机分配的。随机分配：细胞分裂过程中质粒拷贝数在两个子细胞之间是随机分配的。第七十五页，共一百七十二页，2022年，8月28日新陈代谢负荷对质粒载体稳定性的效应质粒载体会加重寄主细胞的代谢负荷；外源克隆基因的产物对寄主细胞的毒害作用。拷贝数差度对质粒载体稳定性的影响差度：不同细胞个体之间的质粒载体的拷贝数的差异程度，可影响质粒载体丢失的速率。差度越大稳定性越差；差度越小稳定性越高。2.影响质粒载体稳定性的主要因素第七十六页，共一百七十二页，2022年，8月28日在野生型的大肠杆菌细胞中，质粒重组的重要结果是形成质粒寡聚体，它也是造成质粒载体不稳定的原因之一。决定大肠杆菌培养物中含质粒寡聚体细胞的比例有两种主要因素：

质粒DNA分子之间的重组频率；含质粒寡聚体细胞的生长速率。重组质粒二聚体一旦形成，便会以高出质粒单体分子两倍的速度进行复制，从而导致质粒寡聚体的克隆增殖，即所谓的二聚体灾难（dimercatastrophe）3、寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应第七十七页，共一百七十二页，2022年，8月28日三、噬菌体载体第七十八页，共一百七十二页，2022年，8月28日湿菌体的一般特性λ湿菌体载体单链DNA噬菌体载体噬菌粒载体柯斯质粒载体本节主要内容第七十九页，共一百七十二页，2022年，8月28日第八十页，共一百七十二页，2022年，8月28日可脱离寄主细胞生存，但不能进行复制。除了对寄主的依赖性，还具备其它的功能：

1、保护自己的核苷酸分子（DNA、RNA）免遭环境化学物质的破坏；

2、将其核苷酸分子注入到被感染的细菌细胞；

3、将被感染的细菌细胞转变成制造噬菌体的体系，从而长生出大量的子代噬菌体颗粒；

4、使感染的细菌细胞释放出子代的噬菌体颗粒Ⅰ.噬菌体的一般生物特性第八十一页，共一百七十二页，2022年，8月28日1.噬菌体的结构和其核酸类型：

结构：无尾部结构的二十面体型、具尾部结构的二十面体型、丝状体型（M13phage）核酸类型：最常见的是双链线性DNA、双链环形DNA、单链环形DNA、单链线形DNA、

ssRNA。Ⅰ.噬菌体的一般生物特性第八十二页，共一百七十二页，2022年，8月28日

不同的噬菌体之间的核酸分子量的差异也是比较大的。大分子量的噬菌体生命周期比较复杂；对寄主的依赖性较低。有些噬菌体的DNA碱基不是由标准的A/T/C/G组成的。

Example：

T4噬菌体DNA没有C碱基，取代的是5-羟甲基胞嘧啶（HMC）;SP01噬菌体DNA中没有T碱基，取代的是5-羟甲基尿嘧啶（HMU）。Ⅰ.噬菌体的一般生物特性第八十三页，共一百七十二页，2022年，8月28日

2.噬菌体的溶菌生命周期噬菌体的生命周期分为溶菌周期和溶源周期只具有溶菌生长周期的噬菌体颗粒叫烈性噬菌体。烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：吸附吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上注入噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞转变被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所合成大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质组装包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒释放合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来

Ⅰ.噬菌体的一般生物特性第八十四页，共一百七十二页，2022年，8月28日第八十五页，共一百七十二页，2022年，8月28日3.噬菌体的溶源生命周期溶源生长周期：是指在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体的DNA是整合到寄主细胞染色体DNA上，成为它的一个组成部分。Ⅰ.噬菌体的一般生物特性

现知道只有双链DNA的噬菌体才具有溶源周期第八十六页，共一百七十二页，2022年，8月28日温和噬菌体：既能进入溶菌生命周期又能进入溶源生命周期的phage。溶源性细菌：具有一种完整的噬菌体基因组的细菌(带有原噬菌体的细菌)溶源化：用温和噬菌体感染细菌培养物使之形成溶源性细菌的过程整合：噬菌体的DNA是被包容在寄主细胞染色体DNA中原噬菌体：在溶源细菌内存在的整合的或非整合的噬菌体超感染免疫性：溶源性细菌不能够被头一次感染并使之溶源化的同种噬菌体再感染。Ⅰ.噬菌体的一般生物特性第八十七页，共一百七十二页，2022年，8月28日溶源周期的主要特征：

λ噬菌体和P1噬菌体λ噬菌体的特征：噬菌体的DNA分子注入细菌细胞经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是转录活性便被一种阻遏物所关闭噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，变成原噬菌体细菌继续生长、增殖，噬菌体的基因作为细菌染色体的一部分进行复制。Ⅰ.噬菌体的一般生物特性第八十八页，共一百七十二页，2022年，8月28日第八十九页，共一百七十二页，2022年，8月28日Ⅰ.噬菌体的一般生物特性第九十页，共一百七十二页，2022年，8月28日溶源噬菌体的诱发：依赖于阻遏基因与操纵基因的相互作用。阻遏物被一种蛋白酶切割，失活，使噬菌体转录。需要删除酶（excisionase）将噬菌体的DNA从大肠杆菌染色体上删除下来，使之形成环形的DNA分子，恢复溶源周期开始时的状态，进入溶菌周期。Ⅰ.噬菌体的一般生物特性第九十一页，共一百七十二页，2022年，8月28日λ噬菌体载体第九十二页，共一百七十二页，2022年，8月28日

大肠杆菌噬菌体λ为长尾噬菌体科，是一类中等大小的大肠杆菌病毒，其基因组为双链线状DNA，由48502对碱基组成，分子量3.2×107，约50个基因，特点是相关基因成簇排列，形成若干个操纵子。基因组两端为粘性末端，中间有相当长的DNA片段是裂解生长非必需的，这就为其作为外源基因的克隆载体提供了方便。λ噬菌体由头和尾构成，其基因组组装在头部蛋白质外壳内部，其序列已被全部测出。感染时吸附位点为细胞壁。属温和性感染；感染的DNA环化并整合于宿主基因组中。以θ环双向复制，然后通过滚环机制单向复制。用于感染大肠杆菌的λ噬菌体改造成的载体应用最为广泛。第九十三页，共一百七十二页，2022年，8月28日AWBCDEFZUVGHMLKIJb2

cIcrocIIOPQSRattintxisgamredcIIINCOSCOS

头部基因尾部基因功能不明区

溶源化重组早期控制阻遏DNA合成溶菌生长非必须区段cI基因：溶源过程控制基因。λ噬菌体的基因组结构各基因以基因簇的形式存在，有序转录第九十四页，共一百七十二页，2022年，8月28日早期：确立溶菌反应

中期：基因转录结果导致DNA的复制与重组

晚期：基因转录结果导致DNA被包装为成熟蛋白第九十五页，共一百七十二页，2022年，8月28日第九十六页，共一百七十二页，2022年，8月28日λ

噬菌体的复制与重组第九十七页，共一百七十二页，2022年，8月28日构建λ噬菌体载体的基本原理第九十八页，共一百七十二页，2022年，8月28日1.插入式载体一种只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点的派生载体。2.替换型载体（取代型载体）具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的λDNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代。第九十九页，共一百七十二页，2022年，8月28日cI基因插入失活：如λgt10、λNM1149等载体，在cI基因上有EcoRI及HindIII的酶切位点。外源基因插入后将导致cI基因的失活。cI基因编码的阻遏蛋白可使感染phage的细菌进入溶源化，cI基因失活后将导致噬菌体不能溶源化，产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。LacZ基因插入失活：如charon16A载体，在非必须区段引入lacZ基因，在lacZ基因上有EcoRI位点，插入失活后利用X-gal法筛选（蓝白斑筛选）。插入式载体λ噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所以一般用于cDNA文库或基因组文库的构建。第一百页，共一百七十二页，2022年，8月28日第一百零一页，共一百七十二页，2022年，8月28日

野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的，外源DNA可以取代这一片段，例如Charon4A、λEMBL3/4、Charon40等载体，这些载体是用Lac5（乳糖操纵子的大部分系列，包括完整的LacZ）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac5作为选择标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解E.coli，形成空斑。换型噬菌体λ是使用最广泛的载体。替换式载体第一百零二页，共一百七十二页，2022年，8月28日λ替换型载体（取代型载体）外源DNA取代噬菌体染色体中对于噬菌体的感染和复制非必要的片段(~20kb)高感染效率(109

转化株/ug载体DNA,比质粒高100倍)e.g.EMBL3,DASH第一百零三页，共一百七十二页，2022年，8月28日第一百零四页，共一百七十二页，2022年，8月28日应用适当的核酸内切酶消化λ载体，除去可取代的DNA片段；将上述所得的

λDNA载体臂同外源DNA片段的连接；对重组体的λDNA分子进行包装和增殖，以得到有感染性的λ重组噬菌体替换型载体克隆外源DNA的步骤第一百零五页，共一百七十二页，2022年，8月28日λ取代载体组装连接侵染第一百零六页，共一百七十二页，2022年，8月28日第一百零七页，共一百七十二页，2022年，8月28日第一百零八页，共一百七十二页，2022年，8月28日第一百零九页，共一百七十二页，2022年，8月28日第一百一十页，共一百七十二页，2022年，8月28日第一百一十一页，共一百七十二页，2022年，8月28日体外包装λ噬菌体DNA体外重组后，一般必须经过体外包装，然后以噬菌体感染的方式将重组DNA导入E.coli细胞内。这是因为以感染(infection)方式导入细胞的频率可达106~108/μgDNA，而以转染(translation)的方式导入的频率仅为103~105/μgDNA。 λ噬菌体的包装限制为野生噬菌体DNA（约48.5kb）的75%~105%。转染效率低的原因：在DNA的体外连接反应中，载体分子同外源DNA片段之间的结合，完全是按一种随机的方式进行的。由此形成的各种重组体分子中有相当的比例是没有活性的。这样的分子不能转染寄主细胞，因而致使转染效率明显下降。第一百一十二页，共一百七十二页，2022年，8月28日

由于λ噬菌体包装时，当DNA的长度短于野生型的78%或超过105%时，噬菌体的活性就急剧下降。因此只包装它的野生型DNA（48.5KB）的75%~105%左右的ＤＮＡ，要求λ载体DNA和外源DNA长度之和在39～53kb之间。插入式载体可携带的外源ＤＮＡ片段较替换式为小。包装限制第一百一十三页，共一百七十二页，2022年，8月28日体内包装第一百一十四页，共一百七十二页，2022年，8月28日 Charonbacteriophage，是等人于1977年在λ噬菌体基础上发展出来的一种特殊的噬菌体载体。既有插入型；又有替换型在基因工程实验中的用途十分广泛承受外源DNA的能力：几个kb到23kb凯伦噬菌体载体第一百一十五页，共一百七十二页，2022年，8月28日（左右臂连接）（三段自身连接）（插入片段）

第一百一十六页，共一百七十二页，2022年，8月28日凯伦噬菌体载体进行基因克隆的程序分离线性得凯伦噬菌体载体DNA；限制酶消化载体，产生两条噬菌体臂断和一条中央区段；分离这三个片断；分离得噬菌体得两条臂段与外源DNA片断混合退火，加入DNA连接酶连接；重组的DNA分子同包装蛋白质混合温育，获得具有感染性能的噬菌体颗粒；包装产物涂布在敏感细菌平板上，检测含外源DNA插入的重组噬菌体。第一百一十七页，共一百七十二页，2022年，8月28日第一百一十八页，共一百七十二页，2022年，8月28日第一百一十九页，共一百七十二页，2022年，8月28日Ⅲ、单链DNA噬菌体载体

(M13)第一百二十页，共一百七十二页，2022年，8月28日M13、f1、fd(亲缘关系相近的大肠杆菌丝状噬菌体)优越性：1.单链DNA噬菌体的复制，是以双链环形的DNA为媒介的，这种复制形式的DNA简称RFDNA；2.不论是RFDNA还是ssDNA都能感染大肠杆菌；3.单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其DNA的多寡制约的，不存在包装限制问题；4.容易测定外源DNA片断的插入取向；5.可产生含外源片断的单链DNA分子。

单链DNA噬菌体载体第一百二十一页，共一百七十二页，2022年，8月28日 M13是一种含单键（+）DNA（ssDNA）的丝状大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为6.4kb。这类载体主要用来获得大量的单链ＤＮＡ片段，这种单链ＤＮＡ片段在遗传学研究中主要用来测定ＤＮＡ序列（sanger双脱氧法）、基因的定点突变研究、异源双链DNA的分析等。M13噬菌体载体第一百二十二页，共一百七十二页，2022年，8月28日M13单链DNA的复制型（RF，replicativeform）是呈双链环形，此时的DNA，不会插入细菌基因组，持续复制，当积累到100-200个拷贝后，噬菌体DNA编码的正链特异结合蛋白很快就阻止了负链的进一步生成，但以负链为模板的正链合成并未受到影响。大量游离的正链DNA很快参入到外壳蛋白中形成了大量新的噬菌体颗粒。M13噬菌体的特点第一百二十三页，共一百七十二页，2022年，8月28日感染Ecoli后，在宿主细胞内会形成双链的复制型ＤＮＡ（replicationformDNA,RFDNA）。可以象质粒ＤＮＡ那样在体外进行纯化和操作。成熟的噬菌体颗粒仅能感染E.coli的F+细胞，这是因为这种噬菌体的感染位点在性散毛上。但是无论是RFDNA或ssDNA都能转染E.coli的F+或F-细胞。噬菌体颗粒的大小是受其ＤＮＡ的大小制约的，这一点正好与λ噬菌体相反。所以M13噬菌体并不存在包装限制的问题。M13噬菌体的特点第一百二十四页，共一百七十二页，2022年，8月28日M13单链DNA噬菌体的生命周期第一百二十五页，共一百七十二页，2022年，8月28日第一百二十六页，共一百七十二页，2022年，8月28日第一百二十七页，共一百七十二页，2022年，8月28日PhageM13replicationinthehostcell:+RNA

polDNApolIII±RFNickedbygene2protein+ss-Rollingcirclereplication,thencutandligateCoatedwithgene5proteinGene5proteinisreplacedbygene8proteinect.LinearM13phagereleasedfromthecell.第一百二十八页，共一百七十二页，2022年，8月28日第一百二十九页，共一百七十二页，2022年，8月28日具有多克隆位点(MCS)，方便克隆。许多M13载体的多克隆位点与质粒载体pUC序列的多克隆位点是相同的，在克隆位点选择上更为方便。

可以定向地克隆DNA片段，克隆在M13RFDNA分子上的双链DNA片段，到了子代噬菌体便成了单链的形式。所以如果要同时分离ＤＮＡ分子中的双链，则需要两种独立的克隆。根据M13的生物学特性知道，M13子代噬菌体中总是只含有（＋）链，所以M13载体克隆的外源DNA片段在子代噬菌体中究竟是含有DNA分子中的哪条链，则完全取决于外源ＤＮＡ克隆时的取向。这样一来，为分别分离外源ＤＮＡ分子的两条链带来一定的麻烦，解决这一问题的一个行之有效的方法就是定向克隆技术。M13载体第一百三十页，共一百七十二页，2022年，8月28日第一百三十一页，共一百七十二页，2022年，8月28日1.在这类载体的基因组中有一条饰变的β-半乳糖苷酶基因片段（Hind片段），其中插入了一段具有密集的多克隆位点的序列；

2.M13载体系列是应用基因工程技术成对地构建的，可有效地克隆双链DNA分子中的每一条链。M13载体系列的优点第一百三十二页，共一百七十二页，2022年，8月28日第一百三十三页，共一百七十二页，2022年，8月28日M13克隆载体分子结构图第一百三十四页，共一百七十二页，2022年，8月28日Ⅳ、噬菌粒载体第一百三十五页，共一百七十二页，2022年，8月28日由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列。它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便DNA的操作，可在细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体。噬菌粒载体第一百三十六页，共一百七十二页，2022年，8月28日具有较小分子量的共价、闭合、环形的基因组DNA，可克隆10kb的外源DNA片段，并易于进行分离与操作；编码一个ampr基因作为选择记号，因此只有携带pUC118或pUC119噬菌粒载体的大肠杆菌转化子细胞，才能够在含有氨苄青霉素的培养基中生长，便于转化子的选择；拷贝数含量高，每个寄主可高达500个，所以只要用少量的大肠杆菌细胞培养物，便可制备出大量的载体DNA；存在着一个多克隆位点区，因此许多种不同类型的外源DNA片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上；常用的噬菌粒载体pUC118和pUC119第一百三十七页，共一百七十二页，2022年，8月28日由于多克隆位点区阻断了大肠杆菌lacZ基因的5’-端编码区，可按照IPTG组织化学显色反应试验，筛选重组子；lacZ基因是置于lac启动子的控制之下，这样插入的外源基因便会以融合蛋白质的形式表达；含有质粒的复制起点，在没有辅助噬菌体的情况下，克隆的外源基因可以像质粒一样按常规的方式，复制形成大量的双链DNA分子带有一个M13噬菌体的复制起点，在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中，可以合成出单DNA拷贝，并包装成噬菌体颗分泌到培养基中；常用的噬菌粒载体pUC118和pUC119第一百三十八页，共一百七十二页，2022年，8月28日在pUC118和pUC119这两个载体中，多克隆位点区的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它们当中的一个可转录克隆基因的正链DNA，另一个则可转录出负链DNA；可以直接对克隆的DNA片断进行核苷酸的序列测定，免去了从质粒载体到噬菌体的这一烦琐的亚克隆步骤。常用的噬菌粒载体pUC118和pUC119第一百三十九页，共一百七十二页，2022年，8月28日第一百四十页，共一百七十二页，2022年，8月28日基本结构：

1.在多克隆位点的两侧，有一对T3和T7噬菌体的启动子，可以定向指导外源基因的转录活动；

2.同时具有一个单链噬菌体M13或f1的复制起点和一个来自ColE1质粒的复制起点，在不同的情况下，可以采取不同的复制形式，分别合成单链或双链的DNA；

3.编码有一个胺苄青霉素抗性基因，供作转化子记号；

4.含有lacZ基因，可用Xgal-IPTG组织显色反应法筛选噬菌粒载体。pBluescript噬菌粒载体第一百四十一页，共一百七十二页，2022年，8月28日T7T3用于体外转录第一百四十二页，共一百七十二页，2022年，8月28日第一百四十三页，共一百七十二页，2022年，8月28日噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时,外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。到目前为止，人们已开发出了单链丝状噬菌体展示系统、λ噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统等数种噬菌体展示系统。噬菌体展示技术第一百四十四页，共一百七十二页，2022年，8月28日噬菌体展示技术第一百四十五页，共一百七十二页，2022年，8月28日噬菌体展示技术第一百四十六页，共一百七十二页，2022年，8月28日Ⅴ、柯斯质粒载体第一百四十七页，共一百七十二页，2022年，8月28日cosmid载体：也称粘粒、柯斯载体。这是一类用于克隆大片段DNA的载体，它是由λ噬菌体的cos（cohesive）末端及质粒（plasmid）重组而成的载体。cosmid载体带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记以及λ噬菌体用于包装的cos末端等，因此该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。柯斯质粒载体设计构建的柯斯质粒一般长4～6kb。其上的cos位点的一个重要作用是识别噬菌体的外壳蛋白。凡具有cos位点的任何DNA分子只要在长度相当于噬菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体λ的颗粒。因此，插入柯斯质粒的外源DNA可大于40kb。重组的柯斯质粒可象噬菌体λ一样感染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制。第一百四十八页，共一百七十二页，2022年，8月28日具有λ噬菌体的特性；具有质粒载体的特性；具有较高容量的克隆能力；具有与同源性序列的质粒进行重组的能力柯斯质粒载体的特点第一百四十九页，共一百七十二页，2022年，8月28日柯斯质粒pHC79系由质粒pBR322和噬菌体λ的cos位点的一段DNA构成全长4.3kb第一百五十页，共一百七十二页，2022年，8月28日第一百五十一页，共一百七十二页，2022年，8月28日第一百五十二页，共一百七十二页，2022年，8月28日Ligationtocleavedcosmidvectormoleculescanproducevector-targetconcatemers,resultinginalargeexogenousDNAfragmentflankedbycossequences.第一百五十三页，共一百七十二页，2022年，8月28日第一百五十四页，共一百七十二页，2022年，8月28日采用柯斯质粒作载体的困难①载体自身只相当于可以插入片段的1/10左右，因此往往会出现载体同载体自身连接，结果在一个重组分子内可有几个柯斯质粒载体连在一起。但用碱性磷酸酶处理，可阻止载体分子自身连接；第一百五十五页，共一百七十二页，2022年，8月28日②大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子，结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一个片段，会影响实验结果的分析，后来专门选出30～45kb的外源DNA插入载体DNA，此时，每个载体只可能插入一个外源片段，因为如果二个片段，则将超过包装成噬菌体颗粒的限度；第一百五十六页，共一百七十二页，2022年，8月28日③细菌的菌落体积远大于噬菌斑，因此如用柯斯质粒制备基因文库，则筛选所需的含某一DNA片段的菌落很费时间。现虽建立了高密度菌落筛选法，但由于柯斯质粒制成的基因文库常常不太稳定，插入的大片段外源DNA有可能通过同宿主基因组交换而致丢失等，所以最常使用的还是噬菌体载体。第一百五十七页，共一百七十二页，2022年，8月28日四、人工载体第一百五十八页，共一百七十二页，2022年，8月28日酵母人工染色体载体（yeastartificialchromosome,YAC）细菌人工染色体 （bacterialartificialchromosome,BAC）动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录病毒）第一百五十九页，共一百七十二页，2022年，8月28日

人基因组十分庞大，约含4×109bp，建立和筛选人的基因组文库，要求有容量更大的载体，酵母人工染色体（yeastartificialchromosome,YAC）载体应运而生。YAC含有酵母染色体端粒（telesome）、着丝点(centromere)及复制起点等功能序列，可插入长度达200-500kb的外源DNA，导入酵母细胞可以随细胞分裂周期复制繁殖供作克隆，成为人基因组研究计划的重要第一百六十页，共一百七十二页，2022年，8月28日CEN1,centromeresequence;TEL,telomeresequences;ARS1,autonomousreplicatingsequence;Amp,geneconferringampicillin-resistance;ori,originofreplicationforpropagationinanE.colihost.Thevectorisusedwithaspecializedyeasthostcell,AB1380,whichisredcoloredbecauseitcarriesanochremutationinagene,ade-2,involvedinadeninemetabolism,resultinginaccumulationofaredpigment.However,thevectorcarriestheSUP4gene,asuppressortRNAgenewhichovercomestheeffectoftheade-2ochremutationandrestoreswild-typeactivity,resultingincolorlesscolonies.Thehostcellsarealsodesignedtohaverecessivetrp1andura3alleleswhichcanbecomplementedbythecorresp