代谢工程概述

主要参考书代谢工程，赵学明等译，化学工业出版社，北京。2003年12月Biotechnology,2nded.Vol.1;BiologicalFundamentals.RehmH-JBBiotechnology,3ndedVol.3;Bioprocessing.RehmH-JB途径工程，张惠展，2003基因工程原理，吴乃虎，2004代谢工程，张蓓等，天津大学出版社，200301绪论代谢工程概述授课教师：李强本章内容§1.1代谢工程的产生和概念的演变§1.2代谢工程的研究内容§1.3代谢工程的应用领域和前景第一节代谢工程的产生和概念的演变现代生物技术手段主要包括基因工程(GeneEngineering)、细胞工程(CellEngineering)、发酵工程(FermentationEngineering)、酶工程(EnzymeEngineering)和生化工程(BiochemicalEngineering)，现代生物技术在化工、医药卫生、农林牧渔、轻工食品、能源和环境等领域都将发挥重要作用，可促进传统产业的改造和新型产业的形成，对人类社会产生深远影响。其中发酵工程是生物技术的重要组成部分，是生物技术转化成产品的重要环节。20世纪90年代提出的代谢工程发展迅速，被视为继传统的蛋白质多肽单基因表达（第一代基因工程）、基因定向突变（第二代基因工程）之后的第三代基因工程。代谢研究的产生和发展历史微生物发酵已经有几千年的历史。早在2000年以前，人们就开始利用微生物进行白酒、黄酒、清酒的发酵，此时的发酵为天然发酵时代。20世纪40年代，随着抗生素青霉素的发酵生产的大规模进行，开始了现代发酵工业时代。通过自然选择的方法，人们用10-6的突变几率来筛选所谓的高产菌株。由于没有代谢控制发酵理论作为指导，直到20世纪60年代现代发酵工业仍处于盲目阶段。1957年，日本的木下等人开始了谷氨酸的发酵研究。随着各国对代谢发酵理论的深入研究，许多国家转向发酵菌株本身的研究，获得了许多的氨基酸高产菌株。随后，核酸类物质发酵生产菌也以代谢控制发酵理论为指导进行选育，并奋起直追成为后起之秀。早期的代谢研究主要内容*早期研究中侧重应用过程中采用的方法及所达到的目标，通常是对细胞特定的代谢途径进行改造。**代谢控制发酵就是利用遗传学的方法或生物化学方法，人为地在DNA分子水平上改变和控制微生物的代谢，使目的产物大量的生成、积累的发酵。代谢控制发酵的核心为：解除微生物代谢控制机制，打破微生物正常的代谢调节，人为地控制微生物的代谢。随着代谢控制发酵理论的日臻完善，目前已发展出一个重要的研究分支——代谢工程。它是近年来分子生物学、生物化学、化学工程学和计算机科学的发展与交差的产物，从而使生物技术突飞猛进的发展，使有关的研究进入了细胞水平。从细胞的代谢途径出发，运用工程学原理进行代谢调控，使之向产物积累的方向发展，由此创建了一个新兴的领域，即“代谢工程”。途径工程Pathwayengineering利用DNA重组技术修饰各种代谢途径，提高特定代谢物的产量1988，Macquitty代谢工程Metabolicengineering利用DNA重组技术优化细胞酶活、运输和调控功能，提高细胞活力1991，Bailey代谢途径工程Metabolicpathwayengineering生化途径的修饰、设计与构建1991，Tongetal代谢工程Metabolicengineering利用DNA重组技术对代谢进行目的性修饰1993，Cameron代谢工程/代谢设计Pathwayengineering/Metabolicdesign改造细胞代谢途径，提高提高天然最终产物产量或合成新产物1994，pieperberg**代谢工程概念演变代谢工程Metabolicengineering对生化反应的代谢网络进行目的性修饰1994，Gregory代谢工程Metabolicengineering为达到所需目标对活细胞的代谢途径进行修饰1996，william代谢工程Metabolicengineering利用分子生物学原理系统分析代谢途径，设计合理的遗传修饰战略，从而优化细胞生物学特性1999，koffasl**代谢工程的现代概念代谢工程也被人们成为“途径工程”，它属于基因工程的一个重要的分支。它应用重组DNA技术和应用分析生物学相关的遗传手段，进行有精确目标的遗传操作，改变酶的功能输送体系的功能，以改进细胞某些方面的代谢活性的整套操作（包括代谢分析、代谢设计、遗传操作、目的代谢活性的实现）是一种生物化学反应代谢网络有目的的修饰。代谢工程的一些基本定义底物：培养基质中的化合物，是能被细胞进一步代谢或直接利用构成细胞组分。碳源、氮源、能源物质以及满足细胞功能必须的各种矿物质元素均属于细胞代谢的底物。代谢产物：由细胞合成的化合物，可以是初级代谢产物（二氧化碳、乙醇等），也可以是次级代谢产物或者蛋白质。生物基质要素：构成生物质大分子池的一类物质，包括DNA、RNA、蛋白质等代谢工程的一一些基本定义义代谢流和碳骨骨架物质流：：代谢物在代代谢途径中流流动形成代谢谢流。在代谢谢工程领域代代谢流往往是是指骨架物质质流。代谢主流：在在一定的培养养条件下，代代谢物再代谢谢网络中流动动，流量相对对集中的代谢谢流叫做该条条件下的代谢谢主流。代谢谢途径的延伸伸和改变都会会改变代谢主主流，从而实实现新基质的的利用和新产产品的开发。。代谢主流的的测定是代谢谢工程的重要要组成部分。。代谢工程的一一些基本定义义载流途经：代代谢主流流经经的代谢途径径为主要载流流途经，简称称载流途经。。在代谢工程程研究中载流流途经是指碳碳流在代谢网网络中通过的的主要途径。。代谢主流的变变动性和选择择性：生物细细胞的代谢主主流处于不断断的变化之中中，其方向、、流量甚至代代谢主流的载载流途经都可可能发生变化化。这就是代代谢主流的变变动性和代谢谢主流对代谢谢网络途径的的选择性。这这种变动和选选择的根据在在于生物细胞胞的遗传物质质，选择的原原因在于细胞胞所处的环境境条件的变化化。代谢工程的一一些基本定义义代谢途径定义义为：一连串串可以进行的的并可观测的的生物化学反反应步骤，这这些反应步骤骤是以指定的的一组输入和和输出代谢物物所连结。代谢工程的一一些基本定义义代谢网络：在在代谢过程中中,通过特定定的生物化学学反应,一些些物质被分解解,从而为基基本的生命过过程提供能量量,同时合成成另一些生命命所必需的物物质。发生在在某物种的活活细胞内所有有代谢反应构构成了此物种种的代谢网络络。对蛋白质层次次的代谢网络络来说，一个个代谢物分子子就是一个节节点，而节点点之间的连结结则是生化反反应。大部分分的分子只参参加一种或两两种反应，但但少数分子参参与许多反应应，它们实际际上就是代谢谢流的集散中中心或通用代代谢物代谢工程的一一些基本定义义代谢通量定义义为：输入代代谢物反应生生成输出代谢谢物的速率。。胞内代谢通量量的确定称为为代谢通量分分析（metabolicfluxanalysis，MFA）），其在代代谢工程处于于中心地位。。代谢工程的一一些基本定义义代谢控制分分析(MCA)*ＭetabolicControlAnalysis，简简称ＭＣＡＡ代谢工程的的一个主要要目标就是是对代谢通通量控制的的理解。其是通过途途径中酶的的活性、代代谢物、效效应物和其其它参数所所施加的通通量控制程程度进行定定量表述。。代谢控制的的关键参数数确定以后后，人们需需要实施这这些变化从从而最有效效地达到预预定目标。。在实施通量量控制的策策略中，无无论采用哪哪种路线，，为获得最佳佳的结果，，都应将基基因修饰和和环境条件件改变结合合起来使用用。第二节代谢工程的的研究内容容代谢工程的的实质在于于对代谢网网络进行定定量分析，，并且在此此基础上进进行代谢改改造（代谢谢网络重组组），以最最大限度地地提高代谢谢产物的产产率。主要内容：：生物合成相相关代谢调调控和代谢谢网络理论论代谢流的定定量分析代谢网络的的重新设计计中心代谢作作用机理及及相关代谢谢分析基因操作代谢工程研研究的目的的通过重组DNA技术术构建具有有能合成目目标产物的的代谢网络络或具有高高产能力的的工程菌(细胞株、、生物个体体)并用于于生产是代代谢工程研研究的主要要目的。代谢网络理理论代谢网络理理论是把细细胞的生化化反应以网网络整体而而不是孤立立地考虑。。细胞代谢谢的网络由由上万种酶酶催化的系系列反应系系统、膜传传递系统、、信号传递递系统组成成，并且既既受精密调调节，又彼彼此互相协协调。代谢网络理理论是代谢谢工程研究究的基础代谢分析代谢分析是是代谢工程程的重要组组成部分，，它涉及代代谢流的定定量和定向向、研究细细胞内代谢谢物浓度的的反应工程程方法以及及细胞内稳稳态流分析析等代谢工程的的实质代谢工程最最重要的贡贡献在于其其强调在胞胞内条件下下代谢通量量及其调控控。代谢工程的的实质是：：将通量及及其控制进进行量化的的方法与分分子生物学学技术结合合起来，用用以执行所所建议的基基因修饰任任务。当反反复利用代代谢工程方方法时，它它就为在很很广范围内内系统改进进细胞的性性质提供了了一种强有有力的方法法。通量是细胞胞生理学的的一个基本本决定因素素，也是代代谢途径中中最重要的的参数。代谢工程与与随机诱变变的区别尽管定向性性从某种意意义上来讲讲是所有菌菌种改进工工作的固有有特性，但但是代谢工程与与随机诱变变相比，其其工作焦点点致力于定定向性，以以致其在目目标酶的选选择、实验验设计以及及数据分析析等方面都都起着重要要的作用。。另一方面，，细胞的定定向改进应应解释为合合理的途径径设计与修修饰，因此此在这个意意义上说，，代谢工程程与随机诱诱变是完全全不同的。。实际上,通过随机机诱变而得得到的性能能优良的菌菌株能够作作为关于途途径结构与与控制方面面重要信息息的来源，，这可经由由反向代谢谢工程获取取。代谢工程也也包括两个个明确的步步骤：即分分析与合成成。因为代代谢工程是是随着DNA重组而而出现的可可行技术，，所以最初初代谢工程程几乎都集集中于这个个领域的合合成方面:如在各种种宿主细胞胞中新基因因的表达、、内源酶的的扩增、基基因的缺失失或酶活性性的调节、、转录的或或酶的解除除调控等。。因此，代代谢工程在在很大程度度上曾是应应用分子生生物学的技技术体现，，而很少带带有工程方方面的内容容。*代谢工程程的主要特特征代谢工程的的主要特征征就是利用用DNA重重组技术，，重建代谢谢网络，改改变代谢流流及分支代代谢速度，，以改进代代谢产物及及蛋白类产产品，由于于外源DNA的引入入扩展了固固有的代谢谢途径，获获得了新的的化学物质质。改变转转化蛋白的的过程，减减少不必要要的废物。。**代谢工工程研究的的主要问题题提高细胞已已有的代谢谢途径中天天然产物的的产量改变细胞已已有代谢途途径，合成成新产物对不同细胞胞的代谢途途径进行整整合，构建建全新的代代谢途径优化细胞的的生物学特特性，如生生长速率、、耐受性等等。代谢工程的的研究手段段1.采用遗遗传学手段段的遗传操操作（1）基因因工程技术术的应用（2）常规规诱变技术术的应用2.生物合合成途径的的代谢调控控（1）生物物合成中间间产物的定定量生物测测定（2）共合合成法在生生物合成中中的应用（3）酶的的诱导合成成和分解代代谢产物阻阻遏（4）无机机磷对生物物合成的调调节3.研究生生物合成机机制的常用用方法（1）刺激激实验法（2）同位位素示踪法法（3）洗涤涤菌丝悬浮浮法（4）无细细胞抽提法法（5）遗传传特性诱变变法代谢工程的的研究方法法1分子生物物学方法：：构建特殊殊的基因转转移系统，，尤其对于于具有较高高生产价值值的微生物物，具有重重要意义。。例如Backman等利用用切割载体体获得Tyr营养突突变型，为为构建苯丙丙氨酸的生生产菌株奠奠定基础。。2分析化学学及检测方方法：代谢谢工程的研研究对象是是代谢途径径，因此必必须对代谢谢通路中的的一些酶及及产物进行行研究和分分析。传统统的分析通通路阻断的的手段有：：物质平衡衡、同位素素标记、分分析障碍突突变体等，，目前它们们仍然是必必不可少的的手段，而而核磁共振振、流氏细细胞术的应应用则为这这一领域的的发展增添添了新的活活力。3数学及计计算机工具具：研究代代谢工程不不仅需要遗遗传学知识识，而且需需要对宿主主菌的生化化代谢途径径和生理学学有深入的的理解，所所以将DNA数据库库的信息应应用于代谢谢工程并开开发出适合合的软件系系统是十分分必要的，，Karp等构建了了981个个生命体化化合物数据据库，为未未来的发展展奠定了基基础。人们们已在实验验的基础上上结合数学学和化学的的理论，发发展了一些些人工智能能程序。代谢工程的的基本过程程1、代谢分分析与代谢谢设计：代代谢工程的的研究对象象是代谢途途径，因此此必须对代代谢网络中中的一些酶酶及产物进进行研究和和分析。根根据代谢流流的分析确确定代谢设设计的合理理靶点，设设计合适的的代谢工程程操作手段段，对于靶靶点进行改改造，达到到改造代谢谢的目的。。代谢工程的的基本过程程2、基因操操作：代谢谢改造的核核心是在分分子水平上上对于靶基基因或基因因簇进的克克隆、表达达、修饰、、敲除、调调控、构建建特殊的基基因转移系系统以及重重组基因在在细胞染色色体DNA上的稳定定整合。代谢工程的的基本过程程3、效果分分析：通常常一次性的的代谢设计计和基因操操作往往不不能达到实实际生产所所要求的产产量、速率率或浓度。。因此对于于一次代谢谢改造的效效果分析，，得到本次次操作的优优点和缺点点数据，改改进缺陷，，综合优势势，进行下下一次代谢谢改造，经经过不断的的改造和分分析，可以以得到好的的结果。代谢工程的的三个基本本观点随着生物化化学、细胞胞生物学、、应用分子子生物学、、遗传工程程和代谢工工程的发展展，工业发发酵正在经经历一个从从技艺到科科学的重大大变化，正正在向微生生物生物工工程过渡。。在生物工工程受到广广泛重视的的今天，有有必要把微微生物(菌菌种选育)、微生物物学过程(发酵工艺艺)和微生生物学体系系(生物反反应器)作作为一个整整体，在科科学的水平平上对工业业发酵进行行重新审视视。代谢工程的的三个基本本观点从工业发酵酵的现状出出发，主要要根据对碳碳元素代谢谢及其控制制，菌种是是化能异养养型微生物物，产物是是微生物细细胞排出细细胞的代谢谢中间产物物的工业发发酵，提出出了3个基基本观点。。**代谢工程的的三个基本本观点1．1生生物能支撑撑观点微生物细胞胞是工业发发酵产物的的生产者，，微生物细细胞的生长长和维持需需要由其自自身的能量量转换机构构或从其他他形式的能能量转化形形成的生物物能来支撑撑。因此，，工业发酵酵具有生物物学属性。。1．2代代谢网络观观点由生化反应应网络和跨跨输送步骤骤组成的代代谢网络既既没有绝对对的起点，，也没有绝绝对的终点点。代谢网网络中任何何一种中间间产物(或或可借助生生物学、化化学方法与与代谢网络络联网的任任何一种化化合物)都都可能被开开发成为工工业发酵的的目的产物物或原料。。1．3细细胞经济观观点微生生物物细细胞胞的的经经济济性性是是在在自自然然选选择择的的过过程程中中逐逐渐渐形形成成的的。。野野生生的的(未未经经人人工工变变异异的的)微微生生物物细细胞胞在在自自然然选选择择的的过过程程中中逐逐渐渐形形成成竞竞争争型型的的细细胞胞经经济济。。而而工工业业发发酵酵往往往往要要以以目目的的产产物物的的生生产产为为主主导导，，调调整整代代谢谢网网络络中中的的代代谢谢流流，，构构建建一一种种导导向向型型细细胞胞经经济济。。从从竞竞争争型型细细胞胞经经济济的的转转变变取取决决于于遗遗传传和和环环境境因因素素的的信信息息导导向向，，这这种种导导向向必必须须遵遵循循细细胞胞经经济济的的基基本本运运行行规规律律。。代谢谢工工程程研研究究的的设设计计思思路路在具具体体的的设设计计和和操操作作中中,一一般般从从以以下下方方面面着着手手:1)提提高高通通向向目目标标产产物物的的代代谢谢流流;2)扩扩展展代代谢谢途途径径;3)构构建建新新的的代代谢谢途途径径。。提提高高通通向向目目标标产产物物的的代代谢谢流流的的手手段段通通常常有有:a、、增增强强催催化化限限速速反反应应的的酶酶的的表表达达量量或或活活性性,从从而而提提高高代代谢谢流流;b、、在在有有竞竞争争途途径径(如如分分支支代代谢谢途途径径)存存在在时时,阻阻断断有有害害的或或无无关关的的竞竞争争代代谢谢途途径径代代谢谢产产物物的的合合成成,从从而而达达到到改改变变代代谢谢流流,提提高高目目标标产产物物产产量量的的目目的的。。扩展展代代谢谢途途径径一一般般是是指指通通过过基基因因工工程程手手段段引引入入外外源源基基因因(簇簇)等等,使使原原有有代代谢谢途途径径进进一一步步向向前前或或向向后后延延伸伸,从从而而可可利利用用新新的的原原料料用用于于合合成成目目标标产产物物或或产产生生新新的的末末端端代代谢谢产产物物。。构构建建新新的的代代谢谢途途径径一一般般是是指指引引入入外外源源基基因因(簇簇)来来改改造造和和修修饰饰代代谢谢网网络络,使使细细胞胞从从不不能能合合成成某某种种代代谢谢产产物物转转变变为为能能够够合合成成此此代代谢谢产产物物。。常用用的的手手段段有有:a、、转转移移代代谢谢途途径径,即即将将多多个个特特定定代代谢谢途途径径中中的的相相关关基基因因(簇簇)转转移移到到无无这这些些基基因因的的菌菌株株(或或植植物物细细胞胞等等)中中,从从而而达达到到使使其其能能合合成成新新的的目目标标产产物物的的目目的的;b、、将将无无关关的的代代谢谢途途径径相相连连,形形成成新新的的代代谢谢途途径径,从从而而合合成成新新的的目目标标产产物物。。习题题ＭetabolicControlAnalysis，，简简称称ＭＭＣＣＡＡ第三三节节、、代代谢谢工工程程的的应应用用领领域域和和前前景景代谢谢工工程程和和微微生生物物发发酵酵工工业业要要解解决决的的根根本本问问题题是是:如如何何有有效效地地改改造造微微生生物物菌菌种种,使使其其高高效效地地发发酵酵生生产产各各种种产产品品。。代谢工程程是利用用基因工工程技术术改造细细胞的代代谢，以以改善细细胞的性性能的一一门新兴兴学科。。2003年美美国贝克克莱大学学J.Keasling，采采用酵母母细胞表表达天然然植物药药箐篙素素分子，，实现工工程微生生物代谢谢工程制制药。采采用系统统生物学学原理和和转基因因生物技技术、计计算机软软件辅助助设计技技术，将将细胞内内次生代代谢反应应链重新新设计、、人工合合成基因因与基因因调控网网络，从从而进入入了代谢谢工程、、基因工工程的合合成生物物学-系统统生物学学基础的的遗传工工程时代代。代谢工程程的主要要目标是是识别特特定的遗遗传操作作和环境境条件的的控制，，以增强强生物技技术过程程的产率率及生产产能力，，或对细细胞性质质进行总总体改性性。本书书最主要要的内容容包括途途径集成成和把代代谢通量量作为细细胞生理理学的基基本决定定因素来来考虑的的重要性性。代谢谢工程把把数学的的复杂性性减到最最小，并并同时提提供一些些必要的的补充说说明作为为不同数数学运算算的背景景材料发酵产品品代谢工程程研究的的第一步步必然是是先确定定要发酵酵生产什什么产品品。微生生物发酵酵产品主主要分为为3大类类:可再再生能源源、大宗宗化学品品(和生生物材料料)、精精细化合合物。可可再生能能源类目目前研究究的比较较多的是是纤维素素乙醇、、生物柴柴油、丁丁醇,然然而目前前的生物物能源有有着很多多缺陷,将来很很有必要要开发品品质高、、原材料料丰富的的下一代代生物能能源,如如长链醇醇、油酯酯和碳氢氢化合物物。大宗宗化学品类类目前研研究比较较多的是是柠檬酸酸、溶剂剂、乳酸酸、聚羟羟基烷酸酸、1,3-丙丙二醇、、丁二酸酸以及这这些化学学品聚合合生产的的生物材材料(如如生物塑塑料、生生物橡胶胶）然而目前前能工业业化发酵酵生产的的大宗化化学品数数量还非非常有限限。将来来很有必必要继续续开发生生产新型型大宗化化学品的的代谢工工程菌,全方位位地使生生物制造造技术代代替传统统的化工工制造技技术。3-羟基基丙酸/丙烯酸酸、二羟羟基酸类类、天冬冬氨酸、、糖醇类类、1,2-丙丙二醇、、1,4-丁二二醇的代代谢工程程菌改造造有希望望在短期期内取得得重大突突破。精精细化合合物目前前研究比比较多的的是氨基基酸、核核酸、类类异戊二二烯化合合物,如如青蒿素素(Artemisinin)、类类胡萝卜卜素(Carotenoids)、、番茄红红素(Lycopene)、、甾醇(Sterols)、、泰素。。虽然大大部分氨氨基酸都都能通过过发酵法法和酶法法生产,但甲硫硫氨酸(需求量量第三,全球市市场每年年23亿亿美元)目前还还主要靠靠化学法法制造,将来很很有必要要研究其其发酵生生产的代代谢工程程菌。其其他精细细化合物物如Omega-3脂脂肪酸、、辅酶Q10、、芳香族族化合物物等也具具有很大大开发潜潜力。最近的发发展表明明，它在在植物、、动物代代谢工程程及至人人体组织织细胞的的基因治治疗及代代谢分析析方面有有重要应应用。该该领域的的新颖性性在于分分子生物物技术与与数学分分析工具具的集成成，这有有助于阐阐明基因因修饰的的代谢通通量控制制及靶标标的合理理选择。。通过提提供对细细胞生物物学的准准确严密密的描述述，代谢谢工程也也可大大大促进功功能基因因组学研研究的深深入发展展。展望随着石油油资源匮匮乏、价价格飞速速增长以以及全球球气候变变暖、环环境恶化化等问题题的日益益严重,各国政政府、企企业和科科学界均均致力于于推动传传统石油油化工制制造行业业的产业业升级。。工业生生物制造造技术是是一种可可再生的的、环境境友好、、节能减减排的先先进技术术,微生生物发酵酵则是其其中的重重中之重重。代谢谢工程的的发展虽虽然只有有短短的的20年年,却极极大地推推动了微微生物发发酵工业业的发展展,既降降低了微微生物发发酵的生生产成本本,又拓拓展了发发酵产品品的多样样性,使使其在和和石油化化工制造造技术的的竞争中中在局部部占据了了上风。。2006年全全球的化化学市场场销售中中5%来来自于工工业生物物技术。。麦肯锡锡咨询公公司预测测在2010年年工业生生物技术术的产值值将达到到560亿美元元,占化化学市场场的20%。随随着系统统生物学学和合成成生物学学等新技技术的迅迅速发展展,代谢谢工程和和微生物物发酵工工业在不不久的将将来会取取得新一一轮的辉辉煌。代代谢工程程的快速速发展还还将会给给能源、、化工、、材料、、药物等等众多领领域带来来巨大的的影响。。谢谢9、静静夜夜四四无无邻邻，，荒荒居居旧旧业业贫贫。。。。1月月-231月月-23Friday,January6,202310、雨雨中中黄黄叶叶树树，，灯灯下下白白头头人人。。。。13:05:3513:05:3513:051/6/20231:05:35PM11、以我我独沈沈久，，愧君君相见见频。。。1月-2313:05:3513:05Jan-2306-Jan-2312、故故人人江江海海别别，，几几度度隔隔山山川川。。。。13:05:3513:05:3513:05Friday,January6,202313、乍见见翻疑疑梦，，相悲悲各问问年。。。1月-231月-2313:05:3513:05:35January6,202314、他他乡乡生生白白发发，，旧旧国国见见青青山山。。。。06一一月月20231:05:35下下午午13:05:351月月-2315、比不不了得得就不不比，，得不不到的的就不不要。。。。一月231:05下下午午1月-2313:05January6,202316、行动出成成果，工作作出财富。。。2023/1/613:05:3513:05:3506January202317、做前，，能够环环视四周周；做时时，你只只能或者者最好沿沿着以脚脚为起点点的射线线向前。。。1:05:35下午午1:05下午午13:05:351月-239、没有失败，，只有暂时停停止成功！。。1月-231月-23Friday,January6,202310、很很多多事事情情努努力力了了未未必必有有结结果果，，但但是是不不努努力力却却什什么么改改变变也也没没有有。。。。13:05:3513:05:3513:051/6/20231:05: