基因重组和基因工程oweroin演示

基因重组和基因工程

GeneticRecombinationandGeneticEngineering第十四章目录第一节

DNA的重组

DNARecombination

DNA重组接合作用(conjugation)转化作用(transformation)转导作用

(transduction)转座

(transposition)同源重组(homologousrecombination)位点特异的重组(site-specificrecombination)发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型。一、同源重组Holliday模型中，同源重组主要4个关键步骤①两个同源染色体DNA排列整齐②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体③通过分支移动产生异源双链DNA④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：片段重组体(patchrecombinant)拼接重组体(splicerecombinant)片段重组体（见模型图左边产物）：切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。拼接重组体（见模型图右边产物）：切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。

内切酶(recBCD)DNA侵扰(recA)分支迁移(recA)

内切酶(recBCD)

DNA连接酶5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´3´3´5´3´5´3´3´5´5´3´5´3´5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´目录Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´5´5´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´内切酶(ruvC)内切酶(ruvC)DNA连接酶DNA连接酶片段重组体拼接重组体目录二、细菌的基因转移与重组（一）接合作用当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用(conjugation)。可接合质粒如F因子(Ffactor)质粒——细菌染色体外的小型环状双链DNA分子（二二））转转化化作作用用通过过自自动动获获取取或或人人为为地地供供给给外外源源DNA，，使使细细胞胞或或培培养养的的受受体体细细胞胞获获得得新新的的遗遗传传表表型型，，称称为为转化化作作用用(transformation)。例：：溶菌菌时时，，裂裂解解的的DNA片片段段被被另另一一细细菌菌摄摄取取。。目录录（三三））转转导导作作用用当病病毒毒从从被被感感染染的的（（供供体体））细细胞胞释释放放出出来来、、再再次次感感染染另另一一（（供供体体））细细胞胞时时，，发发生生在在供供体体细细胞胞与与受受体体细细胞胞之之间间的的DNA转转移移及及基基因因重重组组即即为为转导导作作用用(transduction)。λ噬噬菌菌体体的的生生活活史史溶菌菌生生长长途途径径(lysispathway)溶源源菌菌生生长长途途径径(lysogenicpathway)例目录录目录录三、、位位点点特特异异重重组组位点点特特异异重重组组(site-specificrecombination)是由由整整合合酶酶催催化化，，在在两两个个DNA序序列列的的特特异异位位点点间间发发生生的的整整合合。。例（（一））λ噬噬菌菌体体DNA的的整整合合λ噬噬菌菌体体的的整整合合酶酶识识别别噬噬菌菌体体和和宿宿主主染染色色体体的的特特异异靶靶位位点点发发生生选选择择性性整整合合；；反反转转录录病病毒毒整整合合酶酶可可特特异异地地识识别别、、整整合合反反转转录录病病毒毒cDNA的的长末末端端重重复复序序列列(longterminalrepeat,LTR)。例（二二））细细菌菌的的特特异异位位点点重重组组沙门门氏氏菌菌H片片段段倒倒位位决决定定鞭鞭毛毛相相转转变变hix为反反向向重重复复序序列列，，它它们们之之间间的的H片片段段可可在在Hin控控制制下下进进行行特特异异位位点点重重组组(倒倒位位)。。H片片段段上上有有两两个个启启动动子子P，，其其一一驱驱动动hin基因因表表达达，，另另一一正正向向时时驱驱动动H2和和rH1基基因因表表达达，，反反向向(倒倒位位)时时H2和和rH1不不表表达达。。rH1为为H1的的阻阻遏遏蛋蛋白白基基因因。。H2鞭毛素阻遏蛋白Hin重组酶转位片段hinH2IH1H1鞭毛素hinH2IDNA启动序列H1启动序列沙门氏氏菌H片段段倒位位决定定鞭毛毛相转转变例（三））免疫疫球蛋蛋白基基因的的重排排免疫球球蛋白白(Ig)，由由两条条轻链链(L链)和两两条重重链(H链链)组组成，，分别别由三三个独独立的的基因因族编编码，，其中中两个个编码码轻链链(和)，一一个编编码重重链。。轻链的的基因因片段段：重链的的基因因片段段：LVJCLVDJC重链(IgH)基因因的V-D-J重排排和轻轻链(IgL)基因因的V-J重排排均发发生在在特异异位点点上。。在V片段段的下下游，，J片片段的的上游游以及及D片片段的的两侧侧均存存在保保守的的重组组信号号序列列(recombinationsignalsequence,RSS)。此重重排的的重组组酶基基因rag(recombinationactivatinggene)共有有两个个，分分别产产生蛋蛋白质质RAG1和RAG2。。CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCACTGTTTTTGG重组信号序列基因片段V片段J片段RSSRSS间插DNAOHOHVJ单链切开RAG1RAG2分子内内转酯酯反应应单链切切开转移核核苷酸酸修复、、连接接免疫球球蛋白白基因因重排排过程程目录录四、转转座重重组由插入入序列列和转转座子子介导导的基基因移移位或或重排排称为为转座(transposition)。插入序序列(insertionsequences,IS)组成：：二个分分离的的反向向重复复(invertedrepeats,IR)序列列特有的的正向向重复复序列列一个转转座酶酶（transposase)编编码基基因IRTransposaseGeneIR发生形形式：：保守性性转座座(conservativetransposition)复制性性转座座(duplicativetransposition)（一））插入入序列列转座座插入序序列的的复制制性转转座目录录转座子子(transposons)——可可从一一个染染色体体位点点转移移到另另一位位点的的分散散重复复序列列。转座子子组成成：反向重重复序序列转座酶酶编码码基因因抗生素素抗性性等有有用的的基因因IRIRTransposaseGene有用基因（二））转座座子转转座由转座座子介介导的的转座座目录录第二二节节重重组组DNA技术DNARecombinationTechnique重组DNA技术术的发发展史史年G.J.Mendel的豌豌豆杂杂交试试验1944年的的肺炎炎球菌菌转化化实验验1973年年美美国国斯坦坦福大大学的的科学学家构构建第一个个重组DNA分子子1977年年美美国国南旧旧金山山由博博耶和和斯旺旺森建建立世世界上上第一家家遗传工工程公公司，，专门门应用用重组组DNA技技术制制造医医学上上重要要的药药物。。1980年年开开始始建造造第一家家应用重重组DNA技术术生产产胰岛岛素的的工厂厂1997年年英英国国罗林林研究究所成成功的的克隆隆了多莉相关概概念DNA克隆隆工具酶酶目的基基因基因载载体基本原原理重组DNA技术术与医医学的的关系系本节主主要内内容一、重重组DNA技术术相关关概念念克隆(clone)来自同同一始始祖的的相同同副本本或拷拷贝的的集合合。获取同同一拷拷贝的的过程程称为为克隆化化(cloning)，即无性繁繁殖。（一））DNA克隆隆技术水水平：：分子克克隆(molecularclone)即DNA克克隆细胞克克隆个体克克隆（（动物物或植植物））DNA克隆隆应用酶酶学的的方法法，在在体外外将各各种来来源的的遗传传物质质（同同源的的或异异源的的、原原核的的或真真核的的、天天然的的或人人工的的DNA））与载载体DNA接合合成一一具有有自我我复制制能力力的DNA分子子———复制制子(replicon)，，继而而通过过转化化或转转染宿宿主细细胞，，筛选选出含含有目目的基基因的的转化化子细细胞，，再进进行扩扩增提提取获获得大大量同同一DNA分子子，也也称基因因克克隆隆或或重重组组DNA(recombinantDNA)。生物物技技术术工工程程:基因因工工程程、、蛋蛋白白质质工工程程、、酶酶工工程程、、细细胞胞工工程程等等目的的①分分离离获获得得某某一一感感兴兴趣趣的的基基因因或或DNA②获获得得感感兴兴趣趣基基因因的的表表达达产产物物（（蛋蛋白白质质））基因工程(geneticengineering)——实现基基因克隆所用用的方法及相相关的工作称称基因工程，，又称重组DNA工工艺学。（二）工具酶酶限制性核酸内内切酶DNA聚合酶酶Ⅰ逆转录酶T4DNA连连接酶碱性磷酸酶末端转移酶TaqDNA聚合酶酶重组DNA技技术中常用的的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基限制性核酸内内切酶定义限制性核酸内内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的的特异序列,并在识别别位点或其周周围切割双链链DNA的一一类内切酶。。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ作用与甲基化酶共共同构成细菌菌的限制修饰饰系统，限制制外源DNA，保护自自身DNA。。分类Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技技术中常用ⅡⅡ型）第一个字母取取自产生该酶酶的细菌属名名，用大写；；第二、第三个个字母是该细细菌的种名，，用小写；第四个字母代代表株；用罗马数字表表示发现的先先后次序。命名HindⅢ属

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌菌d株的第三种酶酶Ⅱ类酶识别序序列特点——回文结构(palindrome)切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口同功异源酶来源不同的限限制酶，但能能识别和切割割同一位点，，这些酶称同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同尾酶有些限制性内内切酶虽然识识别序列不完完全相同，但但切割DNA后，产生相相同的粘性末末端，称为同尾酶。这两个相同同的粘性末端端称为配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA（三）目的基基因cDNA(complementaryDNA)基因组DNA(genomicDNA)（四）基因载载体定义为携带带目的的基因因，实实现其其无性性繁殖殖或表表达有有意义义的蛋蛋白质质所采采用的的一些些DNA分分子。。常用载载体质粒DNA噬菌体体DNA病毒DNA克隆载载体(cloningvector)为使插插入的的外源源DNA序序列被被扩增增而特特意设设计的的载体体称为为克隆载载体。表达载载体(expressionvector)为使插插入的的外源源DNA序序列可可转录录翻译译成多多肽链链而特特意设设计的的载体体称为为表达载载体。载体的的选择择标准准能自主主复制制；具有两两个以以上的的遗传传标记记物，，便于于重组组体的的筛选选和鉴鉴定；；有克隆隆位点点（外外源DNA插入入点）），常常具有有多个个单一一酶切切位点点，称称为多多克隆隆位点点；分子量量小，，以容容纳较较大的的外源源DNA。。1.质质粒粒(plasmid)特点能在宿宿主细细胞内内独立立自主主复制制；带带有某某些遗遗传信信息,会会赋予予宿主主细胞胞一些些遗传传性状状。目录录λ噬菌菌体DNA改造造系统统λgt系列列（插插入型型，适适用cDNA克克隆））EMBL系系列（（置换换型，，适用用基因因组克克隆））2.噬噬菌菌体(phage)M13噬菌菌体DNA改造造系统统（含含lacZ基因因）M13mp系列列pUC系列列3.粘粘性性质粒粒(cosmid)酵母人人工染染色体体(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人人工染染色体体(bacterialartificialchromosome,BAC)动物病病毒DNA改造造的载载体（如腺腺病毒毒，腺腺病毒毒相关关病毒毒，逆逆转录录病毒毒）其他二、重重组DNA技术术基本本原理理基本原理目的基因的获取DNA导入受体菌外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达

以质粒为载体的DNA克隆过程目录（一）目的的基因的获获取1.化学学合成法要求：已知知目的基因因的核苷酸酸序列或其其产物的氨氨基酸序列列。2.基因组组DNA文文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库库(cDNAlibrary)4.聚合合酶链反应应(polymerasechainreaction,PCR)（见第22章）*化学合合成法获取取目的基因因由已知氨基基酸序列推推测可能的的DNA序序列组织或细胞胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子子的转化菌菌限制性内切切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化化细胞内由由克隆载体体所携带的的所有基因因组DNA的集合*从基因因组DNA文库获取取目的基因因目录限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文库目录mRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子cDNA文库反转录酶载体受体菌复制*从cDNA文库获取目的基因逆转录酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT目录（三）外源源基因与载载体的连接接1.粘性性末端连接接方式：(1)同同一限制制酶切位位点连接接(2)不不同限制制酶切位位点连接接配伍末端端连接非配伍末末端连接接（二）克克隆载体体的选择择和构建建BamHⅠ切割割反应

GGATCCCCTAGGT4DNA连连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体载体自连目的基因自连同一限制制酶切位位点连接接目录不同限制制酶切位位点（非非配伍末末端）的的连接EcoRⅠ切割割位点BglⅡ切割割位点+EcoRⅠ+BglⅡ双酶切EcoRⅠ+BglⅡ双酶切T4

DNA连接酶15ºC重组体配伍末端端的连接接情况和和同一限限制酶切切位点连连接相似似。目录2.平平端连接接适用于：：限制性内内切酶切切割产生生的平端端粘端补齐齐或切平平形成的的平端目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连目录3.同同聚物加加尾连接接在末端转转移酶(terminaltransferase)的作用下下，在DNA片片段末端端加上同同聚物序序列、制制造出粘粘性末端端，再进进行粘端端连接。。5´3´3´5´载体DNA5´3´3´5´目的基因限制酶或机械械剪切限制酶5´3´3´5´5´3´T(T)nT

T(T)nT3´5´5´

3´3´5´5´3´A(A)nA

A(A)nA3´5´λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA连接酶15ºC重组体目录4.人工接接头(linker)连接由平端加上新新的酶切位点点，再用限制制酶切除产生生粘性末端，，而进行粘端端连接。人工接头及其其应用CCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目录受体菌条件安全宿主菌限制酶和重组组酶缺陷处于感受态(competent)导入方式转化(transformation)转染(transfection)感染(infection)（四）重组DNA导入受受体菌（五）重组体体的筛选1.直接选择法(1)抗药性标记选选择(2)标志志补救(markerrescue)(3)分子子杂交法原位杂交Southern印迹2.免疫学学方法如免疫化学方方法及酶免检检测分析等(插入失活法法)抗药性标记选选择目录组氨酸缺陷型大肠杆菌无组氨酸的培养基酵母咪唑甘油油磷酸脱水酶基因因促进组氨酸合合成λDNA重组体标志补救目录α互补目录α互补的检检测目录原位杂交目录Southern印迹目录鸡的β肌球蛋蛋白的克隆和和检出目录重组DNA技技术操作过程程可形象归纳纳为小结结分分离目的基因切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体转转入受体菌筛筛选重组体重组DNA技技术操作的主主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNAcDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交目录表达体系的建建立表达载体的构构建受体细胞的建建立表达产物的分分离纯化（六）克隆基基因的表达1.原核表表达体系（E.coli表达体系最最为常用）标准：选择标志强强启动子翻译调控序列列 多接头克克隆位点E.coli表达体系的的不足不宜表达真核核基因组DNA不能加工表达达的真核蛋白白质表达的蛋白质质常形成不溶溶性包涵体(inclusionbody)