第十三章基因工程与基因组学

第十三章基因工程与基因组学概述廊坊师范学院生命科学学院遗传学教研室第一节基因工程一、基因工程概述二、基因工程工具酶三、基因工程的流程及相关技术四、基因工程的发展应用一、基因工程概述遗传工程（geneticengineering），也称生物工程，利用工程技术的方法改造和修饰生物体，使其产生新的性状或产品，从而改良生物体的一种遗传学手段。核心是利用重组DNA技术，在分子水平上操作修饰改变生物体遗传结构。基因工程（geneengineering）：利用人工的方法把生物的遗传物质在体外进行切割、拼接和重组，获得重组DNA分子，然后导入宿主细胞或个体，使受体的遗传特性得到修饰或改变的过程。二、基因工程的工具酶内切核酸酶(endonuclease)DNA连接酶(ligase)DNA聚合酶（DNApolymerase）RNA聚合酶（RNApolymerase）反转录酶（reversetranscriptase）最重要的工具酶是限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease），也称限制性酶(restrictionenzyme),能识别双链DNA分子中一段特异的核苷酸序列，并在特定的位置将双连DNA分子切断。Eco

RⅠ属名种名菌株名序号（一）限制性核酸内切酶常见内切酶（二）DNA连接酶连接5’－磷酸和3’－OH，形成磷酸二酯键，封闭DNA双链上的缺刻。如：E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶载体(vector)将外源DNA片段运送进宿主细胞(hostcell)进行扩增或表达的运载工具称为载体。载体也是DNA分子。常用的载体有细菌质粒、噬菌体、病毒等。经改造的黏粒(cosmid)、噬粒(phagemid)都要经过人工改造。细菌人工染色体（BAC）、酵母菌人工染色体（YAC）和人类人工染色体（HAC）λ噬菌体载体YAC（1Mb）载体的基本条件①有独立的复制原点(ori)，能独立地自我复制，而且能带动外源DNA一起复制。②具有多种限制性酶的切点，用于连接外源DNA片段。③载体上的限制酶酶切位点对于任何一种限制酶来说只能有一个。④具有一个选择标记基因。获得外外源DNA片段段（分分）限限制性性内切切酶切切割外外源DNA片段段与载载体（（切））外外源源DNA片片段与与载体体连接接（接接）重重组DNA分子子转入入宿主主细胞胞（转转）重重组子子的筛筛选与与鉴定定（筛筛）目目的基基因的的确认认与分分析三、基因工工程的流程程及相关技技术（一）外源源DNA片片段的分离离方法构建基因组组文库分离离法差别显示反反转录PCR利用聚合酶酶链式反应应技术扩增增目的基因因1.构建基基因组文库库分离法用克隆载体体将某种生生物的基因因组全部遗遗传信息储储存于一个个受体菌的的群体，即即构成了这这种生物的的基因组文文库。若只只储存某生生物基因组组的部分遗遗传信息，，即构成部部分基因组组文库。供体生物的的基因组DNA切割割成许多片片段将所有片段段分别连接接到载体上上，构成一一个重组DNA群体体这个群体包包含全基因因组的遗传传信息。保存、筛选选差别显示分分析基本流流程2.差别显显示反转录录PCR（（DDRT-PCR）3、利用聚聚合酶链式式反应技术术扩增目的的基因（1）套式式PCR（2）反向向PCR（3）不对对称PCR（4）锚定定PCR（5）长程程PCR（6）反转转录PCR4、人工工合成基因因根据已知的的基因序列列，或根据据氨基酸序序列推测DNA序列列将化学合成成寡核苷酸酸的方法与与酶促合成成DNA的的方法结合合起来，可可以很快地地人工合成成基因。通过用相同同的限制性性核酸内切切酶切割，，连接形成成一个重组组DNA分分子（二）、外外源DNA片段与载载体的切割割和连接（三）、重重组DNA转入宿主主细胞1.重组DNA转入入原核细胞胞热激转化法法电穿孔转化化法2.重组DNA转入入真核细胞胞农杆菌转化化法重组DNA感受态细胞冰浴混合、静置置42ºC热热激加入培养基基扩培转化液涂含含抗菌素的的平板吸附DNA摄入DNA（1）热激转化化法感受态细胞胞电转仪调为为2.5kV25F脉冲控制器器200-400质粒DNA混合加入培养液37℃中速震荡涂板（2）电穿孔转转化法2.重组DNA转入入植物细胞胞农杆菌介导导的Ti质质粒载体转转化法（四）重组子的筛筛选与鉴定定核酸杂交PCR检测测测序生物学活性性检测1.插入抗性性失活2.蓝白斑筛选1.插入失失活筛选法法蓝白斑筛选选重组质粒粒四、基因工工程的发展展应用1、基因工工程是生物物科学基础础研究的重重要手段2、利用转转基因技术术改良植物物已取得很很大进展并并在生产上上应用3、利用基基因工程获获得大量重重组的蛋白白、疫苗药药物4、利用基基因工程进进行不同物物种之间的的基因传递递提供了可可能。转转基因动植植物--““生物工厂厂”5、疾病诊诊断与基因因治疗6、环境保保护4.利用用基因工程程改良动物物推荐几本参参考书：1、《基因因工程原理理与方法》》，孙树汉汉编，人民民军医出版版社

2、、《基因工工程原理》》，吴乃虎虎编，科学学出版社（（侧重原理理）

3、、《现代基基因工程技技术导论》》，陈章良良编，科学学出版社（（侧重应用用）

4、、《分子克克隆》(第第三版)，，J.Sambrooketal.科科学出版版社（具体体的实验方方法，分子子生物学研研究的圣经经）第二节基基因组学学一、基因组学概述二、基因组组图谱的构构建三、基因组组图谱的应应用四、后基因因组学基因组(genome)泛指一个有有生命体、、病毒或细细胞器的全全部遗传物物质；在真真核生物，，基因组是是指一套染染色体（单单倍体）DNA。一、基因组学概概念及范畴畴基因组学(genomics)就是发展和和应用DNA制图、、测序新技技术以及计计算机程序序，分析生生命体（包包括人类））全部基因因组结构及及功能。基因组学研研究的最终终目标获得生物体体全部基因因组序列鉴定所有基基因的功能能明确基因之之间的相互互作用关系系阐明基因组组的进化规规律基因组学研研究内容结构基因组组学(structuralgenomics)功能基因组组学(functionalgenomics)比较基因组组学(comparativegenomics)结构基因组组学（structuralgenomics）基因定位基因组作图图测定核苷酸酸序列遗传图（连连锁图）物理图转录图序列图二、基因组组图谱的构构建基因组计划划的第一个个环节：构构建基因组组图谱1.遗传图连锁图(linkagemap)，是指基因因标志在染色色体上的遗传传距离，即确确定各基因在在基因组中的的相对位置和和排列顺序。。遗传距离通常常由基因在四四分体时期染染色体交换过过程中分离的的频率厘摩（（cM）来表表示。遗传标记（Geneticmarker）指指可识别的等等位基因。它它具有两个基基本特征，即即可遗传性和和可识别性，，因此生物的的任何有差异异表型的基因因突变型均可可作为遗传标标记。类型：形态标记（morphologicalmarker））细胞学标记(cytologicalmarker)生化标记(biochemicalmarker)分子标记(molecularmarker)2.、物理图图以已知核苷酸酸序列的DNA片断（序序列标签位点点,STS）为“路标标”，以碱基基对作为基本本测量单位（（图距）的基基因组图。DNA上两点点的实际距离离，即确定基基因在染色体体上的实际排排列顺序，从从而对基因定定位。3、转录图以EST（expressedsequencetag，表达达序列标签））为标记，根根据转录顺序序的位置和距距离绘制的图图谱。4.、序列图图序列图是指整整个人类基因因组的核苷酸酸序列图，也也是最详尽的的物理图，既既包括可转录录序列，也包包括非转录序序列，是转录录序列、调节节序列和功能能未知序列的的总和。这是人类基因因组计划最繁繁重、耗时最最多的工作。。CREDIT:JOESUTLIFFScience,Vol291:1221.FishinginaMoreEffectiveWay!人类基因组计计划1990，美美国国立卫生生研究所和能能源部投资＄＄30亿，启启动了人类基基因组计划，，预计15年年时间完成人人类基因组全全部序列的测测定1996，完完成标记密度度为0.6cM的人类基基因组遗传图图谱，100kb的物理理图谱2000，完完成草图2001年2月，公布人人类基因组图图谱的修订版版2002，完完成测序工作作国际人类基因因组测序协作作组（公共计计划组）由6个国家、20个研究中中心的2000多位科学学工作者组成成。国家承担的测序任务美国54%英国33%日本7%法国2.8%德国2.2%中国1%1999年9月中国获获准加入人类类基因组计划划，负责测定定人类基因组组全部序列的的1%，负责责第3号染色色体3千万核核苷酸的序列列测定工作。。中国是继美美、英、日、、德、法之后后第6个国际际人类基因组组计划参与者者，也是参与与这一计划的的唯一发展中中国家。人类基因组计计划1%测序序中国实验室室2000年6月26日科学家公布人人类基因组工工作草图，标标志着人类在在解读自身““生命之书””的路上迈出出了重要一步步。HGP对人类类基因面貌的的新发现基因数量少得得惊人人类基因组中中存在“热点点”和大片““荒漠”三分之一为““垃圾”DNA种族歧视毫无无根据男性基因突变变比例更高2000年是是基因组之年年，完成了人人类基因组的的工作框架图图，完成了一一系列模式生生物和微生物物的基因组序序列分析。2000年年12月月美、英等国国科学家宣布布绘出拟南芥芥基因组的完完整图谱，这这是人类首次次全部破译出出一种植物的的基因序列。。三、后基因组组学（postgenomics)完成一个生物物体全部基因因组测序后即即进入功能基基因组学阶段段，也称后基因组阶段段——详尽分