兽用基因工程生物制品的安全性

兽用基因工程生物制品的安全性第一页，共二十八页，2022年，8月28日兽用基因工程生物制品是用微生物、微生物代谢产物、原虫、血液或组织等加工制成，作为预防、治疗、诊断特定传染病或其他疾病的制剂。作为畜禽疾病预防控制的利器，兽用生物制品在畜牧业的发展中发挥着越来越重要的作用，其研发和生产应用促进了畜牧业的繁荣。由于其本身的特性和安全管理方面的漏洞，在研发和应用中也可能出现某些生物灾害。概括起来主要有：实验研究人员的感染、病原微生物对环境的污染、以及遗传性状不稳定。兽用生物制品的生物安全问题直接或间接影响人类和动物的身体健康和生命安全。第二页，共二十八页，2022年，8月28日第三页，共二十八页，2022年，8月28日第一节

兽用基因工程生物制品概况目前的兽用基因工程生物制品，可分为基因工程亚单位疫苗、重组活载体疫苗、基因缺失疫苗、核酸疫苗、多肽疫苗和转基因植物疫苗等几类。1.基因工程亚单位疫苗或基因工程蛋白质疫苗通过基因工程将病原微生物的主要免疫原基因在宿主细胞表达，再从表达产物制备而成。其产品或是病原蛋白质(或亚单位)，或是其抗原决定簇。这类疫苗可能产生的问题：与原始蛋白质的结构差异、异源蛋白质对宿主的毒性、细菌表达系统对外源基因的识别、T细胞对蛋白成分非敏感。对上述问题的解决途径包括：采用真核生物细胞为宿主、采用能分泌重组蛋白质的细菌为宿主、突变外源基因的糖基化位点。第四页，共二十八页，2022年，8月28日目的基因的获取工程菌的构建目的基因表达蛋白质分离与纯化产品第五页，共二十八页，2022年，8月28日2.

核酸疫苗核酸疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA

或RNA)直接导入动物体细胞内,并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白,诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答,以达到预防和治疗疾病的目的。核酸疫苗的优点是：免疫保护力增强、制备简单、同种异株交叉保护、持久免疫应答。核酸疫苗的缺点是：免疫原性较低、用量大、真核细胞不存在质粒DNA的主动核－质间传输途径。提高核酸疫苗免疫原性的尝试主要有：抗原基因上游插入RNA复制酶基因、在抗原基因下游插入细胞因子编码基因、提高细胞转染效率、改变重组质粒非编码区。核酸疫苗通常不能在动物细胞中长期复制或不复制。第六页，共二十八页，2022年，8月28日第七页，共二十八页，2022年，8月28日3.

重组活载体疫苗重组活载体疫苗包括：重组DNA病毒疫苗和重组RNA病毒疫苗。重组DNA病毒疫苗是将抗原基因转移至病毒DNA载体上而制备的重组DNA疫苗。重组RNA病毒疫苗是将抗原基因转移至病毒RNA载体上而制备的重组RNA疫苗。重组活载体疫苗的优点主要在于：宿主体内有识别病毒的免疫系统、病毒能主动将其DNA或RNA传输至细胞内、表达量大。重组活载体疫苗的主要不足在于：对免疫力弱者可能致病、容易出现非相关免疫反应、需要避开先天或后天的抗病毒免疫，等等。第八页，共二十八页，2022年，8月28日第九页，共二十八页，2022年，8月28日第二节

兽用基因工程生物制品的安全性兽用基因工程生物制品的应用越来越广泛，其安全性一直受到人们的密切关注。对兽用基因工程生物制品安全性的考虑，主要在以下几方面：对使用动物的毒性、致癌的可能性、外源DNA与宿主染色体整合的可能性、诱导产生抗DNA抗体的可能性。对基因工程生物制品使用后的担忧主要是持续表达外源抗原可能出现的后果：产生耐受性、自动免疫、过敏反应和超敏反应等，或最终导致机体免疫机制受抑制而易感染其他病原体。基因工程生物制品安全性评价应包括：受体细胞的安全性、基因操作的安全性、基因重组活疫苗的安全性及工业化生产的潜在安全性。第十页，共二十八页，2022年，8月28日一、受体细胞的安全性受体细胞是用于制备基因工程生物制品的表达系统。可分为原核表达系统和真核表达系统两大类。选择受体细胞时应重点考虑：

安全性高且不造成生物污染；

便于重组DNA导入；

便于筛选克隆子；

能使重组DNA分子在细胞内稳定维持；

适合外源基因高效表达和表达产物分泌或累积；

对遗传密码无偏倚（没有选择性表达）；

遗传性稳定、易于扩大培养或发酵；

对真核表达系统还要求有较好的翻译后加工机制。

第十一页，共二十八页，2022年，8月28日1.

原核生物表达系统原核生物表达系统是研究最透彻的表达系统，常用细菌作为受体，具有操作简单、价格低廉、外源基因表达水平高的特点。最为常用的是大杨杆菌和枯草芽孢杆菌。大肠杆菌是肠道菌群的组成部分，大部分为非致病菌，但某些血清型可引起腹泻和败血症。作为外源基因受体的大肠杆菌菌株遗传背景清楚、目的基因表达水平高、培养周期短、抗污染能力强。枯草芽孢杆菌是需氧的革兰氏阳性菌，细胞内存在着分泌系统，常常能将重组蛋白质分泌到培养基中。枯草杆菌本身没有致病性，但其可用的载体株有限，外源基因的表达量也低于大肠杆菌。

第十二页，共二十八页，2022年，8月28日大肠杆菌枯草芽孢杆菌第十三页，共二十八页，2022年，8月28日2.真核表达系统原核表达系统表达量高，但目的蛋白质常以包涵体出现而致纯化难，缺翻译后加工而使表达产物活性较低，促使人们寻找合适的真核表达系统。目前常用的真核表达系统有：酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。酵母菌的遗传背景清楚、遗传操作容易，可微生物化操作，外源基因在酵母细胞中能分泌表达，但只能进行有限的翻译后加工修饰。昆虫细胞表达系统多利用杆状病毒为外源基因载体，利用昆虫细胞表达目的蛋白，但分泌性较差哺乳细胞表达系统培养细胞如CHO、COH、BHK、NIH3T3为受体，以病毒或质粒为外源基因载体。主要缺点是培养和操作难度大，且不能持久表达第十四页，共二十八页，2022年，8月28日啤酒酵母NIH3T3CHOBHK第十五页，共二十八页，2022年，8月28日

二、基因操作的安全性基因操作主要包括：目的基因获取、载体制备、基因重组、重组子转化与外源基因表达等步骤。1.目的基因的分子特征表达载体相关资料：目的基因与载体图谱，目的基因供体、结构功能及安全，其他元件安全记录。目的基因在表达系统中的整合情况：插入片段的位点、边界、拷贝数、全长DNA序列，宿主DNA序列被删除或基因失活情况。外源插入片段的表达情况：转录水平(RT–PCR,Northern)、翻译水平(ELISA,Western)。第十六页，共二十八页，2022年，8月28日蓝舌病毒BL3基因-pFB1表达载体第十七页，共二十八页，2022年，8月28日2

基因的遗传稳定性基因操作的遗传稳定性主要涉及质粒的稳定性，包括分离稳定性和结构稳定性。进行遗传稳定性鉴定时，应从几个方面入手：目的基因整合的稳定性转化体中目的基因拷贝数、连续三代以上的分离情况(Southern,PCR)。目的基因表达的稳定性转化体在不同世代中目的基因的表达情况，即转录、翻译水平的稳定性，需提供不少于三代的试验数据(Northern,

Western,

RT-PCR)。目标性状表达的稳定性目标性状在转化体不同世代中的表现，需提供不少于三代的试验数据。重组载体的安全性：能否向自然界中不含该目的基因的生物转移。第十八页，共二十八页，2022年，8月28日三、兽用基因重组活疫苗的安全性基因工程重组活疫苗是利用基因工程技术将保护性抗原基因转移到载体（病毒、细菌）中使之表达的活疫苗。根据其载体的致病性有两个制备途径。非致病性载体携带异源抗原基因，产生新的免疫。致病性载体通过基因修饰或突变使致病性大为减弱或消失，但仍保持免疫原性。基因重组活疫苗可分为：基因缺失疫苗与基因突变疫苗、复制性活载体疫苗、非复制性活载体疫苗三类。它们之间分别具有各自的特点，在安全性方面的表现也不尽相同。第十九页，共二十八页，2022年，8月28日1不同类型的基因重组活疫苗基因缺失疫苗与基因突变活疫苗：属减毒或弱毒疫苗，正常使用不引起临床疾病，但可诱发产生保护性免疫力，对免疫力弱的人可能致病。复制性活载体疫苗：在接种的动物体内特定免疫基因可随载体生物复制和适量表达，产生抗体。非复制性活载体疫苗：不能在动物体内复制，但特定免疫基因可少量表达而引起免疫反应。活载体疫苗的优点：可同时启动细胞免疫和体液免疫、可构建多价疫苗、用量少且持续时间长、不影响相关疾病监测和流行病学调查。活载体疫苗的缺点：与野生载体生物发生基因重组的可能性、进化成新毒株的可能性、二次免疫的排斥反应、残存毒力问题。第二十页，共二十八页，2022年，8月28日2兽用基因工程活疫苗的安全性问题对人和动物健康的危害：致病性（包括毒性、致癌、致畸、致突变、致过敏等），抗药性即转基因微生物的抗药性，食品安全性即接种疫苗后动物性食品是否食用安全的问题。对生态环境的潜在危害

致病性和毒性：与供体微生物和受体微生物相比

其致病性和毒性是否增加。

生存竞争力：与非转基因微生物相比是否增强。

传播扩散能力：通过水、土、气、动植物等远距离转移的能力

遗传变异能力：遗传稳定性与适应性变异、突变率

遗传转移能力：向非转基因微生物发生遗传物质转移第二十一页，共二十八页，2022年，8月28日四、兽用的DNA疫苗的安全性DNA疫苗是将免疫应答目的基因插入质粒载体而制备的生物制剂。将其导入动物体后通过宿主细胞表达系统表达抗原，进而诱生保护性免疫应答。1.DNA疫苗简介DNA疫苗的给药途径包括：注射、液喷、基因枪、口服和皮内接种等。DNA疫苗的主要优点如下：

载体结构简单，分子克隆较易；

重组DNA分子稳定，可制成冻干疫苗，便于贮运

比传统疫苗更安全，使用过程中不需用佐剂。将几种重组质粒简单组合便可制备成多价疫苗。第二十二页，共二十八页，2022年，8月28日2

DNA疫苗的安全性问题对DNA疫苗的主要担忧：重组DNA片段可能整合至宿主DNA而造成插入突变，进而可能致癌或致病；虽然目前发现整合危险性相当低，但缺乏灵敏有效的监测手段，难得获得准确和全面的数据。对DNA疫苗使用的安全性还有一系列问题需阐明：

动物体内究竟是哪些细胞摄取DNA、在哪些细胞中表达、表达的持续期有多久？

DNA是否进入细胞核、能否复制、是否能整合？

外源抗源长期表达能否导致有害的免疫病理反应？

对DNA注射是否会导致产生对DNA的抗体？或引起自身免疫反应？第二十三页，共二十八页，2022年，8月28日减毒菌的转基因产品：

主要是活疫苗产品，通过转基因减毒菌的培养、收集培养物或离心收集菌体、加入保护剂后转入西林瓶、制备液体疫苗或冻干疫苗

要求生产过程严格GMP要求组织生产；

要求产品稳定性好、加入的保护剂安全有效，且没有引入有害物质；要求生产和加工活动对转基因生物的影响类型为类型2；

因此，转基因活菌产品的安全性等同于转基因的减毒菌株。

第二十四页，共二十八页，2022年，8月28日第三节兽用基因工程生物制品安全性评价一、危害性分类标准和安全性评价标准1.

危害性分类标准第一类危害性：个体和群体危害性低，不可能引

起健康动物疾病；第二类危害性：中度个体危害、有限群体危害，

可能引起动物疾病，正常情况下不会对人

造成严重危害，具备有效治疗和预防措施第三类危害性：高度个体危害、低度群体危害，

能引起严重的人或动物疾病，但不会引起

个体间传播，有预防和治疗手段；第四类危害性：高度个体和群体危害，能致病且

不可预防或治疗，可个体间及人畜间传播。第二十五页，共二十八页，2022年，8月28日2.安全性评价标准第一类制品的安全性评价：评价的重点是生物体的分子特性及受体生物基因和缺失或增加基因的特性。

分子特性：受体的特性、缺失的特性、供体基因的特性、重组体的特性、基础种子的特性

生物学特性：包括受体、供体和基础种子的生物

学特性、安全等级及其检测方法●

第二类制品的安全性评价：评价的重点是缺失基因、疫苗生物和受体生物的分子特性和生物学特性。

分子特性：受体的特性、缺失的特性、基因缺失体

的特性、基础种子的分子特性；

生物学特性：包括受体和基础种子的生物学特性、