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文档简介

免疫学补体参与反应细胞数量及其功能检测第一页,共二十二页,2022年,8月28日PartI补体参与的反应

补体的溶血反应PartIIT细胞数量及其功能检测

E花环形成试验--数量测定

淋巴细胞转化试验:形态学方法

3H—TDR掺入法

MTT比色法

功能第二页,共二十二页,2022年,8月28日

补体激活的三条途径经典途径MBL途径旁路途径IC+C1qMBL+病原体配基细菌+C3膜攻击复合物细胞溶解PartI补体参与的反应复习第三页,共二十二页,2022年,8月28日1.补体的溶血反应

原理绵羊红细胞(SRBC)作为抗原与其相应抗体(溶血素)结合后,通过经典途径激活补体,产生膜攻击作用,最后导致红细胞溶解,发生溶血反应。材料

1.抗原:2%绵羊红细胞;

2.抗体(溶血素);

3.补体:健康豚鼠新鲜血清

4.生理盐水、24孔板等。

第四页,共二十二页,2022年,8月28日孔号SRBC溶血素补体NS13滴3滴3滴3滴23滴3滴-6滴33滴-3滴6滴43滴--9滴

步骤1、取24孔板,按下表加入各成分;

2、将24孔板放在37℃温箱内15-30min,观察并记录结果。结果:第五页,共二十二页,2022年,8月28日PartIIT细胞数量及其功能检测第六页,共二十二页,2022年,8月28日2.E花环形成试验

原理人外周血T细胞表面具有天然的能与绵羊红细胞(SRBC)表面糖肽相结合的受体-E受体(CD2分子),可结合SRBC形成花环样细胞团,是T细胞特有的表面标志。

检测T细胞数量,间接判断机体的细胞免疫状况。第七页,共二十二页,2022年,8月28日材料肝素抗凝血、绵羊红细胞(SRBC)淋巴细胞分层液、Hank’s液、1640培养液、0.5%戊二醛固定液、灿烂甲酚兰染液试管、滴管、离心机、微量移液器、玻片、显微镜等第八页,共二十二页,2022年,8月28日

步骤:(动作轻柔;分清滴管及枪头!!!)⑴取肝素抗凝血与等量Hank’s液稀释混匀血3ml,用滴管贴管壁(倾斜30°)轻轻叠加于3ml分离液上(界面要清晰)→→→

配平后1800rpm离心13mins。

1.淋巴细胞悬液的制备:人淋巴细胞比重:1.070淋巴细胞分层液:1.077人红细胞比重:1.092第九页,共二十二页,2022年,8月28日稀释的血液

分层液离心前稀释的血浆

单个核细胞分层液粒细胞红细胞离心后第十页,共二十二页,2022年,8月28日第十一页,共二十二页,2022年,8月28日⑵另取一支滴管,仔细吸出位于血浆和分离液之间的乳白色的单个核细胞,放入盛有5mlHank’s液的试管→→→2000rpm离心5mins。

(3)弃上清(倾倒时液体不要回流),将沉淀的淋巴细胞轻弹混匀后加入Hank’s液5ml,重复离心两次。2.弃去上清,留经过洗涤的淋巴细胞悬液(约0.1ml)与绵羊红细胞0.1ml

、1640营养液0.1ml混合(分清枪头)→→→轻弹混匀后放于37℃温箱15mins。*离心时要配平第十二页,共二十二页,2022年,8月28日3.取出试管,500rpm离心5mins。(注意此步非常关键,转速一定要慢,一启动即关,来回数次即可),室温静置2-3mins4.吸去100-150ul上清液,轻轻旋转混匀,沿管壁滴加1滴(50ul)戊二醛,轻轻混匀静置5mins。5.取一滴(25ul)液体滴片,加一滴灿烂甲酚兰染液,加盖玻片。第十三页,共二十二页,2022年,8月28日6.高倍镜下观察,计数100个淋巴细胞,计算花环形成率。淋巴细胞上结合≥3个SRBC者为E花环阳性。正常参考值:EtRFC:64.4±6.7%;

EaRFC:23.6±3.5%;

EsRFC:3.3±2.6%第十四页,共二十二页,2022年,8月28日

结果T淋巴细胞SRBC第十五页,共二十二页,2022年,8月28日第十六页,共二十二页,2022年,8月28日淋巴细胞转化试验--

原理

T细胞在体外培养时,受到非特异性有丝分裂原(如PHA、ConA)或特异性抗原刺激后,可出现代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加、细胞体积增大并能进行分裂的淋巴母细胞,称淋巴细胞转化现象。淋巴细胞转化率的高低,可反映机体的细胞免疫水平,故可作为测定机体免疫功能的指标。三种方法形态学方法、3H-TdR掺入法、MTT比色法第十七页,共二十二页,2022年,8月28日

根据胞核的大小、核与胞浆的比例、胞浆染色性、核的构造与核仁的有无。成熟小淋巴细胞:核染色深、没有核仁,胞浆少、染色为轻度嗜碱性;过渡型淋巴细胞:大于小淋巴细胞、核染色比较疏松,胞浆比较多,但是出现核仁;淋巴母细胞:体积增大,形态不规则,核变大、核质染色疏松,有核仁1-2个,胞浆丰富,常出现胞浆空泡;其他细胞:中性粒细胞在培养72消失后,绝大部分衰变或死亡呈碎片。形态学方法:〔镜下观察〕

---淋巴细胞转化试验第十八页,共二十二页,2022年,8月28日淋巴细胞转化率:转化的淋巴细胞转化的淋巴细胞+未转化的淋巴细胞×100%正常参考值:80%红细胞未转化淋巴细胞转化的淋巴细胞淋巴细胞转化实验瑞氏染色10×40

第十九页,共二十二页,2022年,8月28日第二十页,共二十二页,2022年,8月28日3H—TDR掺入法

---淋巴细胞转化试验T细胞受到PHA或特异性抗原刺激后,发生有丝分裂,细胞进入S期,此时在细胞培养液中加入氚标记的胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TDR),可以被细胞摄入而掺入DNA中,通过β-液体闪烁计数器测定3H-TDR的掺入量,判断细胞的增殖程度。第二十一页,共二十二页,2022年,8月28日MTT比色法

---淋巴细胞转化试验

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