乳兔关节软骨细胞的分离、培养及生物学特性的观察

乳兔关节软骨细胞的分离、培养及生物学特性的观察刘雷;韦庆军;陈管雄;谢伟;陈欢目的:建立乳兔软骨细胞分离及培养的方法,观察软骨细胞在体外培养中的MTTPCR)法观24h2.MTTRTPCR【期刊名称】《广西医科大学学报》【年(卷),期】2014(031)003【总页数】5页(P364-368)【关键词】软骨细胞;细胞培养;组织工程【作者】刘雷;韦庆军;陈管雄;谢伟;陈欢【作者单位】广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科南宁530021;广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科南宁530021;广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科南宁530021;广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科南宁530021;广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科南宁530021【正文语种】中文R-33目前研究中获得软骨细胞的来源主要是通过成年兔，但是过程较为复杂且获得的提供实验基础。材料与方法2剂与仪器：α-MEME（Hy-Clone）、胎牛血清（Gibco）、Ⅱ型胶原酶（Sigma）、胰蛋白酶（索莱宝）、CO2培养箱（Thermo公司）、四甲基偶氮唑盐（MTT）（Sigma）、定量PCR试剂盒（Roche公司）、倒置相差显微镜（OlympusIX-70）、免疫组化试剂盒（中国北京中山公司）、DAB显色试剂（中国武汉博士德公司）、逆转录试剂盒（大连宝生物工程有限公司）。实验方法1PBS0.2530min20%胎牛血清和双抗的培养基终止1mm33～437℃3～4h150锈钢网筛过滤，15mL离心管收集滤液在1000r/min下离心5min，弃上清液、加入20%胎牛血清及双抗的α-MEM培养基，吹打均匀接种于75cm2培养瓶内进行培养。1×108CO248h2～3d80%PBS2～30.25%胰酶2mL20%胎牛血1000r/min5min，加含血清培养基1∶22、40.25%胰酶消化，重悬细胞后计数，每孔接种1×104/mL细胞，按200μL/孔接种于96孔板内，分别于1，3，5，7，9d20μL/MTT4h，吸150μL/DMSO10min，使结晶物充分溶解，ThermoMK3492nm2，41，3，50.25%胰酶消化后，采用爬24（0.5mL/孔、2×104/孔），待软骨细胞贴壁9515min，PBS215s氨水内5min使细胞核蓝化。自来水浸洗，置入伊红染液内10min染色。经70%，80%，90%酒精各一次，95%酒精2次100%酒精3次逐级脱水。中性树胶固定后，即可拍照。1，3，5420min15min，130min，洗去浮色，无水乙醇进行脱水，中性树胶封片。即可拍照。Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组织化学（免疫组化）染色：对各代细胞采用爬片技术，420min。3%H2O2（无色液体）10min，PBS32～3h。PBS15min，PBS15min，PBSDAB性树胶封片。RT-PCR6P1、P3P5TrizolP1、P3、P5RNA。然RT-PCRSPSS16.0（ANOVA）qP＜0.05结果从关节取下的软骨呈乳白色，周围组织覆盖较少，用胰酶消化30min充分后，0.2%Ⅱ3～4h倒置显微镜观察软骨：通过酶消化法分离的原代软骨细胞多呈球形悬浮在培养24h1a）。3～4d1b）。6～7d1c）。9～10d的软骨细胞爬满瓶壁，细胞之间相互连接似“铺路石”样（1d）131代细胞长，呈中梭形改变。到第5，6代时，软骨细胞形态明显改变，呈长梭形，与成纤维形态类似。细胞苏木精—伊红和甲苯胺蓝染色152）。甲苯胺蓝染色：原代软骨细胞被甲苯胺蓝染色后，可见细胞内有蓝紫色的异染颗粒，尤其在生长聚集的细胞区更为明显，但经多次传代后，异染反应逐渐减弱，表现为软骨细胞甲苯胺蓝染色随传代次数的增加，其颜色逐渐变浅（见图3）。Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组化染色：原代软骨细胞内Ⅱ型胶原的表达较高，但同时也有较弱的Ⅰ型胶原表达。细胞染色后可见胞核周围及细胞外基质有黄褐色淡染区。经多次传代，Ⅰ型胶原表达逐渐升高，Ⅱ型胶原的表达逐渐减少（见图4、图5）。图1倒置显微镜下观察到的兔软骨细胞的细胞形态（×100）a：软骨细胞体外培养2d；b：软骨细胞体外培养3～4d；c：软骨细胞体外培养6～7d；d：软骨细胞体外培养9～10d图2软骨细胞苏木精—伊红染色（×100）a：第1代软骨细胞；b：第3代软骨细胞；c：第5代软骨细胞图3软骨细胞甲苯胺蓝染色（×100）a：第1代软骨细胞；b：第3代软骨细胞；c：第5代软骨细胞4软骨细胞Ⅰ型胶原免疫组化染色（×100）a13c55软骨细胞Ⅱ型胶原免疫组化染色（×100）a13c5软骨细胞生长曲线：体外培养的第2代，4代软骨细胞，潜伏期为第1～3天，第3天后开始增殖，第5天时增殖明显，呈指数增长。第7～10天后，由于细胞426）。图6软骨细胞生长曲线RT-PCR：通过检测发现随代数次数增加Ⅰ型胶原蛋白表达逐渐增加，第3，5代细胞Ⅰ型胶原表达均高于第1代细胞（P＜0.05），3，51（P＜0.05）3向发展（7）。图7Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原在软骨细胞中的基因表达＃＃P＜0.01，＃＃＃P＜0.001讨论关节软骨由软骨细胞和致密的细胞外基质组成，而细胞所占比例相对较少，如何快速有效的分离出高活性的软骨细胞是进一步研究的基础。1976年Manning等［1］首次成功报道了利用胰蛋白酶和细菌胶原酶联合消化法，将软骨细胞从坚韧消化法和机械—酶消化法，国外常用的方法有Green［2］、Klagabrun［3］Shimomura［4］。但是通过酶消化法分离乳兔关节软骨的细胞的报道却尚未见，因此本实验采用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶联合消化法，对乳兔关节软骨进行消化、分离出软骨细胞，并观察软骨细胞在体外培养生物学特性的变化。首先，我们利用胰蛋白酶具有较强的消化能力，将软骨基质内蛋白多糖分解和清除周围附着的滑膜组织。然后用Ⅱ型胶原酶对基质内的胶原网架进行消化，在随后的机械吹打中，便可将大量的软骨细胞从松散的网架内分离出来。软骨细胞属于低氧、低代谢细胞。经过长期单层培养及传代次数增加后，软骨细胞在体外的表型将难以维持，将会在细胞形态、表型及基因表达等方面发生变化，这种过程被称为软骨的去分化现象［5］。单层培养过程中，随细胞传代次数增加，细胞的形态也逐渐发生变化，原代软骨细胞贴壁后多呈短梭形、圆形及星形，并且胞质色深，胞核较圆。传至第2～4代时出现形态变为中梭形，形态多样，待到第5代后细胞大部分呈长梭形，而软骨的梭形样改变也是判断软骨细胞表型是否改变的标志［6］。高密度培养时由于局部细胞因子浓度较高，使细胞与基质间的反馈调节更为紧密，有利于细胞的增殖生长和基质沉积。若为低密度培养则不利于保持细胞表型及保持基质新陈代谢的平衡。所以在体外培养时应注意接种的密度。软骨细胞传代前后细胞的功能变化，本实验主要通过甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组化细胞周围可见少量出现，原代细胞较明显。经多次传代后染色多呈阴性。从而证明随传代次数的增加，软骨细胞分泌氨基多糖的能力下降。Ⅱ型胶原是软骨中的主要胶原成分，由软骨细胞分泌，通过Ⅱ型胶原免疫组化染色可见软骨细胞的胞核周围呈黄褐色，并且胞外有黄褐色颗粒。经传代染色逐渐减弱，而且细胞形态多呈长梭形，向成纤维细胞转变，进一步失去了表达Ⅱ型胶原和分泌氨基多糖的能力［7，8］。其生长速度也明显快于正常软骨细胞。因此，正常软骨细胞在体外培养，无法长期保持其生物学特性，随传代次数增加其分泌和增殖能力下降，并且向去分化转变。通过实验发现，选择3代以内的软骨细胞不仅生长良好，而且保持自身的生物学特性，适用于后期实验及软骨组组工程的需要。综上所述，通过采用两步酶消化法，成功从乳兔关节软骨内提取出软骨细胞。并较以往采用的成年兔取关节软骨细胞的方法，能更加方便、快捷的获得大量生物活性好，纯度高的软骨细胞。通过观察了解软骨细胞生物学特性，为进一步实施体外大量培养软骨细胞和维持细胞生物学特性的研究做了实验基础，也为组织工程软骨的研究提供了种子细胞的来源。参考文献：［1］ManningWK，BonnerWMJr.Isolationandcultureofchondrocytesfromhumanarticularcartilage［J］.ArthritisRheum，1967，10（1）：235-239.［2］GreenWTJr.Behaviorofarticularchondrocytesincellculture［J］.ClinOrthopRelatRes，1971，75：248-260.［3］KlagsbrunM.Large-scalepreparationofchondrocytes［J］.MethodsEnzymol，1979，58（8）：560-564［4］ShimomuraY，YonedaT，SuzukiF.Osteogenesisbychondrocytesfromgrowthcartilageofratrib［J］.CalcifTissueRes，1975，19（3）：179-187.［5］ChanCK，AnastassiadesTP.Anionicglycoconjugatesfromdifferentiatedanddedifferentiatedculturesofbovinearticularchondrocytes：modulationbyTGF-beta［J］.InVitroCellDevBiolAnim，1998，34（6）：492-498.［6］HoshibaT，YamadaT，LuH，etal.Nucleardeformationandexpressionchangeofcartilaginousgenesduringinvitroexpansionofchondrocytes［J］.BiochemBiophysResCommun，2008，374（4）：688-692.［7］KleinGR，VaccaroAR，AlbertTJ，etal.Efficacyofmagneticresonanceimagingintheevaluationofposteriorcervicalspinefractu