周四下午老师-遗传学实验2二

细胞与遗传实验王浩细胞与遗传医学系细胞一结果不同应激对细胞的影响及机制探讨细胞实验二细胞实验二5组细胞给予不同处理正常、缺糖损伤、药物处理现象的观察

（细胞存活情况的比较，形态学观察）根据观察到的现象设计随后的实验

（机制相关的探讨）实验内容1.不同的实验分组相同对照组（Control）

---正常培养的细胞无糖损伤组（Glucosedeprivation，GD）

---给予对数生长期细胞无糖培养约24小时顺铂20umol/l处理组（DDP20umol/l）---对数生长期细胞给予顺铂20umol/l处理24小时顺铂40umol/l处理组（DDP40umol/l）---对数生长期细胞给予顺铂40umol/l处理24小时顺铂60umol/l处理组（DDP60umol/l）---对数生长期细胞给予顺铂60umol/l处理24小时顺铂

是一种含铂的抗癌药物，即顺式-二氯二氨合铂，棕黄色粉末，属于细胞周期非特异性药物，对肉瘤、恶性上皮肿瘤、淋巴瘤及生殖细胞肿瘤都有治疗功效。作用机理顺铂进入体内后，一个氯缓慢被水分子取代，形成[PtCl(H2O)(NH3)2]+，其中的水分子很容易脱离，从而铂与DNA碱基一个位点发生配位。然后另一个氯脱离，[2]

铂与DNA单链内两点或双链发生交叉联结，抑制癌细胞的DNA复制过程，使之发生细胞凋亡。实验内容2.检测指标（1）细胞活力检测

（2）Giemsa染色（3）Hoechst33258染色cellviabilityassayWST-8检测噻唑蓝(四甲基偶氮唑盐，MTT)可透过细胞膜进入胞内活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶，能使外源性MTT(淡黄色)还原为难溶于水的蓝紫色的Formazan（甲臜）结晶，沉积在细胞中。其形成量与活性呈正相关。该结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪，在波长492nm测定其光吸收值。可间接反映活细胞的数量变化。introduction

WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色水溶性的formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞损伤越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。MTT被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶解液来溶解；而WST-8和XTT、MTS产生的formazan都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤。器材与试剂培养细胞(96孔细胞培养板)酶标仪、移液枪、枪头等试剂：CCK8检测试剂盒

DMEM培养液（高糖、无糖）

顺铂（DDP）5mg/mlCellCountingKit-8简称CCK-8试剂盒，是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的检测试剂盒。Cellviabilityassay接种5×104/ml细胞于96孔板，每孔200ul培养液；分为三组，每组五个平行孔；37oC、5%CO2培养24h（对数生长期）

----此时属正常培养，高糖培养基（10%DMEM）1、24h后，Control组继续用高糖培养基培养2、24h后，无糖损伤组弃去培养液，随后加入无糖培养基培养（弃去或加入培养基时均应小心）继续培养------GD组3、24h后，DDP（顺铂）组弃去培养液，分别加入浓度为20umol/l，40umol/l，60umol/l的培养基4、吸弃原培养液，加含CCK8试剂（10ul）的无血清DMEM培养基110ul继续培养5、37oC孵育1h~2h6、酶标仪450nm波长处测定吸光度7、计算并分析结果（统计分析）Cellviabilityassay(today)GiemsaandHoechst33258stainingGiemsaandHoechst33258staining

Cellmorphology姬姆萨(Giemsa)染液是天青色素，伊红，次甲蓝的混合液。Hoechst33258是蓝色荧光染料Giemsastaining吉姆萨染色的原理嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白和淋巴细胞胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。器材与试剂培养细胞于小盖片(6cm培养皿内)光学显微镜、移液枪、枪头、载玻片等试剂：DMEM培养液（高糖、无糖）

顺铂（DDP）5mg/ml甲醇（固定液）PBS（pH7.4）Giemsa工作液（临用现配）

Giemsa原液：PBS＝1：9混合而成。接种6×104/ml细胞于6cm培养皿（8块小玻片/皿），每皿4ml培养液；37oC、5%CO2培养24h（对数生长期）

----此时属正常培养，高糖培养基（10%DMEM）1、24h后，Control组继续用高糖培养基培养（3ml/皿）2、24h后，无糖损伤组弃去培养液，随后加入无糖培养基培养（弃去或加入培养基时均应小心）继续培养（3ml/皿）------GD组3、24h后，DDP（顺铂）组弃去培养液，分别加入浓度为20umol/l，40umol/l，60umol/l的培养基（3ml/皿）GiemsastainingGiemsastaining(today)1.每皿弃原培养基2.PBS洗涤两次，5min/次，1.5ml/皿3.甲醇固定10min，1.5ml/皿4.Giemsa染色10min，1.5ml/皿5.水洗3到4次，直至背景干净6.夹取小玻片放置于干燥载玻片上，镜下观察GiemsastainingresultsApoptosiscells:细胞皱缩、圆化，胞膜膨出、出泡（blebbing），生成膜包裹的凋亡小体（apoptoticbodies）GiemsastainingresultsGiemsastainingresultsHoechststainingHoechst33258akindofblue-fluorescencedye在细胞中Hochest33258在AT序列富集区域的小沟处与DNA结合。活细胞或固定细胞均可从溶液中摄取该染料。从而使细胞核着色。器材与试剂96孔板荧光显微镜、移液枪、枪头、载玻片等试剂：DMEM培养液（高糖、无糖）

顺铂（DDP）5mg/ml甲醇（固定液）PBS（pH7.4）Hochest33258工作液

接种5×104/ml细胞于96孔板，每孔200ul培养液；37oC、5%CO2培养24h（对数生长期）

----此时属正常培养，高糖培养基（10%DMEM）1、24h后，Control组继续用高糖培养基培养2、24h后，无糖损伤组弃去培养液，随后加入无糖培养基培养（弃去或加入培养基时均应小心）继续培养------GD组3、24h后，DDP（顺铂）组弃去培养液，分别加入浓度为20umol/l，40umol/l，60umol/l的培养基Hochest33258stainingHoechst33258staining(today)1.弃原培养基2.PBS洗涤两次，5min/次，200ul/孔3.甲醇固定5-10min4.PBS洗涤三次，5min/次，200ul/孔5.Hoechst33258染色37oC25min，25ul/孔(置于抽屉中，避光)6.PBS洗涤3次，5min/次Hoechst33258stainingresultNucleusofapoptosiscells

胞核固缩、破碎

染色质凝聚、边集等Hoechst33258stainingresultHoechst33258stainingresultGi