感受态细胞制备

1*1010感觉

态

细

胞

制

备一、实验目的1、掌握氯化钙法制备感觉态细胞的原理、方法和技术；2、掌握电转变感觉态细胞的制备原理及方法；3、学习并掌握感觉态细胞效价的检测方法。二、实验原理在基因克隆技术中，所谓转变是指质粒或重组质粒被导入受体细胞，表达相应的选择标志基因，并在必定的培育条件下，在选择性培育基上长出转变子的过程。质粒一定经过转变进入细菌细胞内，才能进行扩增和表达，从而获取大批的克隆基因。细菌汲取外源DNA的能力最高时的状态被称为感觉态细胞。有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感觉态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时，才会处于感觉态,如大肠杆菌。大肠杆菌的感觉态细胞制备原理是取对数生长久的细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转变混杂物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击办理，促使细胞汲取DNA复合物，在丰富培育基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转变的细菌中，重组子中基因获取表达。对这类现象的一种解说是CaCl2能使细菌细胞壁的通透性加强，目前还可以使用电激的方法，经过瞬时的高压电流，在细胞上形成孔洞，使外源DNA进入胞内，从而实现细胞的转变。电激转变的效率常常比化学法高出1到2个数目级，达到1x108转变子每1μgDNA，甚至1x109转变子每1μgDNA，所以常用于文库成即刻的转变或遗传挑选化学法简单、迅速、稳固、重复性好，菌株合用范围广，感觉态细菌可以在-70℃保存，所以被广泛用于外源基因的转变。物理制备法：电转法，除化学法转变细菌外，还有电击转变法，电击法不需要早先引诱细菌的感觉态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转变率最高能达到109~1010转变子/μg闭环DNA。因操作简易，越来越为人们所接受。转变后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转变子，依据此皿中的菌落数可计算出转变子总数和转变频率，公式以下：转变总数＝菌落数×稀释倍数×转变反应原液整体积／涂板菌液体积转变率（转变子数／每μg质粒DNA）＝转变子总数／质粒DNA加入量(μg)理论上转变率最高为每微克地标准质粒转变的菌落数为三、实验资料实验仪器：恒温振荡仪、恒温培育箱、低温常速离心计、移液枪、锥形瓶、离心管、LB液体培育基、实验试剂：0.1MCaCl2溶液、含10%甘油的0.1MCaCl2溶液、GYT、三蒸水、10%甘油的水溶液、DH5α、Top10、DE3、BL21、液氮、冰水。三、实验步骤（一）化学感觉态细胞的制备1）菌种的活化：取-70℃的冰箱中感觉态细胞DH5α、Top10、DE3、BL21在LB的平板长进行划线分别。2）菌种的前培育：从LB平板上挑取相应的单菌落,接种于10mlLB液体培育基中，37℃振荡培育过夜至对数生长中后期。3）菌种的准备：将该四种菌悬液以1:100的比率分别接种于四个不含有抗生100mlLB液体培育基锥形瓶中,37℃振荡培育大体2.5小时至OD=0.4~0.5。（4）感觉态细胞的制备：①把上述的锥形瓶放到冰水迅速使其冷却。把100mL培育液平均分成两份到50mL离心管中，在4℃、3000转每分钟，离心10min。②弃去上清液，加入30mL0.1M的CaCl2溶液，轻轻混匀，在冰水中静置30min。③弃去上清液，加入30mL0.1M的CaCl2溶液，用巴氏管轻轻吹吸让积淀充分混匀，在冰水中静置30min。④从冰水中拿出4℃、3000转每分钟，离心10min，弃去上清液并用移液枪轻轻地把剩余的液体吸干净，加入0.5mL含10%甘油的0.1MCaCl2溶液。用巴氏管轻轻吸起液体打到壁上使积淀混匀并搁置在冰上。⑤把液氮倒到小的塑料盒子里，在离心管架子上摆放好0.5ml离心管，用剪过的移液枪头进行分装，每个离心管中分装40μL悬浮液。⑥迅速盖好盖子放入到液氮中，使之迅速冷冻，而后放到标有感觉态细胞种类、制作者和时间的袋中，-70℃保存。（二）电转变的感觉态细胞的制备第1、2、3步同化学转变的感觉态细胞的制备过程的1、2、3三步同样。（4）制备感觉态细：①把上述的锥形瓶放到冰水迅速使其冷却。把100mL培育液平均分成两份到50mL离心管中，在4℃、3000转每分钟，离心10min。②弃去上清液，加入30mL三蒸水，用巴氏管吸起液体打到离心管壁上使积淀充分混匀，在4℃、3000转每分钟下离心10min，倒去上清。重复两次；③再加入30mL含10%甘油水溶液，在4℃、3000转每分钟下离心10min，重复一次。④弃去上清液，加入0.5mLGYTmedium(含有10%Glysiron、0.125%YeastExtraction、0.25%Trypton)，搁置在冰上。5）准备好成有液氮的塑料盒子和把0.5mL离心管若干放到离心管架子上，将悬浮的感觉态细胞分装在离心管中，每管40μl，迅速盖好盖子放入到液氮中，使之迅速冷冻，而后放在标有感觉态细胞种类、制作者和时间的袋中，-70℃保存。（三）效价检测1、化学转变：（1）取化学转变感觉态细胞于冰上解冻，同时把标准质粒PUC19稀释十倍置于冰上。2）在含有40μl感觉态细胞的0.5ml离心管中加入1μL稀释后的标准质粒充分混匀。冰上静置30min。3）将离心管置于42℃干式恒温器上90s，而后迅速放回冰上，使细胞冷却2～3min。4）向离心管中加入已预热的无菌LB培育液400μL，再转移到10ml离心管中，37℃恒温振荡培育45～60min。5）将离心管内容物混匀，分别汲取4.4μL和110μL菌液于含有AMP的LB固体培育基上，用无菌的弯头玻璃棒轻轻将细胞平均涂开，将平板置于室温下直到液体被汲取，倒置平板，在37℃过夜培育，而后经过菌落数计算效价。2、电转变:1）取电转变感觉态细胞于冰上解冻，,标准质粒也置于冰上，同时准备干净的电击杯于冰上预冷。2）在含有40μl感觉态细胞的0.5ml离心管中加入1μL稀释十倍的标准质粒，充分混匀。而后转移到电击杯中，把电击杯放在电击仪长进行电击（2500V，5ms）。3）在电击杯中加入160μL无菌LB培育液（无抗生素），而后充分混匀，汲取于10ml离心管中，置于37℃恒温振荡器中培育45～60min.4）分别取2μL和50μL涂板，涂板操作同化学转变。5）平板放到37℃的恒温培育箱过夜培育。第二天清早读取两个平板的菌落数。四、实验结果1、电转变感觉态细胞的效价：涂2μL菌液的平板上菌落数为88个，经过计算知道，电转变感觉态细胞的效价为8.8×108。2、化学转变感觉态细胞的效价：无菌落生成，同组的也没有出来结果。五、谈论1、感觉态细胞制备及转变中的影响要素①细胞生长状态和密度:不要用经过多次转接或储于４℃的培育菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感觉态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长久时为好，可经过监测培育液的OD600来控制。密度过高或不足均会影响转变效率。②质粒的质量和浓度:用于转变的质粒DNA应主若是超螺旋态DNA。转变效率与外源DNA的浓度在必定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转变效率就会降低。1ng的标准质粒即可使50μl的感觉态细胞达到饱和。一般状况下,DNA溶液的体积不该超出感觉态细胞体积的5％。③试剂的质量:所用的试剂,如CaCl2等均需是最高纯度的，并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。④防范杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管,枪优等最好是新的,并经高压灭菌办理,全部的试剂都要灭菌,且注意防范被其他试剂、DNA酶或杂DNA所污染,不然均会影响转变效率或杂DNA的转入,为此后的挑选、判定带来不用要的麻烦。⑤整个操作均需在冰长进行，不可以走开冰浴，不然细胞转变率将会降低。2、效价检测结果分析：