仪器分析技术四

仪器分析技术四第一页，共七十四页，2022年，8月28日第二节色谱分析法

(chromatography)色谱分析法概论色谱过程和基本原理气相色谱法高效液相色谱法毛细管区带电泳法薄层色谱法第二页，共七十四页，2022年，8月28日高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography,HPLC)一、HPLC的特点二、HPLC仪的主要部件三、HPLC的主要分离类型四、HPLC分析方法第三页，共七十四页，2022年，8月28日一、HPLC的特点

高效、高压、高速分离效率↑：固定相粒度很小（<10μm）；流动相的极性、组成可调，选择范围大。分析速度↑：输液泵→高压、高速

适用范围广不受被测样品挥发性和热稳定性的限制，适用于大部分有机毒物的检测。第四页，共七十四页，2022年，8月28日二、HPLC仪的主要部件第五页，共七十四页，2022年，8月28日1.高压输液系统

包括贮液器（脱气、过滤）和高压泵

等度洗脱：流动相组成不变。

梯度洗脱：按一定程序不断改变流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度、pH等，用于复杂检材，作用与GC的程序升温类似。第六页，共七十四页，2022年，8月28日2.进样器

流路中为高压力工作状态；通常使用耐高压的六通阀进样装置。MOVIE:自动进样第七页，共七十四页，2022年，8月28日3.色谱柱

柱体为直型不锈钢管，内径2～5mm，柱长10～30cm，HPLC填料粒径3-10μm，UPLC1.7μm。MOVIE:更换色谱柱第八页，共七十四页，2022年，8月28日4.检测器

常用的为紫外检测器、荧光检测器等。

普通紫外光度检测器：一次只能给出被分离组分在特定波长下的吸光度信息。

光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，色谱工作站计算机快速处理，同时给出被分离组分在全波长下的紫外吸收光谱，得到吸光度-波长-时间的三维立体谱图。第九页，共七十四页，2022年，8月28日5.色谱工作站

同步记录组分的信号强度与保留时间的色谱流出曲线；

强大的数据储存、运算和处理功能。

第十页，共七十四页，2022年，8月28日三、HPLC的主要分离类型1.液-固吸附色谱以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂；流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。不同组分与吸附剂之间的“吸附与解吸附”作用大小的差异是其分离的基础。当被测组分一定时，吸附剂的吸附作用大者，则保留时间长；同时在流动相中溶解度大者，则解吸附作用强，保留时间短。第十一页，共七十四页，2022年，8月28日液-液分配色谱固定相和流动相为两种互不相溶的液体。不同组分在两相间的分配作用大小的差异是其分离的基础。早期通过在载体上涂渍一薄层固定液制备固定相,现多为化学键合固定相，即用化学反应的方法通过化学键将固定液结合在载体表面。在液相色谱中，流动相和固定相的极性选择可显著改变组分分离状况，因而显得特别重要。根据化学键合固定相和流动相的极性（二者极性必须有较大差距），将液-液分配色谱法又分为正相色谱法和反相色谱法。第十二页，共七十四页，2022年，8月28日正相色谱法反相色谱法*固定相与流动相的极性对比流动相的极性<固定相的极性，即亲水性固定液和疏水性流动相流动相的极性>固定相的极性，即亲水性流动相和疏水性固定液适用分离的样品溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型化合物溶于有机溶剂的极性较小及非极性的分子型化合物组分保留和分离的一般规律极性小的组分保留时间短，先出峰极性大的组分保留时间短，先出峰色谱柱极性极性柱（又称正相柱）非极性柱（又称反相柱）第十三页，共七十四页，2022年，8月28日正相色谱法反相色谱法*固定相－CN,－NH2键合相…十八烷基硅烷键合相…流动相非极性或弱极性溶剂以水为基础溶剂再加入一定量与水混溶的极性调整剂，甲醇－水、乙腈－水等常用对离子型化合物的分离检测有机弱酸、弱碱及其盐：①离子抑制法：调节流动相的酸碱度，使化合物解离受抑，亲脂性↑保留↑②离子对法：在流动相中加入能与被测离子生成中性离子对的试剂，亲脂性↑保留↑第十四页，共七十四页，2022年，8月28日四、HPLC的分析方法1.定性鉴别

保留值鉴别法化学鉴别法：“离线”鉴别两谱联用鉴别法：LC-MS2.定量检测

外标法内标法第十五页，共七十四页，2022年，8月28日3.衍生化方法

紫外-可见衍生化：①目的；②衍生化试剂荧光衍生化：①目的；②衍生化试剂第十六页，共七十四页，2022年，8月28日4.柱切换技术

适用样品：体内复杂检材（组分与内源性杂质不易分离）工作原理和流程：将两根（或多根）色谱柱与检测器组合起来，使样品先在预处理柱上富集、净化，并除去大量杂质，然后进入分析柱分离分析。

应用广泛：应用该技术，样品只需简单预处理即可进行分析，故其广泛应用于毒物分析。第十七页，共七十四页，2022年，8月28日第十八页，共七十四页，2022年，8月28日第二节色谱分析法

(chromatography)色谱分析法概论色谱过程和基本原理气相色谱法高效液相色谱法毛细管区带电泳法薄层色谱法第十九页，共七十四页，2022年，8月28日毛细管区带电泳法(capillaryzoneelectrophoresis,CZE)一、概念二、基本原理和分离过程三、应用第二十页，共七十四页，2022年，8月28日一、概念和基本原理电泳：溶液中带电粒子在电场作用下发生定向迁移的现象。电泳法：利用组分的电泳现象建立的分离分析方法。分为平板电泳法和毛细管电泳法两大类。广泛用于蛋白质、氨基酸、核酸、多糖等带电分子离子的检测。区带电泳法：在电场的作用下，不同的离子成分在均一的缓冲液（或称载体电解质）系统中分离成独立的区带，分离后的区带可以用染色等方法显示出来，也可以用光密度扫描法测定其吸光度。第二十一页，共七十四页，2022年，8月28日

υ=μE

υ电泳迁移速度μ电泳淌度（电泳迁移率）

E电场强度电泳淌度（电泳迁移率）:溶质在给定缓冲溶液中和单位电场强度下单位时间内移动的距离。

CZE:

以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，在毛细管中填充缓冲溶液，在电场作用下利用两组分电泳淌度的差异进行分离的新型液相分离技术。第二十二页，共七十四页，2022年，8月28日

组分（带电粒子）的电泳迁移率与其所带电荷呈正比，与其在体系中的摩擦阻力系数呈反比。

两种组分被分离的条件：带有不同的电荷或通过缓冲溶液移动时引起的摩擦力不同。组分离子的摩擦力取决于离子的大小、形状、迁移时介质的黏度等因素。中性组分不能被分离。

υ=μE

υ电泳迁移速度μ电泳淌度（电泳迁移率）

E电场强度第二十三页，共七十四页，2022年，8月28日二、分离过程第二十四页，共七十四页，2022年，8月28日三、应用第二十五页，共七十四页，2022年，8月28日第二节色谱分析法

(chromatography)色谱分析法概论色谱过程和基本原理气相色谱法高效液相色谱法毛细管区带电泳法薄层色谱法第二十六页，共七十四页，2022年，8月28日薄层色谱法(thinlayerchromatography,TLC)一、基本原理二、操作技术三、应用第二十七页，共七十四页，2022年，8月28日一、TLC的基本原理1.分离过程：

将试样点在薄层板的一端，并将该端浸在作为流动相的溶剂中，随着溶剂向上的移动，经过试样点时，带动试样向上运动。由于不同组分在两相间吸附和解吸附作用的差异，各组分得以分离。流动相的移动是依靠毛细作用。第二十八页，共七十四页，2022年，8月28日（1）硅胶硅胶是二氧化硅（SiO2·H2O）经特殊处理后，具有均匀孔径和适当比表面积的颗粒。

吸附活性位点：硅胶表面的硅羟基，具有较强的极性和微弱的酸性。活性位点越多，吸附力越强。

钝化：硅胶吸附水分，吸附力减弱；

活化：硅胶失去水分，吸附力增强。活化条件：105-110℃，0.5-1h

2.固定相（吸附剂）第二十九页，共七十四页，2022年，8月28日（2）氧化铝为Al2O3用特殊方法处理后制备成的颗粒，具有催化活性，应用比硅胶少。分为微酸性、中性、微碱性三种。（3）吸附剂的选择原则①避免吸附力过强，否则会造成拖尾现象，或Rf过小。

②一般酸性吸附剂适用酸性和中性组分分离，碱性吸附剂适用碱性和中性组分的分离。酸性毒物首选硅胶板，碱性毒物首选氧化铝板。第三十页，共七十四页，2022年，8月28日3.流动相（展开剂）

由一种或多种溶剂按一定比例组成。混合展开剂的极性介于各单一溶剂的极性之间，并随比例不同而有差异。第三十一页，共七十四页，2022年，8月28日

溶剂极性由小到大的顺序：石油醚<环己烷<甲苯<苯<氯仿<乙醚<醋酸乙酯<正丁醇<正丙醇<丙酮<异丙醇<乙醇<醋酸<甲醇<甲酸<水第三十二页，共七十四页，2022年，8月28日

展开剂的选择：三角形法第三十三页，共七十四页，2022年，8月28日4.定性依据（1）利用组分斑点在展开后的薄层板中的位置和颜色鉴别

比移值Rf（retardationfactor）：

薄层色谱法的基本定性参数

Rf：0-1之间

Rf=0,1的含义？在实际操作中，Rf在之间为宜。第三十四页，共七十四页，2022年，8月28日（2）利用原位光密度扫描图鉴别

①用薄层光密度扫描仪将光束照射在斑点上，改变波长依次扫描，可得斑点中吸光物质的反射吸收曲线。

②比对被测物质与相应标准品的反射吸收曲线。第三十五页，共七十四页，2022年，8月28日（3）洗脱后鉴别

①针对展开后难以判断的组分斑点。

②先将其从吸附剂上洗脱下来，再用其他分析手段鉴别，如UV、GC/MS、HPLC/MS等。第三十六页，共七十四页，2022年，8月28日5.定量依据：

（1）薄层扫描法——标准曲线法（2）洗脱后定量法——先洗脱再用其他定量方法第三十七页，共七十四页，2022年，8月28日（1）薄层板制备二、薄层色谱的操作技术用吸附剂和粘合剂（羧甲基纤维素钠CMC）制板：⑴用0.1％-0.5％CMC溶液将吸附剂调成糊状，以适当的厚度（0.2～0.5mm）均匀涂于平板（玻璃）上，室温下自然晾干；⑵使用前活化。

1.定性分析第三十八页，共七十四页，2022年，8月28日

用点样器或玻璃毛细管吸取一定量试样点在原点上。试样点的直径一般应小于3mm。可并排点多个试样同时展开。（2）点样

手工点样要求：点样不能空心，多次点样、干后再点，不要损伤薄层板面。第三十九页，共七十四页，2022年，8月28日（3）展开上行法是最常用的展开方式。①将薄层板倾斜放入盛有展开剂的缸内；②待展开剂蒸气达到饱和；③将展开剂浸没薄层板下端；④展开到规定距离后，将薄层板取出，标记展开剂前沿位置；⑤晾干。第四十页，共七十四页，2022年，8月28日①荧光法：有些组份在紫外光照射下产生荧光，可在紫外灯下用铅笔将组份斑点描绘出来。②化学显色法：喷洒显色剂、碘蒸气熏或氨水熏等。（4）斑点检视（5）定性鉴别与定量检测第四十一页，共七十四页，2022年，8月28日三、应用具体用途：

判断两个化合物是否相同。确定混合物中含有的组分数。小量物质的精制。特别注意：∵①有些有机药毒物在空气中久置易产生氧化、分解产物；②体内检材提取液中可能有被测物的代谢产物。∴①薄层分析中出现多个斑点，与已知标准不便对照；

②与当地工业对照品或代谢物作对照。第四十二页，共七十四页，2022年，8月28日第三节有机质谱及两谱联用技术

有机质谱法两谱联用技术第四十三页，共七十四页，2022年，8月28日有机质谱法(organicmassspectrometry,OMS)一、质谱法的概念和基本原理二、质谱仪三、离子峰的主要类型四、质谱法的解析过程第四十四页，共七十四页，2022年，8月28日一、概念和基本原理质谱分析法应用离子化技术，使物质分子失去1个外层电子形成带1个正电荷的分子离子。离子化技术提供的能量（70eV）大于分子电离能（15-20eV），分子离子中的化学键又继续发生某些有规律的断裂，形成不同质量的碎片离子。选择其中带正电荷的离子使其在电场和磁场的作用下，根据其质荷比（m/z，离子质量与电荷之比）的差异进行分离。第四十五页，共七十四页，2022年，8月28日++++:R1:R2:R3:R4:e+M+(M-R2)+(M-R3)+MassSpectrum(M-R1)+质谱分析法中离子峰形成示意图：第四十六页，共七十四页，2022年，8月28日m/z相对离子强度按各离子m/z的顺序及相对强度大小记录的图谱称为质谱图。目前质谱法主要是与其他技术联用进行药毒物性质、结构的分析。利用质谱图中离子峰的位置进行定性和结构分析，利用离子峰强度进行定量分析。质谱图用条（棒）（bargraph）图表示。坐标正离子的m/z为横坐标相对离子强度（丰度）为纵坐标基峰(basepeak)质谱中的最强（高）峰，以其相对离子强度为100％,其它离子峰以基峰的相对百分数表示第四十七页，共七十四页，2022年，8月28日吗啡的质谱图第四十八页，共七十四页，2022年，8月28日主要部件和工作流程进样系统真空泵质量分析器*检测器放大器记录器离子源m/zI二、质谱仪第四十九页，共七十四页，2022年，8月28日1储样器2进样系统3漏孔4离子源5加速电极6磁场7离子检测器8接真空系统9前置放大器10放大器11记录器质谱仪

结构图第五十页，共七十四页，2022年，8月28日第五十一页，共七十四页，2022年，8月28日高真空系统质谱仪需要在高真空（10-410-6Pa

）下工作：进样系统离子源质量分析器离子检测器作用：(1)大量氧会烧坏离子源的灯丝；

(2)用作加速离子的几千伏高压会引起气体放电；

(3)引起额外的离子－分子反应，改变裂解模型，谱图复杂化。第五十二页，共七十四页，2022年，8月28日作用：

使样品中的分子气化后电离成离子，或直接转化成气态离子，并使其具有一定的能量。种类：1.电子轰击源（ElectronIonization，EI）2.化学电离源（Chemical

Ionization，CI）3.场致电离源（FI）离子源第五十三页，共七十四页，2022年，8月28日ElectronIonization(EI)源

应用最广，标准质谱图基本都是采用EI源（70eV）得到的。第五十四页，共七十四页，2022年，8月28日EI源：可变的离子化能量

(10~240eV)第五十五页，共七十四页，2022年，8月28日质量分析器作用：将离子源中形成的离子按m/z比的差异进行分离。原理：离子在离子源中被加速→经狭缝进入磁场→受磁场作用作匀速圆周运动

第五十六页，共七十四页，2022年，8月28日若B和U固定不变，则离子的运动半径R仅取决于离子的m/zR

离子运动半径B磁场强度U加速电压

磁场的质量色散作用：不同m/z的离子有不同的运动半径，磁场可将不同m/z的离子分离

当仪器R固定时，若保持B不变，连续改变U（电压扫描），或保持U不变，连续改变B（磁场扫描），可使离子按m/z大小顺序通过狭缝到达检测器第五十七页，共七十四页，2022年，8月28日离子检测器与放大器、记录器作用：

接收并放大微弱的离子流信号送至显示单元和计算机处理系统样品的质谱图和数据第五十八页，共七十四页，2022年，8月28日分子离子峰碎片离子峰同位素离子峰三、离子峰的主要类型第五十九页，共七十四页，2022年，8月28日分子离子峰概念分子电离一个电子形成的离子所产生的峰。用途确定化合物的相对分子质量推断分子式峰位（m/z值）等于化合物的相对分子质量一般出现在质谱图的最右端，但也有例外相对强度取决于分子离子的化学稳定性第六十页，共七十四页，2022年，8月28日稳定性顺序：芳香化合物＞共轭链烯＞烯烃＞脂环化合物＞直链烷烃＞酮＞胺＞酯＞醚＞酸＞支链烷烃＞醇第六十一页，共七十四页，2022年，8月28日思考

在相同仪器分析条件下，如果分析出芳香化合物的分子离子峰强度明显弱于醇类化合物，说明什么？第六十二页，共七十四页，2022年，8月28日样品不纯或仪器有污染时，杂质峰可能出现在最高质荷比处。样品分子的稳定