基因的克隆与转化

实验四基因的克隆与重组质粒的转化实验目的掌握外源基因与载体连接的原理及方式理解重组体转化大肠杆菌的条件了解转化的过程实验步骤及原理纯化载体特定基因与载体连接重组载体转化大肠杆菌筛选含重组子的大肠杆菌载体外源DAN片段不能在细菌中稳定遗传，随细菌的繁殖而扩增。须有载体携带进入宿主细胞专为分子克隆提供的载体特点：多为环形含多克隆位点，可选择适当内切酶切开含抗药基因，可使宿主在含某种抗菌素的培养基上存活可在宿主细胞中自我复制，也可随宿主细胞的繁殖而扩增外源基因与载体连接外源DNA片段与载体的连接有多种方式，选择不同酶切，连接方式也不同。单酶切产生平端切口，与外源DNA片段连接，效率很低。因Taq酶的特殊活性，PCR产物3‘-末端常有突出的A。针对此特点，有3‘-末端突出的T载体。单酶切产生粘末端，连接效率较高，但因载体两端的粘末端相同，故外源DNA片段的连接没有方向性，载体本身也容易回连。双酶切产生粘性末端，连接效率高，且可确定插入片段的方向。单酶切产生平端切口单酶切产生粘末端双酶切产生粘性末端重组载体转化大肠杆菌转化的关键是制备感受态细菌，使受体菌处于易于吸收和容纳外源DNA的易感状态。常用方法是氯化钙冰浴法。0ºC条件下用低渗CaCl2

溶液处理快速生长的细菌，使细胞壁疏松，细菌膨胀成球形。重组DNA分子易吸附于感受态细胞表面，短暂的42ºC热处理促进细胞对质粒的吸收。制备感受态细菌CaCl20ºC重组DNA分子进入细胞筛选含重组子的大肠杆菌转化细菌的培养由于质粒携带抗药基因，故获得质粒的细菌可在抗性培养基上生长，形成单菌落。重组子单菌落的筛选获得质粒的细菌均可形成单菌落，故需进一步鉴定具有外源基因插入的重组子单菌落，常用方法是蓝白筛选（筛选原理下一实验详细介绍）。操作步骤载体及目的基因的酶切酶切产物的纯化载体与目的基因的连接感受态细胞制备与转化载体及目的基因的酶切载体的酶切：目的基因的酶切：质粒(Bluescript)4µlPCR纯化产物+ddH2O至64µl10×Buffer2µl10×Buffer8µlBamHⅠ1µlBamHⅠ4µlEcoRⅠ1µlEcoRⅠ4µlddH2O12µl总体积20µl80µl分别混匀，置37oC保温1.5小时酶切产物的纯化混合两组酶切产物，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，方法见实验三。载体与目的基因的连接纯化产物溶于8µl水中，再加入：10×T4DNA连接酶缓冲液1µlT4DNA连接酶1µl总体积10µl16oC保温4小时或过夜，-20oC冷冻保存感受态细胞制备（一）受体菌的活化取冻存XL1-blue菌株，划线接种于LB(amp-)固体培养基上，37oC培养过夜。培养单菌落用接种棒挑选单菌落接种于50mlLB(amp-)液体培养基，37oC振荡培养6-8小时制备感受态菌的最佳时机一般以菌液出现轻度混浊为宜。感受态细胞制备（二）3000rpm离心5min，弃上清。25ml预冷的0.1MCaCl2悬浮菌体沉淀，置冰浴中静置30min。3000rpm离心5min，弃上清。1ml预冷的0.1MCaCl2悬浮菌体沉淀，置冰浴中过夜。转化（一）取1.5ml离心管3支，按下表操作：实验组阳性对照组阴性对照组感受态菌液100μl100μl100μl连接反应液5μlpBluescript1μl42oC准确水浴90秒，迅速取出，置冰水浴。各管加入amp+LB培养液200μl，混匀，37振荡复苏45min。转化（二）取4皿amp+固体培养基，每皿加入IPTG8μl，X-gal40μl，均匀涂布，置37oC恒温箱至液体消失。阳性对照与阳性对照各取50μ