第五章目的基因的获取

第五章目的基因的获取把需要研究的基因称为目的基因（靶基因或者插入基因）。要分离、改造、扩增或表达的基因。

目的基因：如：生长激素基因、干扰素基因等。就是几千个或几百个甚至更少的碱基对的DNA片段。生物种类人拟南芥果蝇水稻蠕虫流感病毒基因数目（万个）3~42.551.3651.780.175单个gene在整个基因组中所占的比例极其微小，加上复杂的基因间序列；对单个目的gene的分离如同大海捞针。已知基因的获取方法：⒈PCR技术扩增目的基因⒉化学方法人工合成目的基因未知基因的获得途径：⒈构建基因组文库利用鸟枪法克隆目的基因2.构建cDNA文库，筛选目的基因3.mRNA差异显示技术筛选差异表达基因4.酵母双杂交体内鉴定基因本章内容第一节基因组DNA的片断化

第二节基因的化学合成第三节目的基因的保存和扩增第四节目的基因的分离和扩增

第一节基因组DNA的片断化二、限制性内切酶消化法一、

机械切割法一.机械切割法（1）超声波断裂成约300bp的随机片断（2）高速搅拌1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断（3）移液器抽吸法二、限制性内切酶消化法用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。酶切基因组DNA1.优点

如果带有粘性末端，产物可以直接与载体连接，连接效率高2.缺点①目的基因内部可能有内切酶的切点BamHIBamHIBamHIGene目的基因也被切成碎片！②消化的片断分子量太大或太小不符合载体容量，不能克隆解决的办法采用随机片断化制备DNA的克隆片断3.限制性内切酶局部消化法控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。①内切酶识别位点的碱基数影响所切出的产物的长度和随机程度限制性内切酶的选用原则1）4bp的内切酶平均每4096（46）bp一个切点。2）6bp的内切酶平均每256（44）bp一个切点随机程度高。如HaeⅢ、AluI、MobI、Sau3AI②内切酶粘性末端能与常用克隆位点相连Sau3AIBamHI5’-GATC-3’5’-GGATC-3’文库：是指一种全体的集合。通过克隆方法保存在适当宿主中的某种生物、组织、器官或细胞类型的所有DNA片段而构成的克隆集合体。

克隆并不是为了保存，而是为了分离。

第三节目的基因的保存和扩增一、基因文库（genelibrary）1.基因文库为什么要建基因文库？高等生物的基因组DNA十分复杂，单个基因在基因组或某个特定发育阶段或特定组织中所占比例很小。因此，要想从庞大的基因组中分离某个特定的未知基因非常难的，必须构建基因文库，利用文库筛选技术获得该基因的阳性克隆，然后对其进行分析。基因文库的分类基因组文库：提取染色体基因组DNA。如果要研究的是控制基因表达的调控序列，或是在mRNA中不存在的某种特定序列。cDNA文库：mRNA反转录成的cDNA。如果研究的目标是弄清一种蛋白质的氨基酸序列，可以根据克隆的cDNA分子的核苷酸序列推导出来。mRNA结构图DNA结构图2.基因文库的构建载体的制备DNA的提取及片段化、cDNA的合成载体与插入片段的连接

重组DNA分子导入宿主菌转化细胞的筛选将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中繁殖保存和扩增。二、基因组文库的构建1.基因组文库理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因筛选目的基因目前常用的载体2.载体选用载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少对载体的要求载体系列：容量为24kpcosmid载体：容量为50kbYAC：容量为1MbBAC:容量为300kb（1）λ噬菌体载体最常用

插入型载体构建文库时，通常用限制性核酸内切酶切割位于λ噬菌体DNA非必需区的单一酶切位点，以供外源基因片段的插入，插入片段适宜长度约为9kb。

替代型载体构建文库时，需要将非必需区两边的臂进行分析纯化，才能用于连接，插入片段适宜长度约为9～22kb。（2）黏粒载体不仅能克隆和增殖完整的真核基因，还可克隆和分析组成某一基因家族或基因座的真核DNA片段。构建过程与噬菌体文库的构建过程相似。（3）YAC、BAC载体克隆大片断DNA的载体。可用来克隆完整的动物基因。在人类基因组计划中，YAC被广泛地用于大规模基因组结构分析。最早用于基因克隆的载体。只能容纳比质粒分子量更小的片段。不能用于核基因组文库。适合于短序列的克隆文库。叶绿体DNA文库、线粒体DNA文库、cDNA文库。（4）质粒载体3.基因组文库构建的一般步骤（1）基因组DNA的提取关键:制备高分子质量的基因组DNA经典的方法：在EDTA和SDS存在下，用蛋白酶K消化细胞，然后用酚－氯仿混合液抽提蛋白质，并用透析法去除分子质量杂质。在提取时必须尽可能地避免机械切割关键：断点完全随机，片断长度合适于载体连接（2）DNA克隆片段的制备超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）①物理切割法：内切酶Sau3A进行局部消化。可得到10-30kb的随机片断②酶切法：（3）载体与基因组DNA大片段的连接①粘性末端直接连接载体与外源DNA大片段的两个末端都有相同的粘性末端。如：Sau3A与BamHI的酶切末端。直接连接、人工接头或同聚物加尾②人工接头法人工合成的限制性内切酶粘性末端片断各种酶的接头可以向公司定做或购买接上人工接头粘性末端CCCCCC末端转移酶粘性末端③同聚物加尾4.基因组文库的大小一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目N=ln(1-p)ln(1-f)p:文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）f:插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因组DNA的百分数N:所需的重组载体数（克隆数）基因文库的大小以及从中获得特定序列的概率的计算公式：例如：人的基因组是3×109

bp，插入DNA片断的平均长度如果是1.7×104

bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4.61×GfN=4.61×GfG:Genome大小；f:fragment大小N=4.61×Gf=4.61×3×1091.7×104=8.1×1055.基因组文库的扩增及保存（1）基因组文库的扩增①液体培养增殖法最简便混合培养方法：从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆子转入含适当的抗生素培养基中，混合的细菌生长数代后，其培养物于-80℃储存（加终浓度为25%的甘油）缺点：由于细菌在液体中以混合群体的形式生长和不同克隆生长速率的差异，导致文库中某些特定的序列过多或过少。保存单个克隆子于含有甘油的培养基中方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合适的含抗生素的培养基中，菌体生长到一定浓度后，加入终浓度为25%的甘油，于-80℃保存。缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大。384孔板②影印滤膜培养法失真最小，最麻烦用包装后的噬菌体颗粒感染细菌，并让细菌在硝酸纤维素膜上生长，然后将滤膜上的文库影印到其他滤膜上，以供筛选和低温（-80℃）保存。③制备已包装的转导性裂解物适用于粘粒文库，转导性裂解物可以在低温下长期保存。（2）基因组文库的保存小包装，方便，避免反复冻融噬菌体一类的基因文库：密封，加入少许氯仿，在4℃冰箱内可较长时间地保存（6个月），低温冰箱可保存数年。500kb50-300kb100-300kb，浓缩产物浓度达到100ng/ul三、cDNA文库的构建cDNA文库：是指某种生物体某一发育时期所转录的全部的mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。cDNA文库具有组织细胞特异性，具有时效性。为什么要构建cDNA文库？真核生物的基因组DNA庞大且含有大量的重复序列，难以分离到目的基因片段。1.cDNA以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。mRNAcDNA3’3’5’5’反转录酶引物2.cDNA文库的特点（1）不含内含子序列（2）可以在细菌中直接表达（3）包含了所有编码蛋白质的基因（时效性）（4）比基因组DNA文库小得多，容易构建3.构建cDNA文库的一般步骤（1）mRNA的来源特点：多数基因的表达具有不同程度的组织特异性和发育阶段性。

选用mRNA含量高的组织材料，或通过药物等方法提高mRNA的含量。高丰度：当特定的mRNA在细胞总mRNA群体中所占比例达到50～90％时。低丰度：当上述比例小于0.5％时。分离mRNA用商业化的Oligo

dT纤维柱。利用真核生物mRNA都含有一段30～300个A组成的polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。mRNA只占总RNA的1%-5%。（2）mRNA的分离纯化①原理②mRNA的分离纯化纤维素柱层析法③mRNA的长度哺乳动物mRNA长度为500-8000bp，大部分mRNA位于1.5-2.0kb。反转录酶（3）cDNA的合成①cDNA第一链合成逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。a.Oligo

dT引导合成法从3’-开始，无法到达5’-末端mRNAcDNA3’5’5’AAAAAAATTTTTTTOligo

dT引物RNA－DNA杂交分子mRNAb.随机引物引导的cDNA合成法合成6～10个核苷酸长的寡核苷酸短片段，作为合成第一链cDNA的引物。随机引物可用于合成特长的mRNA分子5’mRNA3’用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。mRNAcDNA3’3’5’5’反转录酶引物mRNAcDNA第一链3’3’5’5’引物cDNA第一链3’5’引物②降解mRNA模板RNaseH剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA。cDNA第一链5’cDNA第二链合成DNA聚合酶cDNA第一链cDNA第二链5’3’③cDNA第二链合成自我引导合成法④去掉发卡结构核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉发卡结构（这会导致cDNA中有用的序列被切掉！）。cDNA第一链cDNA第二链5’3’cDNA第一链cDNA第二链5’3’5’3’这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断。妙用RNaseH（置换合成法）小片断正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成冈崎片断。优点：a）合成cDNA的效率高

b）直接利用第一链的反应产物，不需纯化

c）避免使用S1核酸酶来切割双链cDNAmRNAcDNA3’5’反转录酶引物mRNAcDNA第一链3’5’引物mRNAcDNA第一链3’5’mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二链cDNA第一链3’5’RNaseHDNAligase去引物在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。（4）cDNA与载体连接：接上人工接头粘性末端CCCCCC末端转移酶4.cDNA文库的大小一个cDNA文库要包含99%的mRNA时所需要的克隆数目。:某一种低丰度（不足14份拷贝）mRNA占细胞整个mRNA的比例N=ln(1-p)ln(1-)1nP:文库包含了完整mRNA的概率（99%）N:所需的重组载体数（克隆数）1ncDNA文库构建的实例三、cDNA和基因组文库的区别GenomeDNAlibrary基因组DNA生物体的每个gene有一个clonecDNAlibrarymRNA只包含生物体特定组织、特定发育阶段表达的gene出发材料：所包含gene:（一）cDNA文库1.cDNA文库的优点

②可用于RNA病毒的文库构建，为什么？①文库的筛选比较简单易