生物分离工程第三章

3初级分离内容提要3.1沉淀分级3.2泡沫分离初级分离特点初级分离：从各种原料（菌体发酵液，细胞培养液，细胞破碎液，及其他各种生物原料）中初步分离和浓缩得到一定浓度的目标产品。初级分离的对象：体积大，杂质含量高；初级分离技术：操作成本低，适于大规模生产。

沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。采用沉淀的手段，主要是为了通过沉淀达到浓缩的目的，或者通过沉淀，固液分相后，除去留在液相或沉积在固体中的非必要成分；其次，沉淀可以将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。沉淀方法用于分离纯化是有选择性的，即有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分。3.1沉淀分级沉淀法

生物分子在水中形成稳定的溶液是有条件的，这些就是溶液的各种理化参数。任何能够影响这些条件的因素都会破坏溶液的稳定性。

沉淀法就是采用适当的措施改变溶液的理化参数，控制溶液的各种成分的溶解度，从而将溶液中的欲提取的成分和其它成分分开的技术。

沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目前仍广泛应用在工业上和实验室中。

沉淀操作常在发酵液经过过滤和离心（除去不溶性杂质及细胞碎片）以后进行，得到的沉析物可直接干燥制得成品或经进一步提纯，如透析、超滤、层析或结晶制得高纯度生化产品。操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小时，常采用间歇法。不管哪一种方式操作步骤通常按三步进行：沉淀法操作步骤①首先加入沉淀剂;②沉淀剂的陈化，促进粒子生长；③离心或过滤，收集沉淀物。加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、收率和沉淀物的形状都有很大影响。沉淀法的分类根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为：（1）盐析法；（2）等电点沉淀法；（3）有机溶剂沉淀法；（4）非离子型聚合物沉淀法；（5）聚电解质沉淀法；（6）高价金属离子沉淀法等。除第（3）种有机溶剂沉淀法也能适用于抗生素等小分子外，其他各种方法只适用蛋白质等大分子。3.1.1蛋白质的表面特性蛋白质的溶解行为是一个独特的性质，由其组成、构象以及分子周围的环境所决定。一般而言，小分子蛋白质比大分子蛋白质更易溶解。蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所以其大部分是亲水的，但其内部大部分是疏水的。蛋白质是两性高分子电解质，主要由疏水性各不相同的20种氨基酸组成。在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向内部折叠的趋势，使亲水性氨基酸残基基本分布在蛋白质立体结构的外表面。即便如此，一般仍有部分疏水性氨基酸残基暴露在外表面，形成疏水区。疏水性氨基酸含量高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。因此，蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、亲水区和疏水区构成。蛋白质分子表面的憎水区域和荷电区域防止蛋白质凝聚沉淀的屏障⑴蛋白质周围的水化层可以使蛋白质形成稳定的胶体溶液。⑵蛋白质分子间静电排斥作用。（存在双电层）因此，可通过降低蛋白质周围的水化层和双电层厚度（ζ电位）降低蛋白质溶液的稳定性，实现蛋白质的沉淀。蛋白质胶体溶液的稳定性蛋白质可以看作是一个表面分布有正、负电荷的球体，这种正、负电荷是由氨基和羧基的离子化形成的，换句话说，该球体是带有均衡电荷分布的胶体颗粒。因此，蛋白质的沉淀，实际上与胶体颗粒的凝聚和絮凝现象相似。★静电斥力★吸引力蛋白质/胶体颗粒的凝聚和絮凝现象相似

蛋白质粒子在水溶液中是带电的，带电的原因主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。因溶液是电中性的，水中应有等当量的反离子存在。蛋白质表面的电荷与溶液中反离子的电荷构成双电层。3.1.2盐析沉淀早在1859年，从血液中分离蛋白质，随后:尿蛋白、血浆蛋白。在蛋白质溶液中加入中性盐后会压缩扩散双电层、降低ζ电位，即中性盐既会使蛋白质脱水，又会中和蛋白质所带电荷，使颗粒间的相互排斥力失去，在布朗运动的互相碰撞下，蛋白质分子结合成聚集物而沉淀析出。Cohn方程式现在常用Cohn经验式来表示蛋白质的溶解度与盐的浓度之间的关系：㏒S=β－ＫsＩ

式中S——蛋白质的溶解度，g/L;I－一离子强度等于I=1/2∑mizi2;mi——离子i的摩尔浓度；

Zi——所带电荷；

β——常数，与盐的种类无关，但与温度、pH和蛋白质种类有关;Ks——盐析常数，与温度和PH无关，但与蛋白质和盐的种类有关。有时为简单计，也可以用浓度代替离子强度，则上式成为Cohnx经验式（用浓度代替离子强度）

式中m为盐的摩尔浓度.用盐析法分离蛋白质的二种方法⑴在一定的pH值及温度条件下，改变盐的浓度（即离子强度）达到沉淀的目的，称为“Ｋs”分级盐析法。（Ks盐析：固定pH,温度，改变盐浓度）⑵在一定的离子强度下，改变溶液的pH值及温度，达到沉淀的目的，称为“β”分级盐析法。（β盐析：固定离子强度，改变pH及温度。）虽然Cohn公式能够描述盐析状态下蛋白质的溶解度，但它不能体现低盐浓度（盐溶状态）下蛋白质的溶解度。盐析操作硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂硫酸铵的溶解度在0～30℃范围内变化很小20℃时的饱和浓度约为4.05mol/dm3（534g/dm3)，饱和溶液密度为1.235kg/dm3用1.0dm3水制备硫酸铵的饱和溶液，需加入761g硫酸铵，饱和溶液体积为1.425dm3加盐方式采用硫酸铵进行盐析时可按二种方式加入：①直接加入固体(NH4)2SO4粉末，工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入，并充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高；②是加入硫酸铵饱和溶液，在实验室和小规模生产中，或(NH4)2SO4浓度不需太高时，可采用这种方式，它可防止溶液局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。用硫酸铵分级盐析蛋白质时，盐析出某种蛋白质成分所需的硫酸铵浓度一般以饱和度来表示。实际工作中将饱和硫酸铵溶液的饱和度定为100%或1。盐析某种蛋白质成分所需的硫酸铵数量折算成100%或1饱和度的百分之几，即秒为该蛋白盐析的饱和度。饱和度可以根据情况用下述两种方法计算。

1．饱和硫酸铵溶液法

在蛋白质溶液的总体不大，要求达到饱和度在50%以下时，可选用此方法。在已知盐析出某各蛋白质成分所要过到饱和度时，可按下列公式计算出应加入饱和硫酸铵溶液的数量：

式中：

V0——蛋白质溶液的原始体积；

C2——所要达到硫酸铵饱和度；

C1——原来溶液的硫酸铵饱和度；

V——应加入饱和硫酸铵溶液的体积。

将计算所得体积的饱和硫酸铵溶液加入到混合蛋白质溶液中，即可达到盐析的目的。严格讲，混合两不同溶液时，混合后的总体积并不等于混合前两种溶液体积之和，而上式中是按相等于计算的，所以会产生误差。但实验证明所造成的误差一般小于20%，故可忽略不计。

2．固体硫酸铵法

所需达到的饱和度较高，而蛋白质溶液的体积又不能再过分增大时，采用直接加入固体硫酸铵的方法。欲达到某到饱和度可按下列公式计算出应加入固体硫酸铵的数量：是将1L饱和度为C1溶液提高到饱和度为C2时，需要加入固体硫酸铵的重量（g）。G和A为常数，数值与温度有关。现在已将达到各种饱和度所需固体硫酸铵的数量列成表，使用时不需计算可直接从表中查出。现考虑向1dm3蛋白质溶液中加入硫酸铵至某一浓度使蛋白质发生盐析操作。由于加入硫酸铵后溶液的体积增大，在20℃下，硫酸铵的摩尔浓度从Ｍ１增大到Ｍ２所需加入的硫酸铵量（克）可由下式计算上式如以饱和度表示，则从S1%增至S2%，需加入克数为上式上式还可以列成表，更为方便。实际所需(NH4)2SO4的饱和度，需通过试验决定。对多数蛋白质，当达到85%饱和度时，溶解度都小于0.lmg／L，通常兼顾收率与纯度。典型的硫酸铵盐析过程

最适饱和度是35%~55%204060800100总蛋白目标蛋白质上清液浓度饱和度阴阳离子盐析效果阴离子盐析效果：柠檬酸＞PO43-＞SO42-

＞CH3COO-＞Cl-＞NO3-＞SCN-阳离子盐析效果：NH4+＞K+＞Na+

＞高价阳离子硫酸铵：（1）价廉；（2）溶解度大，稳定蛋白质；（3）水解变酸；（4）高pH释氨，腐蚀；（5）残留产品有影响。盐析注意事项：（1）稳定pH用磷酸缓冲液（2）硫酸铵加入后体积变大（3）选择饱和度（4）分步盐析（5）初始蛋白浓度3.1.3等电点沉淀

在低的离子强度下，调pH至等电点，使蛋白质所带净电荷为零，降低了静电斥力，而疏水力能使分子间相互吸引，形成沉淀。本法适用于憎水性较强的蛋白质，例如酪蛋白在等电点时能形成粗大的凝聚物。但对一些亲水性强的蛋白质。如明胶，则在低离子强度的溶液中，调pH在等电点并不产生沉淀。图3.6表示大豆蛋白的溶解度随pH的变化情况。（1）适用于疏水性强的蛋白质（2）中性盐浓度增大时，等电点向偏酸方向移动，同时最低溶解度会有所增大。（3）无机酸通常价格便宜，无毒（4）蛋白质对低pH敏感，易失活（5）在调节等电点时，如果采用盐酸、氢氧化钠等强酸强碱，要注意防止酶的失活或蛋白变性。为了使pH缓慢变动，也可用乙酸、碳酸等弱酸和碳酸钠等弱碱。

酶、蛋白质、核酸、多糖类生化物质的水溶液中加入乙醇、丙酮等水溶性的有机溶剂，它们的溶解度会显著降低，从溶液中沉淀出来。有机溶剂沉淀的优点是：分辨率比盐析法高，溶剂容易除去并可以回收。缺点是易使酶变性。3.1.4有机溶剂沉淀法

加入有机溶剂使溶液的介电常数减小，增加酶、蛋白质、核酸等带电粒子之间的作用力，因相互吸引聚合沉淀。有机溶剂的加入也使水的极性减小，使两性电解质在溶液中的溶解度降低。有机溶剂会降低蛋白质分子的溶剂化能力，破坏蛋白质的水化层，使蛋白质沉淀。有机溶剂沉淀的原理1使用有机溶剂沉淀时，操作必须在低温下进行，以减少蛋白质的变性。2所用有机溶剂须预先冷却到-10~-20℃；3有机溶剂要缓缓加入，防止溶液局部升温。4中性盐会增加蛋白质在有机溶液中的溶解度，溶液中的中性盐浓度越高，沉淀蛋白质所需要的有机溶剂浓度也越大5常用的有机溶剂有乙醇、甲醇、丙酮等。

在有机溶剂-水混合溶剂中蛋白质的聚沉非离子型聚合物

聚电解质沉淀

金属离子沉淀

自学3.1.5其它沉淀法3.1.6沉淀生成动力学溶解度是一个平衡特性，但是溶解度值的降低是一个动力学过程。当体系变得不稳定以后，分子互相碰撞并产生聚并作用。通常认为相互碰撞由下面几种运动引起：①热运动，Bromnian运动；②对流运动，由机械搅拌产生；③差示沉降，由颗粒自由沉降速度不同造成的。沉淀过程６个步骤：(1)初始混合(2)新相生成(3)布朗运动凝集(4)机械碰撞凝集(5)絮体破碎(6)聚集体陈化，在陈化过程中，絮体取得大小和阻力的平衡。沉淀法应用利用蛋白质沉淀大规模提纯

白蛋白与免疫球蛋白的工艺柠檬酸的生产萃取一沉淀法提取分离茶多酚利用蛋白质沉淀大规模提纯

白蛋白与免疫球蛋白的工艺柠檬酸的生产柠檬酸生物技术是工业和学术界都感兴趣的领域，长期以来柠檬酸生产是发展工业生物技术并促使新老技术交接的驱动力之一。加热到70度标准沉淀法回收柠檬酸流程图新工艺的主要种类我国从上世纪60年代就开始研究非钙盐法的提取工艺，近三、五年取得了实质性突破。根据行业科技交流刊物的报道，已进行过中试或生产规模试验的技术有三类：（1）是中国科学院和阜阳柠檬酸厂合作的“工业离子色谱法（ILCS）法”（离色法）；（2）另一种是江南大学的“连续变温逆流色谱分离法”（色谱法）；（3）还有天津科技大学的“吸附交换分离法”（吸交法）。儿茶素类化合物是茶多酚的主要成分，其结构式可表示为：萃取一沉淀法提取分离茶多酚茶多酚(1)我国茶叶资源丰富，开发茶叶的新用途，尤其是利用低档茶叶或茶叶加工的下脚料来生产茶多酚等精细化学品，实属科教兴农、利国利民的有力举措。(2)茶多酚的提取方法比较多，各有特点。具体采用哪种方法视技术经济条件和茶叶资源而定。(3)从绿茶叶中提取茶多酚的同时，应尽可能提取茶叶中的咖啡碱和天然色素等，以实现茶叶的综合利用，以期获得最好的经济效益。(4)茶多酚作为新型天然抗氧化剂，在食品加工、医疗保健药品、日用化学品等方面具有重要的应用。随着科学研究的深入，其应用领域必将进一步扩大。沉淀法提取茶多酚工艺图萃取法的一般工艺路线萃取法和沉淀法提取茶多酚工艺图采用萃取一沉淀法由茶叶中分离提取茶多酚的收率较之于单纯的萃取法或沉淀法都要好。提取处理时比较适宜条件为：80％乙醇作为浸提溶剂，萃取回流时间在2h左右。萃取介质的pH值在3～4，以ZnCI2作为沉淀剂处理浓缩液，6mol/LHCl对沉淀进行转溶处理。最后得到的茶多酚粗品中含量约在70％，呈棕色结晶性粉末；精茶多酚中茶多酚含量在85％以上，呈浅黄色结晶。3.2泡沫分离泡沫分离又称泡沫吸附分离技术。早在1915年就开始应用于矿物浮选；但是对离子、分子、胶体及沉淀的泡沫吸附分离是在20世纪50年代末才引起人们的兴趣与重视，并逐渐作为一种单元操作加以研究，首先是从溶液中回收金属离子的课题开始，前期研究了泡沫分离金属离子的可行性，然后建立了金属离子与表面活性剂离子之间相互作用的扩散－双电层理论。20世纪60年代中期，脱除洗涤剂工厂排放的一级污水和二级污水中的表面活性剂－直链烷基磺酸盐和苯磺酸盐获得成功。20世纪70年代，进行了染料等有机物与废水泡沫分离的实验研究，1977年开始有报道用阴离子表面活性剂泡沫分离DNA、蛋白质及液体卵磷脂等生物活性物质。如：溶菌酶、白蛋白、促性腺激素、胃蛋白酶、凝乳酶、血红蛋白、过氧化氢酶、卵磷脂、β－淀粉酶、纤维素酶、D－氨基酸氧化酶、苹果酸脱氢酶等等。随着工业的发展，特别是对环境保护的普通重视和资源综合利用的要求，泡沫分离的研究工作将不断扩大范围，其工业应用将越来越多。泡沫分离法的分类泡沫分离是以气泡为介质，利用组分的表面活性差进行分离的一种分离方法无泡沫分离是指用鼓泡进行分离，但不一定形成泡沫层，可分鼓泡分馏和溶媒浮选。鼓泡分离是从塔设备底部通气鼓泡，表面活性物质被气泡富集并上升至塔顶，和液相主体分离，使溶质得到浓缩，液相主体被净化；溶媒浮选是在溶液顶部置有一种与其互不相溶的溶剂，用它来萃取或富集由塔底鼓出的气泡所吸附的表面活性物质。泡沫分离按分离对象是溶液还是含有固体离子的悬浮液、胶体溶液而分成泡沫分馏(FoamFractionation)和泡沫浮选(FoamFlotation)。泡沫分馏用于分离溶解物质，它们可以是表面活性剂加洗涤剂，也可以是不具有表面活性的物质如金属离子、阴离子、蛋白质、酶等。但它们必须具有和某一类型的表面活性剂结合的能力，当料液鼓泡时能进入液层上方的泡沫层而与液相主体分离。由于它的操作和设计在许多方面可与精馏相类比，所以称它为泡沫分馏。

泡沫浮选用于分离不溶解的物质，按照被分离对象是分子还是胶体，是大颗粒还是小颗粒等等，又可分为:1矿物浮选，用于矿石和脉石离子的分离；2粗粒浮选和微粒浮选，常用于共生矿中单质的分离，前者粒子直径大致1～10mm内，后者的粒子直径为1μm～1mm，处理的对象为胶体、高分子物质或矿浆；3粒子浮选和分子浮选，用于分离非表面活性粒子或分子，需要向体系中加入浮选捕集剂与被分离组分形成难溶或不溶物，然后以浮渣形式将其脱除；4沉淀浮选，首先利用改变溶液的pH值或加入某种絮凝剂等方法，使需脱除的粒子形成沉淀，再利用浮选法将沉淀脱除；5吸附胶体浮选，是以胶体粒子作为捕集剂，选择性吸附所需的溶质，再用浮选法除去。泡沫分离技术除了在选矿方面比较成熟外。在其他方面尚属开发阶段，命名和分类尚不完善，但由上所述，可以对泡沫分离技术有大体的了解。泡沫分离原理

泡沫分离过程是利用待分离物质本身具有表面活性(如表面活性剂)或能与表面活性剂通过化学的、物理的力结合在一起(如