结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法的建立与应用

结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法建立与应用目建立结核分枝杆菌荧光定量PCR探讨荧光PCR检测痰标本中结核分枝杆菌应,并构建标准品。对102例45,PCR法、痰涂片抗酸染色法检测结核分枝杆菌。结果荧光定量PCR100%、30%。结论荧光定量PCR是一个快速、敏感性高、特异性强结核分枝杆菌含相关键应用价值。【关键词】结核;分枝杆菌;抗酸染色;荧光定量PCREstablishment and application of fluorescence quantitative PCR for detection Mycobacteriumtuberculosis.ZHUYu-lan,WANGDian-peng,GAOZhao-xian,etal.InternationalTravel AgencyHealthCareCenter, ShenzhenEntryandExitInspectionQuarantineBureau,Shenzhen518033,Guangdong,P.R.ChinaAbstract:Objective ToconstituteamethodfordetectionofMycobacteriumtuberculosisbyfluorescencequantitativePCRandevaluatetheapplicationvalueoffluorescencequantitativePCRindetectionofMycobacteriumtuberculosisinsputum. Methods Theprimersandprobeweredesignedandconstitute astandards.The suptumsamplesfrom102tuberculosispatientsand45non-tuberculosispatientsweredetectedbyfluorescencequantitativePCRandacid-faststain.Results The positive rates and specificity of fluorescence quantitative PCR, stain,were100%and30%respectively. Conclusion FluorescencequantitativePCRisamethodfordiagnosisoftuberculosis,whichshowsahighspecificityandsensitivity.Itisausefultoolfordiagnosisoftuberculosisinthefuture.Key words: Tuberculosis;Mycobacterium tuberculosis; Acid-fast stain; FluorescencequantitativePCR,自1985年以来结核病疫情在全球范围内急,,1/3,20亿人口感染了结,2000万,800～1000万,每年约有300万人死于结核病1～中国是全球22,活动性肺结核病人数居世界第二位。据结核病流行病学,现有活动性肺结核病人450万,其中传染性肺结核病人150万4。结核病,出入境人员体检诊疗传染性肺结核关键方法是经过胸部X,加上痰涂片抗酸染色镜检和PPD试验联合检测。因为胸部X片是依据临,,加上肺结核与其她肺部疾病在胸片上有相同地方,轻易出现误诊和漏诊;痰涂片抗酸染色阳性率低,采样不合格标本阳性率更低,极易出现漏诊;而PPD,,这三种检测方法组合模式在检测肺结,,而少数肺部疾病或其她部位结核病人可,,特异性高特点成为结核分枝杆菌检测研究热点。中国外大量研究证实PCR检测结核分枝杆菌敏感性达成100％,本研究以荧光PCR,,结果汇报以下。材料与方法材料确诊肺结核病人培养涂阳结核痰液标本102份。正常人痰液25份,葡萄球菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯球菌痰液标本累计20份。引物与探针依据对NCBI数据库结核杆菌基因序列分析,找出其保守序列,而且在此区域应用Primer5.0和Primerexpress3.0,5’端标以荧光发射基团FAM标识,靠近3’端标以荧光淬灭基团TAMRA标识表1)ForwardPrimer:5’ReversePrimer:Probe:CACGTAGGCGAACCCTGCCCA仪器ABI企业ABI7500荧光Real－timePCR仪。痰液DNA提取痰液样品预处理吸收待测痰液200μl1.5mleppendo,5mol/LNaOH混匀,室温中1mol/LNaH2PO4700μl,(),10000rmp5min。去上清液,补加TE100μl,混匀,20μl50mg/ml3730min。DNA提取,300μl,20秒,置65。加200μl,5～616000rmp3min500μl),,,混匀后16000rmp离心3min,200μl70,,,16000rmp3min70,,,30μlDNA,快速漩涡1～2秒,使沉淀DNA完全溶解。标准品制备标准品包含:阳性定量参考品、阴性质控品、临界阳性质控品和强阳性质控品。以结核杆菌阳性DNA2μl做为PCR,加入PCR23μl,PCR反应液中含有10xPCRBuffer3μl、25mmol/LMgCl2、10mmol/LdNTPs、4U/μlTaqDNA0.5μl10pmol/L1μl,13.3μl。于PT-200PCR扩增:944min;94℃30s,58℃30s,72℃30s,30个循环;最终7210min。PCR1.5,凝胶回收试剂盒回收PCR,与线pMD18-T载体（Invitrogen企业12～16h,连接反应体系中含有PCR凝5μlpMD18-T1μlT41μl,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5ɑ,转化后细胞涂布于含有氨苄青霉素抗性1.5％琼脂固体LB培养基上,3712～16h,,50mg/ml氨苄青霉5mlLB,200rpm37;1.6ml,,经PCR,,,抽提质粒DNA,用(4次,4管,),10倍系列稀释,108、107、106、105copies／ml4个标准品,阴性质控品以生理盐水制备,强阳性质控品和临界阳性质控品依据浓度和拷贝数以标准品经灭菌水稀释后制得。Taq-man探针实时PCR及反应条件20μl,2×Probe－PCRMasterMix上、下游引物(10μmol/μl)0.5μl,探针(10μmol/μl)0.2μl,6.8μl,结核杆菌阳性DNA样2μl:95℃15min(×1),94℃10s→60℃20s→72℃30s(×40)。根据上述反应体系及反应条件,伴随PCR,就得到了以循环数,Ct曲线。,测序PCR2,,1hABI3130基因分析仪序列分析。特异性试验25份和金黄色葡萄球菌DNADNADNA20Taq-manPCR检测。检测限试验对阳性样本以10倍梯度进行稀释,共5个稀释度,最大稀释倍数为10万倍,然后以各稀释液为模板进行实时PCR检测。反复性试验107410倍倍比稀释阳性DNA五次分别统计其Ct值。灵敏度试验对102例痰液标本分别进行抗酸染色显微镜检测和实时PCR检测。结果定量曲线各个稀释度标准阳性株在第一个循环结束后测到一个基础吸光值,接下来一直到第20个循环结束时都没有显著改变。从第23,,25(Ct值)后,,36,,一直到反应结束。阴性对照未出现扩增曲线（图。琼脂糖凝胶电泳结果痰液DNA进行验证试验,对所获取PCR产物进行测序,序列分析显示该产物为TB核酸序列。特异性试验DNATaq-manPCR检测到无荧光信号。检测限试验10,Taq-manPCR检测,荧光信号随样本浓度下降而下降,线性范围为103～107copies/ml,检测下限为102copies/ml。反复性试验反复测定4组10倍倍比稀释后标准品,浓度由高到低Ct平均值分别是21.07、24.6、28.16、31.57,标准差分别是0.69、0.88、0.39、1.82,变异系数分别是3.9%、4.3%、1.6%、6.9%,伴随标准品拷贝数降低,Ct值增大,标准差和变异系数也呈逐步增大趋势。2.6 灵敏度试验对确诊肺结核病人102例痰液标本分别进行直接涂片染色法和实时PCR30％。荧光PCR100％。讨论肺结核试验室快速诊疗对出入境人员传染性肺结核发觉相关键意义,现在,肺结核试验室诊疗方法关键有细菌学检验、免疫学检验和分子生物学检验。细菌学检验是现在传染性肺结核诊疗金标准,检测出来阳性对肺结核诊疗意义最大,关,痰涂片抗酸染直接镜检法阳,阳性率只有14～47%,,阳性率相差很大1。提升痰标,加强痰涂片镜检质量控制是现在中国外研究关键片法,且能得到活菌,但因为结核分枝杆菌生长速度太慢,检测时间长,传统方法培养需要5～8BACTEC,使培养分枝杆菌能,9～14d。分枝杆菌生长指示管使用荧光计量技术检测,,阳性率高［15,16］,,是快速培养主流。试验室检测结核分枝杆菌是临床结核病诊疗关键依据传统检测结核分枝杆菌关键方法为直接涂片法和培养法［20］,但直接涂片法存在特异性差、灵敏度低和不能判别抗酸菌死活缺点,而培养法则存在特异性差和需时较长不足［5］,实际临床应用受限。本试验中102例标本实时PCR阳性102例(102%),而直接涂片法只有30例(30%)。实时PCR法与抗酸染色法比较符合率为实时PCR法操作简便、快速、高,含有很高敏感性、特异性,且其在密闭体系中完成扩增并进行实时测定,降低了污染可能性,并可正确地进行定量检,为传染病监测提供参考实时PCR技术尤其对部分含菌量低标(如尿液、胸腹)检测含有非常实用价,大大提升了结核分枝杆菌检出率。实时PCR检测原理为TaqMan探针,是在反应体系中加入一个荧光标识探,探针5′端标以荧光发射基团FAM, 3′端标以荧光猝灭基团。实时PCR过程,利用Taq酶5′→3′外切核酸酶活性释放荧光信号模板每复制一,便释放一个荧光信,依据荧光强弱可对模板进行正确定量因为实时PCR采取闭管操,克服了常规PCR污染问,使其含有很高特异性。实时PCR技术尽管有少数假阳性结,但其与常规细菌学方法互补使用可提升阳性检出,仍不失为灵敏度高、特异性强结核病辅助诊疗有效方法之一。本研究结果显示, 痰涂片抗酸染色镜检阳性率(30%)较低,是可能因为抗酸染色受痰中细菌数量限制,通常最少每毫升痰液含(5×103)～(1×104)个细菌方可得出阳性结,且结核病人是间断性排,可能造成假阴性。这就要求我们在抗酸染色时要严格控制条件,挑取标本中干酪样或脓性部分,以提升阳性率。而实时PCR检测法阳性率显著高于抗酸染色法和改良罗氏培养,且特异性为100%,这和荧光定量PCR原理和它所采取一系列新技术亲密相关。尤其是结核病患者经药品诊疗或体内出现了细胞壁缺损L型细菌造成分离培养结果呈阴性时,此方法检测结果仍不受影,PCR,且定量结PCR检测结核抗酸杆菌DNA细菌即可取得阳性结果,而且在本试验建立过程中,无一例抗酸染色阳性和(或)培养阳性标本实时PCR检测为阴性。实时PCR,,为结核快速诊疗提供了有力参考6。【参考文件】［1］vanLethF,vanderWerfMJ,BorgdorffMW.PrevalenceoftubercμLousinfectionandincidenceoftubercμLosis:are-assessmentoftheStyblorμLe［J