生物化学复习-蛋白质3-5-1-7

第六节、蛋白质分子结构与功能的关系蛋白质分子具有多样的生物学功能，需要一定的化学结构，还需要一定的空间构象。一、蛋白质一级结构与功能的关系（一）同源蛋白质一级结构的种属差异与生物进化

蛋白质一级结构的种属差异十分明显，但相同部分氨基酸对蛋白质的功能起决定作用。根据蛋白质结构上的差异，可以断定它们在亲缘关系上的远近。同源蛋白质：在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质称同源蛋白质。如血红蛋白在不同的脊椎动物中都具有输送氧气的功能，细胞色素在所有的生物中都是电子传递链的组分

。

同源蛋白质的特点：

A.不同种属来源的同源蛋白质具有相同长度或接近相同长度的多肽链。B.顺序同源现象：同源蛋白质的氨基酸序列具有明显的相似性，这种相似性称序列同源性，或顺序同源现象。C.不变残基和可变残基：同源蛋白质的氨基酸顺序中有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称不变残基，不变残基高度保守，是必需的。除不变残基以外，其它位置的氨基酸对不同的种属有很大变化，称可变残基，可变残基中，个别氨基酸的变化不影响蛋白质的功能。

通过比较同源蛋白质的氨基酸序列的差异可以研究不同物种间的亲源关系和进化，亲源关系越远，同源蛋白质的氨基酸顺序差异就越大

存在：细胞线粒体－－电子传递蛋白组成：单链蛋白质－－104个氨基酸，分子量12.5x103

1分子血红素辅基25种生物中，细胞色素C的不变残基35个。60种生物中，细胞色素C的不变残基27个。亲源关系越近的，其细胞色素C的差异越小。亲源关系越远的，其细胞色素C的差异越大。

1.细胞色素c物种的亲缘关系越近，细胞色素c的一级结构越相似，据此可绘制系统进化树，进行系统进化分析2.胰岛素

不同生物的胰岛素AA序列中，有24个氨基酸残基位置始终不变，A,B链上6个Cys不变（重要性），其余18个氨基酸多数为非极性侧链，对稳定蛋白质的空间结构起重要作用。其它氨基酸对稳定蛋白质的空间结构作用不大，但对免疫反应起作用，猪与人接近，而狗则与人不同，因此可用猪的胰岛素治疗人的糖尿病。（二）蛋白质一级结构的个体差异—分子病

——基因突变引起某个功能蛋白的某个（些）氨基酸残基发生了遗传性替代从而导致整个分子的三维结构发生改变，致使其功能部分或全部丧失。镰状细胞贫血（sick-cellanemia）－－是最早被认识的一种分子病。它是由于基因突变导致血红蛋白分子中氨基酸残基被更换所造成的。β-链12345678Hb-AVal-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys…Hb-SVal-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys…从患者红细胞中鉴定出特异的镰刀型或月牙型细胞。正常红细胞镰刀状红细胞（三）一级结构的部分切除与蛋白质的激活

一些蛋白质、酶、多肽激素在刚合成时是以无活性的前体形式存在，只有切除部分多肽后才呈现生物活性，如血液凝固系统的血纤维蛋白原和凝血酶原，消化系统的蛋白酶原、激素前体等。胰岛素原的激活胰岛素在胰岛的β细胞内质网的核糖体上合成，称前胰岛素原，含信号肽。前胰岛素原在信号肽的引导下，进入内质网腔，进入后，信号肽被信号肽酶切除，生成胰岛素原，被运至高尔基体贮存。并在特异的肽酶作用下，切除C肽，得到活性胰岛素。二、蛋白质构象与功能的关系别（变）构现象：蛋白质与配体结合改变蛋白质的构象，进而改变蛋白质生物学活性的现象。别构蛋白多是寡聚蛋白。因别构而产生的效应称别构效应。在蛋白质与其他分子的相互作用中，能被它可逆结合的其他分子称为配体。(一）肌红蛋白的结构与功能1.肌红蛋白的三级结构由一条多肽链和一个辅基血红素构成，Mr为16.6KD，153个氨基酸残基。KendrewJ及其同事于1963年完成肌红蛋白的X-晶体学分析，最终分辨率为0.14nm2.辅基血红素肌红蛋白-血红蛋白家族中铁是由称为原卟啉Ⅸ（protoporphyrinⅨ）的有机分子固定的。原卟啉Ⅸ由4个吡咯环原卟啉Ⅸ只有结合亚铁态铁才能结合氧3.O2与肌红蛋白的结合氧合肌红蛋白中血红素铁离子的6个配体4个是卟啉环中央的4个N原子，第5个是环面上方的His93（F8），第6个是下方的O2肌红蛋白在进化中形成的多肽微环境至少有三个作用：固定血红素基；保护血红素铁免遭氧化；为O2分子提供一个合适的结合部位4.O2的结合改变肌红蛋白的构象铁原子的位置与卟啉环平面的关系发生关键性改变去氧肌红蛋白中Fe（II）离子有5个配位体，位于离卟啉环平面上方（HisF8一侧）0.055nm处。与O2结合时，Fe（II）离子离卟啉环平面只有0.026nm.是血红蛋白具有别构性质的基本原因His64(E7)MbO2↔Mb+O2K={[Mb][O2]}/[MbO2](1)Y=[MbO2]/{[Mb]+[MbO2]}(2)Y=[O2]/{[O2]+K}将（1）改写为：[MbO2]={[Mb][O2]}/K并代入（2）得：

5.肌红蛋白结合氧的定量分析(氧结合曲线)

当Y=1时，所有肌红蛋白的氧合位置均被占据，即肌红蛋白被氧饱和,K=0Y=0.5时，肌红蛋白的一半被饱和，PO2=K，解离常数K称为P50，P(O2)=K=P50或P0.5P50定义为肌红蛋白一半被氧饱和时的氧分压肌红蛋白的氧合曲线呈双曲线型，表明对O2的亲和力较大，P50为2torr，适于储氧（线粒体O2：0～10torr；静脉血15torr或更高）。肌红蛋白也利于胞内的O2从内表面向线粒体的转运(内表面10torr,80%饱和,线粒体1torr,25%饱和)Log[Y/(1-Y)]=logp(O2)−logKY=[O2]/{[O2]+K}=p(O2)/{p(O2)+K}YK=p(O2)−Yp(O2)=p(O2)(1−Y)Y/(1−Y)=p(O2)/K二、血红蛋白的结构与功能在从肺部经心脏到达外周组织的动脉血中Hb约为96％氧饱和度。在回到心脏的静脉血中Hb仅为64％氧饱和度。因此每100ml血经过组织约释放Hb携带的1/3氧或相当于大气压和体温下6.5ml氧气血红蛋白的结构、氧合过程中的构象变化、氧结合曲线和别构效应（协同性）1.血红蛋白的结构

(1)．血红蛋白的亚基组成血红蛋白的构象（三维结构）(2)Hb的亚基与肌红蛋白相似MbHbαHbβ2.氧结合引起血红蛋白的构象变化两个αβ二聚体的偏心枢轴旋移15°并平移0.08nm去氧血红蛋白氧合血红蛋白血红素铁的微小移动导致血红蛋白构象转变

存在空间效应和电子效应

Fe(II）由高自旋变为低自旋近侧His（F8）与Fe原子一起被拉动，Fe-N键变成垂直于血红素平面图6-13去氧血红蛋白中的各亚基间的盐桥共8个盐桥，氧合时伴盐桥断裂3.血红蛋白的协同性氧结合（Hb氧结合曲线）图6-14Hb和Mb氧合曲线的比较P

(O2)/torr氧饱和分数（Y）P50=26torr肺泡中P(O2)工作肌肉毛细血管中P(O2)Hb氧合曲线的比较由Y对P

(O2)作图Y=P4(O2)P4(O2)+KP(O2)/torrY完全协同，n=4实验观察到亚基间结合氧时无相互作用血红蛋白的Hill图由此方程导出Y=P4(O2)P4(O2)+KYPn(O2)K=1–Y两边取对数，得log(Y/(1-Y))=nlogP(O2)-logK对logP(O2))Y1–Ylog(作图Hill系数是协同性程度的一种量度

n=1表示配体结合是非协同性的;n>1表示配体结合是正协同性的;n<1表示配体结合是负协同性的。50%饱和度时,logK=n(logP50)或K=(P50)n血红蛋白氧合协同性使它更有效的起着运输氧气的作用ΔY是血红蛋白运输氧效率的指标

Hb,ΔY=0.72;Mb,ΔY<0.1。协同效应增加血红蛋白在肌肉中的卸氧效率.P

(O2)/torr氧饱和分数（Y）P50=26torr肺泡中P(O2)工作肌肉毛细血管中P(O2)Y=0.97Y=0.254.H+、CO2和BPG对血红蛋白结合氧的影响H+、CO2和BPG在血红蛋白上都有各自的结合部位，这种在空间上相隔部位间的相互作用——一种别构效应(1)、H+和CO2促进O2的释放（Bohr效应）碳酸酐酶在红细胞中特别丰富HbO2+H++CO2

←→HbH+CO2+O2

H+促进氧从血红蛋白释放图6-17在不同pH下Mb和Hb的氧饱和分数曲线氧饱和分数（Y）组织中血液中实验中P(O2)/torrCO2促进氧从血红蛋白的释放反应是可逆的，产生的H+贡献于Bohr效应。氨基甲酸也可形成额外的盐桥，有助于稳定T态，促进氧的释放(2)、BPG降低Hb对O2的亲合力正常人的红细胞约含有4.5mmol/LBPG，约与血红蛋白等摩尔数。Hb四聚体分子中只有一个BPG结合部位。位于四个亚基缔合形成的中央空穴内。而氧合血红蛋白（R态）中，中央空穴变得太小，容纳不了BPG，因为O2的结合引起构象变化，扰乱了BPG的结合部位。可表示如下：BPG降低血红蛋白对氧的亲和力BPG与每个b链的Lysb82,Hisb2,Hisb143,N-末端Valb1等残基的正电荷静电作用图6-19BPG对Hb氧合曲线的影响P(O2)/torr氧饱和分数（Y）组织中肺中（4500m）肺中(海平面）BPG进一步提高了血红蛋白的输氧效率。在肺部，PO2超过100torr，血红蛋白几乎全被O2饱和,BPG是否存在与氧和关系不大。在组织中，PO2低（<30torr)，BPG能降低血红蛋白的氧亲和力，加大血红蛋白的卸氧量。（1）高山适应和肺气肿的生理补偿变化；BPG升高。（2）血库储血时加入肌苷可防止BPG的降解。

氧的S形曲线结合，Bohr效应以及BPG效应物的调节使得血红蛋白的输氧能力达到最高效率(协同效应、波耳效应、别构效应使血红蛋白的输氧能力达到最高效率)血红蛋白使体内的pH维持在一个较稳定的水平血红蛋白的别构效应充分反映了它的生物学适应性，结构与功能的高度统一性。1.胎儿血红蛋白（HbF)在相当于成人血红蛋白(HbA)b链143残基位置含有Ser，而成年人b链的这个位置是具有阳离子的His残基。残基143面向b亚基之间的中央空隙。（1）为什么2,3-二磷酸甘油酸（2,3-BPG)同脱氧HbA的结合比同脱氧HbF更紧？（2）HbF对2,3-二磷酸甘油酸的低亲和力如何影响到HbF对氧的亲和力？（3）HbF的P50是18托（Torr),HbA的P50是26托（Torr)，基于这两个数值如何解释氧从母亲血液有效转运到胎儿？γ链的143位为丝氨酸，而β链的143位为组氨酸

解析与要点：（1）2,3-二磷酸甘油酸的阴离子基团处在脱氧血红蛋白两条b链的Lysb82、Hisb143、Hisb2和N-末端Valb1氨基的阳离子形成氢键和盐键的距离范围内，它可与中心空隙带正电荷的侧链结合，而脱氧HbFb链143残基位置含有Ser，缺少带正电荷的侧链，减低了对2,3-二磷酸甘油酸的亲和力（2）2,3-二磷酸甘油酸稳定脱氧血红蛋白的构象，HbF与2,3-二磷酸甘油酸的结合力低，因而增加了对氧的亲和力。（3）在20~40torr氧分压下，HbF对氧的亲和力大于HbA允许氧由母亲血向胎儿有效转移。2.在体外，用下列方法处理对血红蛋白与氧的亲和力有什么影响？(1)pH值从7.0增加到7.4(2)CO2分压从1000Pa增加到4000Pa(3)O2分压从6000Pa下降到2000Pa(4)2,3-二磷酸甘油酸的浓度从8×10-4mol/L下降到2×10-4mol/L(5)

a2b2解聚成单个亚基解答：(1)pH值增加，Hb与氧的亲和力增加(2)CO2分压增加，Hb与氧的亲和力降低(3)O2分压下降，Hb与氧的亲和力降低(4)2,3-DPG浓度下降，Hb与氧的亲和力增加(5)a2b2解聚成单个亚基，Hb与氧的亲和力增加三、血红蛋白分子病导致一个蛋白质中氨基酸改变的基因突变能产生所谓分子病，这是一种遗传病与有缺陷的血红蛋白有关的疾病分为两类：一类称为血红蛋白病是由于α或β链发生了变化，例如镰刀状细胞贫血病等；另一类称为地中海贫血，是由于缺少了α或β链，例如α-和β-地中海贫血病镰刀状细胞贫血病由于遗传基因突变导致血红蛋白分子中氨基酸残基的替代所造成的是一个反映出蛋白质的氨基酸序列在决定它的构象及其生物学功能方面的重大作用的典型例子。HbAH2NVal-His-leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys-HbSH2NVal-His-leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys-12345678镰刀形红细胞正常红细胞小结蛋白质分子结构与功能的关系：（1）每种蛋白质分子都具有其特定的结构来完成它特定的功能，甚至只有个别氨基酸的变化就能引起功能的改变或丧失，结构与功能之间具有高度统一性。（2）蛋白质的构象与功能的关系十分密切。构象改变时，功能也会发生改变；蛋白质构象的破坏，可引起功能的丧失。（辽宁师范大学2005年）讨论蛋白质构象与功能的关系蛋白质的功能发挥必须以特定构象为基础，两者密切相关。（1）变性、复性，构象改变，生物学活性改变(2)酶原激活等例子都说明通过改变一级结构而改变空间结构，从而酶活改变（3）肌红蛋白与血红蛋白a、b

结构相似，具有相似的功能。其特定的结构维持了结合氧的能力。血红蛋白为四聚体，具有变构现象使得输氧能力高度有效。（4）酶与底物结合过程中的诱导契合第七节蛋白质的性质一、蛋白质分子的相对分子质量蛋白质是相对分子质量（relativemolecularmass,Mr）很大的生物大分子，其Mr变化范围在6000—1000000或更大一些。（一）根据化学组成测定最低Mr

假定某种微量成分只有一个，测出其百分含量后，可用比例式算出最低相对分子质量。若测出两种微量成分的百分含量，分别用比例式算出的最低相对分子质量不相同时，可计算两个最低相对分子质量近似的最小公倍数。真实Mr=最低Mr×n（n是每个分子中元素原子的数目）举例：1、肌红蛋白Fe：0.335%MFe

：55.8

Mr：16700n=12、血红蛋白Fe：0.335%MFe：55.8最低Mr：16700别法Mr：68000n=4真实Mr：16700

×4＝66800氨基酸的定量分析表明牛血清清蛋白含有0.58%的色氨酸（色氨酸的相对分子质量为204）。（1）试计算牛血清清蛋白的最小相对分子质量（假设每个蛋白分子只含有一个色氨酸残基）。（2）凝胶过滤测得的牛血清清蛋白的相对分子质量为70000,试问牛血清清蛋白分子含有几个色氨酸残基？解：(1)0.58:100=204:Mr,Mr=204x100/0.58=35172.41(2)70000/35172.41≈2（二）渗透压法测定相对分子质量半透膜（semipermeab1emembrane）渗透压（osmoticpressure）理想溶液中，溶液的渗透压与溶质浓度的关系可用范托夫（van’tHoff）公式表示：渗透压半透膜溶剂蛋白质溶液范托夫（van’tHoff）公式

π=nRT/V=(g/Mr)RT/V

即

π=(g/V)RT/Mr=cRT/Mr式中π中渗透压(N/m2即Pa)V是溶液体积(m3)，n是溶液中溶质的摩尔数；g是溶质的质量(g)；c是溶质的浓度(g/m3)；T是绝对温度(K)；R是气体常数[8.314J/(K·mol)]；Mr是溶质的相对分子质量或称摩尔质量(g/mol)。从上式看出，理想溶液中渗透压是浓度的线性函数，实际的高分子溶液与浓度之间不是简单的线性关系。在浓度不大时，它们的关系用下式表示：用稀释法（外延法）：利用渗透压的测定来计算蛋白质Mr时，实际上都是测定几个不同浓度的渗透压，以π/c对c作图并外推到蛋白质浓度为0时所得截距，即limπ/c值，代入公式求出Mr.对于相对分子质量10000至100000范围的蛋白质利用渗透压法估算其Mr，可以给出可靠的结果π=RT(cMr+Kc2)πc=RTMr+KcMr=RTLimπ/cc→0（三）超离心法测定相对分子质量利用超速离心机测定蛋白质或其他生物大分子的相对分子质量，常用的有两种方法：一种是沉降速率法（sedimentationvelocity），另一种是沉降平衡法（sedimentationequilibrium）。－－被认为是最准确可靠的方法基本原理：⒈离心力（centrifugalforce，Fc）：当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力“Fc”由下式定义：F=m·a=m·ω2ra—粒子旋转的加速度，m—沉降粒子的有效质量，ω—粒子旋转的角速度，r—粒子的旋转半径(cm)。

⒉相对离心力（relativecentrifugalforce，RCF）:

由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力而受变化，因此在文献中常用“相对离心力”或“数字×g”表示离心力，只要RCF值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。RCF就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。

X为离心转子的半径距离，以cm为单位；g为地球重力加速度（980cm/sec2）；n为转子每分钟的转数（revolutionsperminute,简写成r/min,或rpm）。22⒊沉降系数（sedimentationcoefficient，s）：

1924年Svedberg对沉降系数下的定义为颗粒在单位离心力场中移动的速度。

若ω用2πn/60表示，则

X1：离心前粒子离旋转轴的距离；X2：离心后粒子离旋转轴的距离。S：沉降系数，时常在10-13秒左右，故把沉降系数10-13秒称为一个Svedberg单位，简写S，量纲为秒。例如，动物原生质核糖体的沉降系数等于80S，它的含义就是：80×10-13s。细胞及细胞的各组分的沉降系数有很大的差异，所以可以利用生物样品沉降系数的差异采用离心技术将他们彼此分开。

4.沉降系数与物质相对分子质量:

根据Svedberg公式，由沉降系数可以计算出物质的相对分子质量：

Mr=RTs20,W/[D20,W(1-γρ)]

Mr:相对分子质量；D20,W：以20℃的水为介质时颗粒的扩散系数；R:气体常数；T：绝对温度；s20,W：以20℃的水为介质时颗粒的沉降系数；γ：偏微比容，等于溶质粒子密度的倒数；ρ：溶剂密度（四）凝胶过滤法测定相对分子质量利用凝胶过滤（gelfiltration）可以把蛋白质混合物按分子的大小分离开来。这种方法比较简便，不要求复杂的仪器就能相当精确地测出蛋白质的相对分子质量如果某种蛋白质与一理想的非水化球体具有相同的过柱速度即相同的洗脱体积，则认为这种蛋白质具有与此球体相同的半径，称蛋白质分子的斯托克半径当含有各种组分的样品流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不易进入凝胶颗粒的微孔，沿凝胶颗粒的间隙以较快的速度流过凝胶柱。而小分子物质能够进入凝胶颗粒的微孔中，向下移动的速度较慢，从而使样品中各组分按相对分子质量从大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。

若以组分的洗脱体积(Ve)对组分相对分子质量的对数(lgMr)作图，可得一曲线，其中主要部分成直线关系。以此为标准曲线，可以通过测定某一未知组分的洗脱体积，而从标准曲线中查得其相对分子质量。在实际应用中多以相对洗脱体积Kav(Kav=Ve/Vt)对lgMr作曲线，称为选择曲线，曲线的斜率说明凝胶的特性。每一类型的化合物，如球蛋白类、右旋糖酐类、酶与清蛋白类等都有各自特定的选择曲线。测定时，未知相对分子质量的组分应位于直线部分为宜。若不在直线部分，可选用另一种凝胶重新试验。洗脱曲线logMr洗脱体积（mL）ABCCBA未知洗脱体积与Mr的关系测定蛋白质相对分子质量一般用交联葡聚糖，Sephadex。如SephadexG-75(3000~80000),G-100(4000~150000)（五）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量电泳时，蛋白质颗粒在各种介质中的迁移率决定于它所带的净电荷以及分子大小和形状等因素SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳1967年Shapiro等人发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）和少量巯基乙醇，则蛋白质分子的电泳迁移率（e1ectrophoreticmobility）主要取决于它的相对分子质量，而与原来所带的电荷和分子形状无关SDS在一定条件下，SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4克SDS／l克蛋白质，相当于每两个氨基酸残基结合一个SDS分子。SDS与蛋白质的结合：第一，由于SDS是阴离子，使多肽链覆盖上相同密度的负电荷，该电荷量远超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间原有的电荷差别，结果所有的SDS-蛋白质复合体，电泳时都以同样的电荷／蛋白质比向正极移动。第二，改变了蛋白质单体分子的构象，SDS-蛋白质复合体在水溶液中的形状被认为是近似雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合体的短轴长度（直径）都是一样的约为1.8nm，而长轴长度则随蛋白质的相对分子质量成正比例变化电泳迁移率（μR）与多肽链分子量的对数有下列关系a和b、K1和K2都是常数以几种相对分子量已知的标准蛋白质的Mr的对数值对μR作图，根据待测样品的μR，从其标准曲线上查出分子量logMr=a-bμR

或logMr=K1–K2μR

μR=

样品迁移距离前沿（染料）迁移距离二、蛋白质的两性解离和等电点对某一种蛋白质来说，在某一pH，它所带的正电荷与负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这一pH称为蛋白质的等电点

没有其他盐类干扰时，蛋白质质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH称为等离子点（isoionicpoint），等离子点是蛋白质的一个特征常数蛋白质在其等电点偏酸溶液中带正电荷，在偏碱溶液中带负电荷，在等电点pH时为两性离子。电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。分子大小不同的蛋白质所带电荷的正负性和多少不同，迁移率即异，在电泳时可以分开。自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进行电泳，不同组分形成带状区域。（1）纸上电泳：用滤纸作支持物。-+（2）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。1）圆盘电泳：在玻璃管中进行的凝胶电泳。+—2）平板电泳：在铺有凝胶的玻板上进行的电泳。等电聚焦电泳：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动。++－－－－+－－－－－5.06.07.0稳定pH梯度5.06.07.0稳定pH梯度通电++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－三、蛋白质的胶体性质

由于蛋白质分子量很大，在水溶液中形成1-100nm的颗粒，因而具有胶体溶液的特征。可溶性蛋白质分子表面分布着大量极性氨基酸残基，对水有很高的亲和性，通过水合作用在蛋白质颗粒外面形成一层水化层，同时这些颗粒带有电荷，因而蛋白质溶液是相当稳定的亲水胶体。++++++

蛋白质透析法:利用蛋白质不能透过半透膜的的性质，将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入透析袋再置于流水中，小分子杂质被透析渗出，大分子蛋白质留在袋中，以达到纯化蛋白质的目的。这种方法称为透析（dialysis）。布郎运动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半透膜，具有吸附能力蛋白质溶液稳定的原因：1）表面形成水膜（水化）；2）带相同电荷。四、蛋白质的沉淀反应如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层（消除相同电荷，除去水膜），蛋白质胶体溶液就不再稳定并将产生沉淀。加高浓度盐类（盐析、盐溶）加盐使蛋白质沉淀析出－－盐析分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出。血清球蛋白（50%(NH4)2SO4饱和度），清蛋白（饱和(NH4)2SO4)。加有机溶剂加重金属盐加某些酸类和生物碱试剂单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、三氯乙酸能沉淀生物碱，称生物碱试剂。5.加热变性沉淀制备有活性的蛋白质应注意的问题

五、蛋白质变性与复性

蛋白质各自所特有的高级结构，是表现其物理性质和化学特性以及生物学功能的基础。

当天然蛋白质受到某些物理因素和化学因素的影响，其分子内部原有的高级构象发生变化，蛋白质的理化性质和生物学功能都随之改变或丧失，但并未导致其一级结构的变化，这种现象称为变性（denaturation）。*蛋白质变性学说，我国生物化学家吴宪在上个世纪20-30年代已经提出。天然蛋白质分子因环境的种种关系，从有序而紧密的结构，变为无序而松散的结构，这就是变性。他认为天然蛋白质的紧密结构以及晶体结构是由分子中的次级键维系的，所以容易被物理的和化学的因素所破坏。这种观点基本上反映了蛋白质变性的本质。1、生物活性丧失（Inactivation）2、一些侧链基团暴露3、蛋白质的物理化学性质改变易沉淀（热变性、酸变性等）碱、脲、盐酸胍变性（溶解性很好）粘度增加、扩散系数降低CD、紫外、荧光发射光谱等发生明显变化4、生物化学性质改变

易被蛋白质水解蛋白质变性过程将导致变性蛋白质分子互相凝集为固体的现象称凝固。应用：变性灭菌、消毒；变性制食品；抗衰老……蛋白质的变性作用如果不过于剧烈，则是一种可逆过程。

变性蛋白质在除去变性因素后，可缓慢地重新自发折叠成原来的构象，恢复原有的理化性质和生物活性，这种现象称为蛋白质的复性（renaturation）。1.（宁波大学2005年）什么是蛋白质变性作用？引起蛋白质变性的因素有哪些？解析：主要明确蛋白质变性的本质：空间结构的破坏而引起的生物学活性、物理化学性质的改变。反应名称试剂颜色反应有关基团有此反应的蛋白质或氨基酸双缩脲反应NaOH、CuSO2紫色或粉红色二个以上肽键所有蛋白质米伦反应Hg(NO2)2、Hg(NO3)2及HNO2混合物红色

Tyr黄色反应浓HNO3及NH3黄色、橘色

Tyr、Phe乙醛酸反应(Hopking-Cole反应)乙醛酸试剂及浓H2SO4紫色

Trp坂口反应(Sakaguchi反应)α-萘酚、NaClO红色胍基Arg酚试剂反应(Folin-Cioculteu反应)碱性CuSO4及磷钨酸-钼酸蓝色酚基、吲哚基Tyr茚三酮反应茚三酮蓝色自由氨基及羧基α-氨基酸

六、蛋白质的颜色反应—OHN七、蛋白质的紫外吸收光谱

蛋白质在远紫外光区（200-230nm）有较大的吸收，在280nm有一特征吸收峰，可利用这一特性对蛋白质进行定性定量分析。蛋白质质量浓度/（mg/ml）=1.55A1cm-0.76A1cm280260测定范围：0.1～0.5mg/ml第八节蛋白质分离纯化蛋白质纯化的总目标是增加制品的纯度（purity）或比活（specificactivity），以增加单位蛋白质重量中所要蛋白质的含量或生物活性（比活常以活力单位数/克蛋白质表示）。设法除去变性的和不要的蛋白质，并且希望所得蛋白质的产量达到最高值。蛋白质分离纯化的一般原则1.前处理要选择合适的材料;合适的破碎方法;合适的提取液。2.粗分级分离要方法简便，处理量大。常用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法，有时可用超过滤或凝胶过滤等方法。3.细分级分离主要使用各种层析、电泳，方法要精心选择，巧妙配合。后期可用结晶法。蛋白质的分离纯化方法根据蛋白质在溶液中的下列性质分离纯化蛋白质的方法：①分子大小②溶解度③电荷④吸附性质⑤对配体分子的生物学亲和力等（一）根据分子大小不同的纯化方法1.透析和超滤(1)透析透析是把待纯化的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里，放入透析液（蒸馏水或缓冲液）中进行的，透析液可以更换，直至透析袋内无机盐等小分子物质降到最小值为止。原理：利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖等分开。

磁力搅拌器磁棒透析液蛋白质溶液半透膜袋2.超滤：

利用压力或离心力，强行使水和其他小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐的目的。超滤是一种膜分离技术，它的特点是使用不对称多孔膜根据分子的大小来分离溶液中的大分子物质与小分子物质。超滤尤其适用于大分子溶液的浓缩、不同种类分子的纯化以及溶剂交换等。超滤法是一种温和、非变性的物理方法，比其它分离方法有效率更高、更灵活的优点。原理：

在外力作用下，超滤膜对大分子物质的截留主要是筛分作用，决定截留效果的主要是膜的表面活性层上孔的大小与形状。除了筛分作用外，膜表面、微孔内的吸附和粒子在膜孔中的滞留也使大分子被截留。现在已有各种市售的超滤膜装置可供选用，有加压、抽滤和离心等多种形式。滤膜也有多种规格，他们截留相对分子质量不同的蛋白质。使用中最需注意的问题是滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞，使超滤速度减慢，能被截留物质的Mr变小。图7-6利用压力和离心力的超过滤滤膜抽气离心超滤的主要应用：浓缩：使用超滤来增加所需大分子溶质的浓度，即大分子被超滤膜截留而小分子和溶剂可自由通过，从而达到浓缩的目的。梯度分离：按分子大小梯度分离样品中的溶质分子时，超滤是一种经济有效的方法，适用于分离相对分子质量相差10倍以上的分子组分。在超滤过程中，虽然截留的大分子被浓缩，但滤过的溶质分子仍保持初始的浓度。脱盐／纯化：脱盐即从大分子溶液中去除盐、非水性溶剂和小分子物质的过程。通过溶剂交换，可最有效地去除溶液中的小分子物质，并逐渐分离纯化出大分子物质。具体方法为：在溶液进行超滤的同时，不断向溶液中补充溶剂，补充溶剂的速度与溶液滤过速度相同，使体系始终保持恒定，这种方法又称透析超滤法。2、密度梯度（区带）离心介质：蔗糖、氯化铯、聚蔗糖（Ficoll)、葡聚糖等滴加样品4%8%12%16%20%3、凝胶过滤——分子排阻是根据分子大小分离混合物最有效的方法之一。（1）凝胶过滤的介质凝胶的交联度或孔度（网孔大小）决定了凝胶的分级分离范围（fractionationrange）排阻极限（exc1usionlimit）来表示分级分离范围的上限，它被定义为不能扩散进入凝胶珠微孔的最小分子的Mr，例如sephdexG-50的排阻极限是30000。凝胶的粒度与洗脱流速和分辨率有关。颗粒通常用筛眼数或目数（meshsize）或珠直径（um）表示。（2）凝胶过滤的原理凝胶过滤层析的基本原理水化的凝胶颗粒凝胶过滤当含有各种组分的样品流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不易进入凝胶颗粒的微孔，沿凝胶颗粒的间隙以较快的速度流过凝胶柱。而小分子物质能够进入凝胶颗粒的微孔中，向下移动的速度较慢，从而使样品中各组分按相对分子质量从大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。

样品中各组分的流出顺序，可用分配系数Ka来量度：

Ka=(Ve-Vo)/Vi

式中Ve：为洗脱体积(elutionvolume)，表示某一组分从层析柱洗出到最高峰出现时，所需的洗脱液体积；Vo：外体积(outervolume)，为层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积。Vi：内体积(innervolume)，为层析柱内凝胶颗粒内部微孔的体积。

当某组分的Ka=0时(即Ve=Vo)，说明该组分完全不进入凝胶颗粒微孔，洗脱时最先流出。

若某组分的Ka=1(即Ve=Vo+Vi)时，说明该组分可自由地扩散进入凝胶颗粒内部的微孔中，洗脱时，最后流出。Ka在0-1之间的组分，洗脱时Ka值小的先流出，Ka值大的后流出。

(二)利用溶解度差别的纯化方法1.等电点沉淀和pH控制

利用蛋白质在等电点时溶解度最低以及不同的蛋白质具有不同等电点一这特性，对蛋白质进行分离纯化的方法称为等电点沉淀法。在等电点时，蛋白质分子的净电荷为零，消除了分子间的静电斥力，但由于水膜的存在，蛋白质仍有一定的溶解度而沉淀不完全，所以等电沉淀法经常与盐析法或有机溶剂沉淀法联合使用。单独使用等电点法主要是用于去除等电点相距较大的杂蛋白。在加酸或加碱调节pH的过程中，要一边搅拌一边慢慢加入，以防止局部过酸或过碱。pH溶解度（蛋白mg/ml）NaCI该图说明：（1）b-乳球蛋白的溶解度在其等电点

(pH5.2~5.3)时达到最低值，在等电点两侧的pH下，其溶解度迅速提高；（2）NaCl浓度对pH与溶解度的关系无多大影响2.蛋白质的盐溶和盐析定义：一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶；

原因：主要由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白分子彼此排斥，而蛋白分子与水分子间的相互作用却加强当盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度又随着盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析作用。在同一浓度的盐溶液中，不同蛋白质的溶解度不同，借此可达到彼此分离的目的。

原理：盐浓度增高到一定数值后，水活性降低，水化膜相继被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚积并从溶液中析出。离子强度（I）Log（溶解度）在等电时，中性盐（K2SO4)对一氧化碳血红蛋白的溶解度的影响

盐能够改变蛋白质的溶解度，蛋白质的溶解度与溶液中离子强度有密切关系。两者的关系可用下式表示：

lg（S/So）=-KsI

S为蛋白质在离子强度为I时的溶解度(g/L)；So为蛋白质在离子强度为0时的溶解度；Ks为盐析常数；I为离子强度。在温度一定的条件下，某一蛋白质在某一pH值的水溶液中的溶解度为一常数So。故上式可改写为：

lgS=lgSo–KsI=β–KsI

β=lgSo为一常数，主要取决于蛋白质的性质，也与溶液的温度和pH值有关；盐析常数Ks主要与盐的性质(离子价数、平均半径等)和蛋白质的结构有关，Ks越大，盐析效果越好。

所以对某一蛋白质来说，在温度和pH值等盐析条件确定(即β确定)，所采用的盐确定(即Ks确定)以后，蛋白质的溶解度决定于离子强度I,I可用下式计算：

I=1/2∑miZi2

mi:溶液中离子的摩尔浓度Zi：离子的价数

对于多种蛋白质或酶的混合液，可采用分段盐析法进行分离纯化。盐的选择：

蛋白质的盐析通常采用中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等，其中应用最广的是硫酸铵。

硫酸铵是一中性盐，对蛋白质有相当好的安定作用。又因为其离子容积较大，吸走水分子的能力也大，成为有效的盐析工具。硫酸铵在水中的溶解度大而温度的影响小(25℃时溶解度为4.1mol/L，即767g/L;0℃时溶解度为3.7mol/L，即697g/L)，而且价廉易得，不易引起蛋白质变性，分离效果比其他盐好。但是用硫酸铵盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子会干扰蛋白氮的测定，故有时也要用其他盐来进行盐析。磷酸钾和硫酸钠的盐析系数Ks较大，但由于溶解度受温度影响大，故应用不广泛。硫酸铵浓度的计算与调整方法

通常硫酸銨的添加以百分饱和度來表示(不是浓度百分比)，例如大部分蛋白质可在80%硫酸銨饱和度下沉淀。因为硫酸銨加入的体积很大，会改变最后的总体积，很难由浓度百分比來计算，因此使用百分饱和度作为沉淀蛋白质的度量。用硫酸铵进行盐析时，蛋白质溶液中硫酸铵浓度的调整方法主要有二种：（1）加入饱和溶液法

要求：蛋白质溶液体积不大，所需调整的硫酸铵浓度不高

V=V0(S2-S1)/（1-S2）

V:所需加进的饱和硫酸铵溶液的体积；V0:原溶液的体积；S2：所需达到的硫酸铵饱和度；S1:原溶液的硫酸铵饱和度。饱和硫酸铵的配制方法：在一定量的水中加入过量的硫酸铵，加热至50－60℃，趁热滤去沉淀，再在0℃或室温平衡1－2天，有固体析出时达100％饱和度。(2)

加入固体盐法

要求：饱和度高，不增大溶液体积

t=G(S2-S1)/（1-AS2）

S2，S1:分别代表所需达到的硫酸铵饱和度和原溶液的硫酸铵饱和度；t：将1LS1饱和度的溶液提高到S2饱和度时所需加进的硫酸铵克数；G和A为常数，与温度有关。实际使用时，t可直接查表得到。（注意：0℃，25℃两张表，室温用25℃）3.有机溶剂分级分离法（1）作用机理：降低水溶液的介电常数，使溶质溶解度降低；破坏大分子周围水膜，使溶解度降低。利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度不同而使蛋白质分离的方法，称为有机溶剂沉淀法。经常使用的有机溶剂是乙醇和丙酮。（2）优点：

比盐析法析出的沉淀容易过滤或离心分离，分辨力比盐析法好，溶剂也容易除去。

（3）缺点：

有机溶剂沉淀法易使蛋白质和酶变性，所以操作必须在低温条件下进行。蛋白质和酶沉淀分离后，应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂浓度，避免变性。

中性盐可减少有机溶剂引起的蛋白质变性，提高分离效果，一般添加0.05mol/L的中性盐。由于中性盐会增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度，故中性盐不宜添加太多。

有机溶剂沉淀法一般与等电点沉淀法联合使用。即操作时溶液的pH值应控制在欲分离蛋白质的等电点附近。4.温度对蛋白质溶解度的影响

a.在低离子强度或纯水中，温度升高，溶解度增加；b.在高盐溶液中，温度升高，溶解度降低。大多数蛋白质在低温下比较稳定，所以蛋白质的分级分离一般在低温下操作。一般在室温下进行盐析，温度敏感的蛋白质在低温4℃进行。

(三)根据电荷不同的纯化方法1.电泳带电颗粒在电场中泳动的速度称迁移率或泳动度(mobility)，可用下式表示：

U=v/E=(d/t)/(V/l)=dl/Vt

式中，U(也可以用m表示)为泳动度(cm2/Vs)；v为颗粒泳动速度(cm/s)；E为电场强度(V/cm)；d为颗粒移动的距离；l为支持物的有效长度(cm)；V为实际电压(V)；t为通电时间(s或min)。电泳后通过测量V,t,d,l，即可计算出被分离物质的泳动度。

泳动度与带电颗粒所带净电荷的数量，颗粒大小和形状有关。一般说，净电荷数量愈多，颗粒愈小，愈接近球形，泳动度愈大。被分离的球形分子在电场中所受的力(F)为：

F=EQ式中，E为电场强度，即每厘米支持物的电位降，Q为被分离物所带净电荷。根据Stoke定律，一球形分子在液体中泳动所受的阻力(摩擦力)F′为：

F′=6πrηv

式中，η为介质粘度，r为分子半径，v为分子移动速度。当平衡时：F=F′，即

EQ=6πrηv∴v=EQ/6πrη∵U=v/E∴U=Q/6πrη

由上式可见泳动度与球形分子半径、介质粘度、颗粒所带电荷有关。

经典电泳：自由电泳或称移动界面电泳瑞典的Tisellius于1930年设计出来区带电泳根据支持物的物理性质分为：①滤纸电泳和薄膜电泳②粉末电泳：淀粉、纤维素功硅胶粉等③细丝电泳：人造丝、尼龙丝等细丝支持物上的电泳④凝胶电泳：最常用的有聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶水平式平板凝胶电泳垂直式平板凝胶电泳2.聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)

聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide,简称Bis)在加速剂和催化剂的作用下聚合并联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，简称PAGE)。凝胶的聚合常用过硫酸铵(AP)为催化剂，四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。TEMED的碱基可催化AP水溶液产生游离氧原子，激活Acr单体，使其聚合成单体长链，在Bis作用下，聚合成网状凝胶。碱性条件下凝胶易聚合，室温下7.5%的凝胶在pH8.8时30min聚合，在pH4.3时约需90min。

此外，核黄素亦可为催化剂，聚合需光照，故使用不多。凝胶柱或凝胶板浓缩胶分离胶凝胶的浓度（孔径大小）、缓冲液组分和离子强度、pH以及电场强度都是不同的，即不连续的有3种物理效应：①样品的浓缩效应；②凝胶对被分离分子的分子筛选效应（颗粒小的移动快，颗粒大的移动慢）；③一般电泳分离的电荷效应。由于这3种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高

聚丙烯酰胺凝胶有下列优点：(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好。(2)化学性能稳定，与被分离物不发生化学反应。(3)对pH和温度变化较稳定。(4)几乎无电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好。(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g。(6)凝胶孔径可通过选择单体及交联剂的浓度调节。(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体，因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。PAGE应用范围广，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量及少量的制备，还可测定相对分子质量、等电点等。

3.等电聚焦

蛋白质是两性电解质，当pH＞pI时带负电荷，在电场中向正极移动；当pH＜pI时带正电荷，在电场中向负极移动；当pH=pI时净电荷为零，在电场中既不向正极也不向负极移动，此时的pH就是该蛋白质的等电点(pI)。各种蛋白质由不同的氨基酸以不同的比例组成，因而有不同的pI。利用pI不同，以PAG为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体(carrierampholytes，商品名称为ampholine），它是脂肪族多胺和多羧类的同系物，它们具有相近但不相同的pKa和pI值。在电场作用下，两性电解质载体在凝胶中移动，形成pH梯度，蛋白质在凝胶中迁移至其pI的pH处，即不再泳动而聚焦成带，这种方法称聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(isoelectricfocusing,简释IEF)。

IEF可用于蛋白质等电点的测定.4.双向电泳

IEF/SDS(IPG/SDS)双向PAGE电泳是由两种类型的PAGE组合而成。样品经第一向电泳分离后，再以垂直它的方向进行第二向电泳。如这二向电泳体系pH及凝胶浓度完全相同，则电泳后样品中不同组分的斑点基本上呈对角线分布，对提高分辨率作用不大。1975年，O’Farrell等人根据不同生物分子间等电点及相对分子质量不同的特点，建立了以第一向为IEF，第二向为SDS-PAGE的双向分离技术，简称为IEF/SDS；基本原理与IEF，SDS完全相同。一般第一向IEF用超薄水平板，电泳结束后切取所需泳道用于第二向电泳，或在1mm内径的毛细管中进行第一向IEF，取出胶条用于第二向电泳。第一向电泳的方法同IEF，只是制胶时要加入2%两性电解质和6mol/L尿素。第二向电泳时，先将SDS-PAG灌在垂直玻璃板之间，上部留2cm左右空间，待聚合后，将第一向胶条转移到第二向胶之上，用载玻片将胶条轻轻压直，加3μL1%溴酚兰指示剂，用1%的琼脂糖(用电极缓冲液配制)密封胶条，琼脂糖凝固后即可电泳。待溴酚兰将至凝胶板下方边缘时，停止电泳。第二向电泳时，用梯度混合器将凝胶制成7.5%-15%的浓度梯度，可以提高电泳的分辨率。5．离子交换层析(1)离子交换剂离子交换剂是由基质、电荷基团(或功能基团)和反离子构成的，基质与电荷基因以共价键连接，电荷基因与反离子以离子键结合。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，假设以RA+代表阳离子交换剂，其中A+为反离子，A+能够与溶液中的阳离子B+发生可逆的交换反应，反应式为：RA++B+RB++A+

离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力，这种结合力的大小是由离子交换剂的选择性决定的。强酸性(阳性)离子交换剂对H+的结合力比对Na+的小；强碱性(阴性)离子交换剂对OH-的结合力比对Cl-的小得多；弱酸性离子交换剂对H+的结合力远比对Na+的大；弱碱性离子交换剂对OH-的结合力比对Cl-的大。因此，在应用离子交换剂时，采用何种反离子进行电荷平衡是决定吸附容量的重要因子之一。离子交换剂与各种水合离子(离子在水溶液中发生水化作用形成的)的结合力与离子的电荷量成正比，而与水合离子半径的平方成反比。所以，离子价数越高，结合力越大。在离子间的电荷相同时，离子的原子序数越高，水合离子半径越小，结合力越大。支持介质为纤维素离子交换剂

具有松散的亲水性网状结构，较大表面积，大分子可以自由通过，因此交换容量大，适于大分子的分离CM-纤维素（阳离子交换剂）DEAE-纤维素（阴离子交换剂）交联葡聚糖离子交换剂

容量比纤维素离子交换剂大3~4倍根据分子的净电荷数量和分子大小分离(2)洗脱方法在离子交换层析过程中，常用梯度溶液进行洗脱，而溶液的梯度则是由盐浓度或酸碱度的变化形成的。梯度溶液按组成来分，一般有二种：一种是增加离子强度的梯度溶液。是用一简单的盐(如NaCl或KCl)溶解于稀缓冲液制成的，习惯上不用弱酸或弱碱的盐类；另一种是改变pH值的梯度溶液。该溶液是用两种不同pH值或不同缓冲容量的缓冲液制成的，所用缓冲液的种类、pH值以及缓冲容量要认真选择，否则将达不到预期目的。对于增加离子强度的梯度溶液，不管用于何种类型的离子交换剂，其离子强度绝大部分是增加的。而改变pH值的梯度溶液则不然，如果使用的是阳离子交换剂，pH值应从低到高递增；如果使用的是阴离子交换剂，pH值应从高到低递减，实际许可的pH值范围由待分离物质的稳定pH范围和离子交换剂限制的pH范围来决定。(四)利用选择性吸附的纯化方法1.羟基磷灰石层析羟基磷灰石[Ca5(PO4)3OH2(简称HA)]的吸附容量高，稳定性好(在T＜85℃，pH5.5-10.0均可使用)，因此在制备及纯化蛋白质、酶、核酸、病毒和其它生命物质方面得到了广泛的应用。有时有些样品如RNA、双链DNA、单链DNA和杂合型双链DNA-RNA等，经过一次HA柱层析，就能达到有效的分离。

HA的Ca2+基团和生物分子表面的负电荷基团的相互反应，在用HA分离生物分子过程中起着重要作用。而HA的PO43-基团与生物分子表面的阳电荷基团的相互反应，则仅起着次要的作用。2.疏水作用层析根据蛋白质表面的疏水性差别发展起来的一种纯化技术。以苯基琼脂糖或辛基琼脂糖为固体支持物，与蛋白质表面的疏水区相互作用，用降低离子强度或增加置换剂的方法洗脱。常用的置换剂有非离子型去污剂、脂肪醇、脂肪胺等。疏水作用层析容易引起蛋白质变性，在蛋白质分离中使用不广。(五)利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法

亲和层析是利用生物分子间所具有的专一而又可逆的亲和力而使生物分子分离纯化的层析技术。具有专一而又可逆的亲和力的生物分子是成对互配的。主要的有：酶和底物、酶与竞争性抑制剂、酶和辅酶、抗原与抗体、DNA和RNA、激素和其受体、DNA与结合蛋白等。在成对互配的生物分子中，可把任何一方作为固定相，而对样品溶液中的另一方分子进行亲和层析，达到分离纯化目的。例如，酶与其辅酶是成对互配的，既可把辅酶作为固定相，使样品中的酶分离纯化，也可把酶作为固定相，使样品中的辅酶分离纯化。

亲和层析基本原理是把待纯化的某一蛋白质的特异配体通过适当的化学反应共价地连接到像琼脂糖凝胶一类载体的表面的功能基（-OH)上构成亲和介质（固定相）。配基是指能被生物大分子识别并与之结合的原子、原子团和分子，如酶的底物、辅酶、调节效应物及其结构类似物，激素与受体蛋白、抗原与抗体。亲合层析原理得到纯化的蛋白杂蛋白不与配体分子结合亲合洗脱(六)高效液相层析和快速蛋白液相层析

高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography,HPLC)，又称高压液相色谱法、高速液相色谱法、现代液相色谱法等，是在经典液相色谱和气相色谱的基础上发展起来的分析技术。特别适用于高沸点、不能气化或热稳定性差的有机物分离分析，在生物化学与分子生物学中的应用日益广泛。

HPLC在高压下使液体通过色谱柱，在室温条件下分离混合组分，经检测器转变成电信号，由记录器描记或数据处理装置显示测定结果，具有高压、高速、高效、高灵敏度等特点。1.高压：由于HPLC是以液体作为流动相，而液体比气体通过色谱柱时所受的阻力要大得多，所以必须施加高压，一般为15-30MPa，最高可达50MPa。

2.高速：由于HPLC采用了高压，使流动相液体的流速加快，一般分析周期为数分钟至数10分钟，比经典的液相柱色谱要快得多，但比GC稍慢。3.高效：由于HPLC的柱效较高(每米塔板数可达5000)，有时一根柱子可分离数十种乃至上百种组分。4.高灵敏度：采用灵敏的检测器和自动化装置，可检出10-9g乃至10-11g的物质；所需试样量很少，通常只需数十微升试样即可进行全分析。由于HPLC具有以上特点，所以70年代以来得到了迅速的发展。一般认为，对于有机物的色谱分析，当其相对分子质量小、沸点较低时，可用GC进行分析；沸点较高(＞450℃)、不能气化或热稳定性差者，可用HPLC分析；如果条件不允许，无法购置昂贵的仪器时，可用TLC等经典液相色谱进行分析。

蛋白质的含量测定与纯度鉴定（一）蛋白质含量测定生物活性的测定和总蛋白量的测定配合起来，可以用来表示蛋白质分离过程中某一特定蛋白质的纯化程度。纯化程度常用这一特定成分的含量（一般用活力单位）与总蛋白量（重量单位）之比来表示。对酶来说常以每毫克蛋白所含活力单位数表示，称为酶比活或比活力测定蛋白质总量的方法凯氏定氮法：经典的标准方法，现不多用双缩脲法：快速但不十分精确Folin-酚试剂法(Lowry法)：标准测定方法紫外吸收法（280nm):精确度不高，但简便，样品可回收，可估算核酸含量Bradford法（考马斯亮蓝结合法）：灵敏度高，检测1微克蛋白，重复性好胶体金测定法：灵敏度最高，纳克水平。胶体金是带负电荷的疏水胶体，洋红色，遇蛋白质变蓝色。（二）蛋白纯度的鉴定蛋白质纯度鉴定通常采用物理化学的方法，如电泳、沉降、HPLC和溶解度分析等。目前采用的电泳分析有等电聚集、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和SDS一PAGE、毛细管电泳等在这些分析的图谱上只呈现一个峰或一个条带图7-20蛋白质的溶解度曲线加入的固体蛋白质的量溶解的蛋白质的量只有一个折点的表明是纯的下列蛋白质的混合物在什么pH时电泳，分离最有效？(1)血清清蛋白和血红蛋白(2)肌红蛋白和胰凝乳蛋白酶原(3)卵清蛋白、血清清蛋白和脲酶解答:(1)血清清蛋白pI=4.9,血红蛋白pI=6.8(4.9+6.8)/2=5.85,在pH5.85时电泳，分离最有效。样品点在中间，血清清蛋白移向阳极,血红蛋白移向阴极。

(2)肌红蛋白pI=7.0,胰凝乳蛋白酶原pI=9.5,(7.0+9.5)/2=8.25,在pH8.25时电泳，分离最有效。样品点在中间，肌红蛋白移向阳极,胰凝乳蛋白酶原移向阴极。

(3)卵清蛋白pI=4.6,血清清蛋白pI=4.9,

脲酶pI=5.0,在pH4.9时电泳，分离最有效。样品点在中间，血清清蛋白不动，卵清蛋白移向阳极,脲酶移向阴极。2.指出下列蛋白质在分离范围为5000～400000的凝胶过滤柱上洗脱下来的先后顺序。肌红蛋白、过氧化氢酶、细胞色素C、肌球蛋白、胰凝乳蛋白酶原、血清清蛋白。解答：凝胶过滤是根据分子大小分离蛋白质混合物的最有效的方法之一。相对分子质量大的比相对分子质量小的先被洗脱下来。根据各蛋白的相对分子质量，洗脱下来的先后顺序：肌球蛋白，过氧化氢酶，血清清蛋白，胰凝乳蛋白酶原，肌红蛋白，细胞色素C3.用增加盐离子强度的方法，从指定的离子交换柱上洗脱下列蛋白质，指出它们被洗脱下来的先后顺序，并说明理由。细胞色素C、溶菌酶、卵清蛋白、肌红蛋白（阴离子交换柱）细胞色素C、胃蛋白酶、脲酶、血红蛋白（阳离子交换柱）解答：离子交换层析主要根据物质所带电荷不同而予以分离。一个蛋白质带的负电荷越多，它与阴离子交换剂结合愈紧密，而与阳离子交换剂的结合能力愈弱。细胞色素C的pI=10.6、溶菌酶pI=11.0、卵清蛋白pI=4.6、肌红蛋白pI=7.0,所以洗脱下来的先后顺序为溶菌酶，细胞色素C，肌红蛋白，卵清蛋白（阴离子交换柱）。(2)细胞色素C的pI=10.6、胃蛋白酶pI=1.0、脲酶pI=5.0、血红蛋白pI=6.8,所以洗脱下来的先后顺序为胃蛋白酶,脲酶,血红蛋白,细胞色素C（阳离子交换柱）。

4.扼要解释为什么大多数球状蛋白质在溶液中具有下列性质。(1)在低pH值时沉淀(2)当离子强度从零逐渐增加时，其溶解度开始增加，然后下降，最后出现沉淀(3)在一定的离子强度下，达到等电点pH值时，表现出最小的溶解度(4)加热时沉淀(5)加入一种可与水混溶的非极性溶剂减小介质的介电常数，而导致溶解度的减小(6)如果加入一种非极性强的溶剂，使介电常数大大的下降会导致变性解答：(1)在低pH值时，羧基质子化，蛋白质分子带有大量的正电荷，分子内正电荷相斥使许多蛋白变性，随着分子内部疏水基团的向外暴露使蛋白质溶解度降低，因而产生沉淀。(2)加入少量盐时，对稳定带电基团有利，使蛋白质分子彼此排斥，并加强与水分子间的相互作用，溶解度增高。随着盐离子浓度的增加，盐离子夺取了与蛋白质结合的水分子，降低了蛋白的水合程度，使蛋白质的水化层破坏，使蛋白质沉淀。(3)等电点时，蛋白质静电荷为零，分子之间的斥力最小，所以溶解度最小。(4)加热会使蛋白质变性，蛋白质内部的疏水基团被暴露，溶解度降低，从而引起蛋白质沉淀。(5)非极性溶剂减小了表面极性基团的溶剂化作用，促使蛋白质分子之间形成氢键，从而取代了蛋白质分子与水之间的氢键。(6)介电常数的下降对暴露在溶剂中的非极性基团有稳定作用，结果促使蛋白质肽链的展开而导致变性5.凝胶过滤和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳这两种分离蛋白质的方法均建筑在分子大小的基础上，而且两种方法均采用交联的多聚物作为支持介质，为什么在凝胶过滤时，相对分子质量较小的蛋白质有较长的保留时间，而SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它又跑得最快？解答：凝胶过滤常用的是葡聚糖凝胶（Sephadex)，该介质排阻相对分子质量较大的蛋白质，仅允许相对分子质量较小的蛋白质进入颗粒内部，所以相对分子质量较大的蛋白质只能在凝胶颗粒之间的空隙中通过，它通过柱的体积为柱床体积减去凝胶颗粒本身所占的体积。而相对分子质量较小的蛋白质必须通过所有的床体积才能流出，所以相对分子质量较小的蛋白质比相对分子质量大的蛋白质有较长的保留时间。而SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其凝胶介质并不存在像Sephadex那样的颗粒之间的空隙，所有的蛋白质分子必须全部通过这交联介质而移动。蛋白质的相对分子质量愈小，通过介质愈快，移动愈迅速。6.在一抽提液中含有三种蛋白质，其性质如下：蛋白质相对分子质量等电点A200008.5B210005.9C50006.0解答：由于蛋白质A、B与蛋白质C的相对分子质量相差较大，可用凝胶过滤的方法将蛋白质A、B与蛋白质C分开并纯化。又由于蛋白质A与B等电点不同，可用离子交换层析将蛋白质A与B分开并纯化。7.有一蛋白质，在某组织内含量较低，很难分离纯化，现已知其相对分子质量，并已有该蛋白的抗体，问哪些试验方法可以初步证实组织内的确含有该蛋白质？解答：先进行蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离组织蛋白，然后再进行蛋白质印迹，最后用抗体酶联检测（即WesternBlotting方法）第九节蛋白质的分类1.蛋白质形状球状蛋白纤维状蛋白2.分子组成

简单蛋白（按溶解度）

结合蛋白（按辅基）清蛋白球蛋白谷蛋白醇溶蛋白精蛋白组蛋白硬蛋白核蛋白糖蛋白与蛋白聚糖脂蛋白色蛋白磷蛋白3.按蛋白质的生物学功能分类（1）催化功能生物体内的酶都是由蛋白质构成的，没有酶，生物体内的各种化学反应就无法正常进行。（2）结构功能蛋白质可以作为生物体的结构成分。高等动物的胶原蛋白是主要的细胞外结构蛋白，占蛋白总量的1/4；细胞膜、线粒体、叶绿体和内质网等膜系统都是由蛋白质与脂类组成的；动物的毛发和指甲都是由角蛋白构成的。（3）运输功能脊椎动物的血红蛋白和无脊椎动物的血蓝蛋白起着运输氧气的作用；血液中的载脂蛋白可运输脂肪，转铁蛋白可转运铁；一些脂溶性激素的运输也需要蛋白，如甲状腺素要与甲状腺素结合球蛋白结合才能在血液中运输。

（4）贮存功能