流式细胞术课件

流式细胞术徐琦副教授新疆医科大学基础医学院免疫学教研室第一节

流式细胞术概述流式细胞术流式细胞术（FlowCytometry,简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量流式细胞术的特点流式细胞仪

流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。BDLSR通过流式细胞仪我们可以得到以下信息

-相对细胞大小-相对细胞颗粒密度和内部复杂度-染色过细胞的相对荧光强度细胞组成细胞功能大小细胞表面/胞浆/核--特异性抗原粒度细胞活性DNA,RNA含量胞内细胞因子蛋白质含量激素结合位点钙离子,PH值,膜电位酶活性流式细胞仪常检测的细胞特性基础研究

淋巴细胞功能、树突状细胞（DC）研究、造血干细胞研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、凋亡相关蛋白分析、细胞功能研究、多药耐药基因研究（MDR）、肿瘤相关基因表达研究、RNA测定、DNA测定、总蛋白测定、癌基因和抑癌基因表达产物测定、血管内皮细胞研究临床研究

淋巴细胞亚群测定、血小板分析、网织红细胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、HLA-B27分析、PNH诊断、人类同种异体器官移植中应用、细胞因子测定、AIDS诊断与治疗和疗效评价、flow-FISH法测定端粒长度第二节

流式细胞仪工作原理

采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。一、工作原理

基本工作原理单细胞液柱已标记的单细胞悬液和鞘液硅化管流动室喷嘴荧光检测系统和散射光感受系统收集光信号荧光染料被激发发光光电倍增管脉冲信号计算机系统分析结果放大垂直相交形成稳态水平激光与之基本过程区别流式细胞仪显微镜光源激光自然光、灯光对象细胞、生物粒子细胞、组织等承载工具鞘液及流动室载玻片检测信号光学信号形态及染色放大方式PMT、放大电路目镜×物镜、光学放大统计计算机，>5000人工，200结果多参数，综合分析简单，单参数流式细胞仪与显微镜的区别现代流式细胞仪包括液流系统

聚焦细胞以供检测光学系统

激发和收集光信号电子系统将光信号转化为电信号，并使其数字化以供计算机分析细胞分选系统

由样本和鞘液组成待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的单抗对其染色受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。

1.液流系统液流系统液流系统将样本悬液聚焦在光源的中心处喷嘴FluorescencesignalsFocusedlaserbeam鞘液液流系统示意图FCM的液流系统（如何形成单个细胞流）样本管鞘液管激光光源：气冷式氩离子激光器分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长光束成形器：两十字交叉放置的透镜透镜组：形成平行光，除去室内光滤片：长通、短通、带通光电倍增管：FS,SS（散射光），FL1,FL2,FL3,FL4（荧光）2.光学系统FlowTipLaserSSandFLDetectorFSDetector光学系统示意图（1）激光光源单波长、高强度、高稳定性多采用氩离子激光器或氦氖激光器一般选配2-4根激光，488nm、633nm和355nm、407nmUV激光最多检测13个荧光参数OpticalFilters460500540460500540460500540SP500LP500BP500/50 Longpass Shortpass Bandpass光收集系统：光电倍增管（PMT）流式细胞仪的光信号散射光信号荧光信号(2)散射光信号前向角散射光（FSC,ForwardScatter）入射激光的同向散射光信号细胞相对大小及其表面积。侧向角散射（SSC,SideScatter）入射激光90角的散射光信号细胞粒度及细胞内相对复杂性。前向角散射光——FSCForwardAngleLightScatterFALSSensorLaser侧向角散射光——SSCSideScatterFALSSensor90LSSensorLaser散射光散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上的差异- 通常使用“散点图”来看散射光信号- 散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的数据散点图——DotPlotlysedwholeblood

测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。淋巴细胞单核细胞中性粒细胞光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群

荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。线性放大器和对数放大器（3）荧光测量荧光信号荧光素吸收激光能量荧光素将吸收能量释放，转换为 振动能和热能 释放较入射光波长更长的光量子荧光素与特异抗体结合荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强 双色荧光散点图荧光检测器FluorescenceFALSSensorFluorescencedetector(PMT3,PMT4etc.)荧光补偿光谱交叉Emissionwavelength(nm)530 580 630680730780FITCPEPE-TRPE-CY54colors-simultaneouscollection两色以上荧光分析存在光谱交叉荧光补偿方法所有补偿调为“0”调节电压，用同型对照或阴性对照，使阴性群位于“左下角”依单阳群体调节荧光补偿调与未调补偿FL1FL2注意！用来调节补偿的FITC、PE抗体必须有明显的阳性信号，否则就不会出现荧光渗漏现像，调节补偿也无从入手。在正式数据采集前要调整好补偿，一旦数据被获取，BD、Coulter仪器无法再改变补偿partec流式细胞仪提供软件调节补偿技术，无论何时都可重新调节多色荧光补偿调节方法同双色法主要由计算机及其软件组成3.电子系统4.细胞分选系统FluorescenceActivatedCellSorting488

nm

laser+-ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector第三节

流式细胞术数据显示单参数直方图双参数直方图:点图 二维等高图 假三维等高图三参数直方图多参数分析直分析方图设门分析:REGION和GATE设置数据显示方式FS：反映颗粒的大小SS：反映颗粒的内部结构复杂程度FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少参数由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。（一）单参数直方图单参数直方图细胞相对数量信道(channel)X轴：代表荧光信号或散射光信号的强度，用“通道数”表示，可以与光强度之间线性关系或对数关系Y轴：代表该通道内所出现具有相同光信号特征性细胞的频率双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。（二）双参数直方图双参数直方图点图绿色荧光强度红色荧光强度便于数据统计不同的细胞群可以用不同的颜色标记主要表达方式2.二维等高图由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。曲线层次越高(越里面的线)所代表的细胞数愈多。等高线越密集则表示细胞数变化率越大。二维等高图假三维等高图三参数直方图多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。（四）流式细胞仪的多参数分析数据分析设门设定阴性与阳性群体的界限确定阳性与阴性细胞群体统计阳性或阴性细胞群体的百分率，平均荧光值，绝对数或抗体结合数Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。三、设门分析技术A淋巴细胞B单核细胞C中性粒细胞A、B、C均为任意门线性门Region设置:

区阈（region,R）与门(gate,G)是两个相关的概念，区阈可与门对应，但是也可以包含于门。D1

CD4+/CD3-D2

CD4+/CD3+D3

CD4-/CD3-D4

CD4-/CD3+如十字门分析时，起就可以由四个区域构成，即G=D1+D2+D3+D4。

第四节

流式细胞样品制备标本来源：外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脱落细胞及其他实验的不同，选用不同的抗凝剂。EDTA：2mg/ml枸椽酸钠：0.38%肝素：15IU/ml可选的抗凝剂有：标本处理时间：新鲜样本分析时，样本采集后应立即分析样本固定方法：1%的多聚甲醛或75%的酒精，作用30分钟。注：不同的实验，所用的固定方法不完全相同。样本处理标准试剂：一、10%BovineSerumAlbuminBSA1.溶解10gBSA至100ml蒸馏水中2.4ºC，20000g离心30分钟3.分装后-20ºC保存二、0.1%BSA-PBS缓冲液1.准备500ml，PH7.3PBS2.加入5ml10%BSA3.使用0.45um滤网过滤三、氯化铵溶血剂1.在一升蒸馏水中溶解8.29gNH4CL,1gKHCO3和37mgNa2EDTA2.调节PH值至7.23.在使用前配置该溶血剂，并用0.45um滤膜过滤方法一：溶血法取100ul抗凝全血；2.快速加入2mlNH4CL溶血剂,混匀；3.室温孵育5分钟；4.4ºC，400g离心10分钟。去上清，加入2mlBSA-PBS；5.4ºC，400g离心10分钟。去上清，加入2mlBSA-PBS；6.4ºC，400g离心10分钟。去上清，调整细胞浓度至5x106/ml。收集白细胞方法二：密度离心法提取单个核细胞

Histopaque1077为Ficoll与Sodiumdiatrizoate(泛影酸钠)混合物，其密度为1.119～1.077。通过离心可将全血中的粒细胞与单个核细胞分离。粒细胞沉积于1.119～1.077的血浆层，而单个核细胞则在1.077以下的血浆层中。

1.准备2ml抗凝血（根据实验要求确定用血量），等量PBS稀释；2.准备1mlHistopaque1077(Sigma)；3.室温下700g离心30分钟；4.

仔细将含有单个核细胞血浆层吸出；5.

加4mlBSA-PBS，400g离心10分钟；6.

加2mlBSA-PBS清洗2次。操作

淋巴节、扁桃体、脾、胸腺等淋巴组织由于结构松散，容易分离成单个细胞。一般对样本进行切剪、研磨、过滤便可。从组织获取淋巴细胞将样本置于陪替氏培养皿，加入15mlBSA-PBS；将样本切成3-4mm3大小，用镊子将其分离；将样本经滤网过滤，用密度法分离、提纯淋巴细胞。方法：其他标本：通常在其他组织中分离淋巴细胞需用酶进行消化。对于不同标本，处理方法也各不相同。单细胞悬液的保存深低温保存法（一年）乙醇或甲醇保存法（2周）甲醛或多聚甲醛保存法（2月）抗体染色一般方法外周血白细胞分析：100ul全血血小板分析：1~5ul全血（根据样本血小板数量）红细胞分析：1ul全血（根据样本中红细胞数稀释后使用）骨髓：100ul其他样本，计数后决定使用体积目标细胞数量及检测终浓度：1×106/ml细胞计数方法传统手工计数：耗时、准确度差流式细胞仪计数：BD，Coulter仪器：高速4ul/秒，中速2ul/秒，低速0.5ul/秒？partec仪器:最为精密的细胞计数器，直接报告细胞浓度反应体积样本中加完抗体后，1×106细胞反应体积应不小于100ul。上机检测样本染色及溶血过程处理完后应立即上机检测打开流式细胞仪：预热及进行质控程序选择相应的方案或新建方案加载或重新调节各参数上样检测第五节

流式细胞荧光标记选择合适的荧光染料必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发激发的光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适范围内荧光素光谱的重叠应当尽量减少抗体使用原则根据仪器型号和抗原表达强弱合理选择荧光抗体低表达抗原标记高S/N（信噪比）荧光素，如PE、APC使用双标以上抗体必做荧光补偿FITCTexasredPE.PC.APCPEcy5FL1FL2FL3FL4激光细胞悬液异硫氰酸荧光素得州红能量传递复合染料藻胆蛋白类几种常见的荧光染料名称染料激发波长荧光颜色溶解性对PH敏感性特点异硫氰酸荧光素FITC488绿525易敏感易溶于水，与抗体结合不影响特异性得州红Texasred568红615不易不敏感稳定，偶联后量子产额低藻红蛋白PE488橙575易不敏感具较多发光基团，消光系数和量子产额高藻青蛋白PC488别藻青蛋白APC633红670能量传递复合染料PEcy5488红670易不敏感减少交叉，成本高常用的几类荧光染料

用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在488nm激发光照射下，通过一个荧光染料被激发后产生的发射波长再激发另一荧光染料产生荧光信号，从而检测到该特定荧光信号。能量传递复合染料PECY5CY5CY5488nm575nm670nm红色荧光花青苷5藻红蛋白能量传递复合染料机制荧光染料与细胞成分的四种结合方式

结构亲和式 嵌入结合 共价键结合 荧光标记抗体特异性结合免疫荧光标记方法

直标:干扰少,但需购买多种单抗 间标:步骤多,干扰多,不需标记多种抗体 组合标记（二）免疫荧光标记免疫胶乳颗粒的应用即液相芯片技术是把微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入待标本，在悬液中与微粒进行特异性地结合，经激光照射后不同待测特产生不同颜色，并可进行定量分析。因检测速度极快，所以又有“液相芯片”之称。三、免疫胶乳颗粒技术的应用微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色（固相芯片是用探针在芯片上的坐标位置给基因的特异性编码；而液相芯片则是用颜色来编码）通过对标记不同荧光素分子的检测，实现FCM对可溶性物质的定量分析第六节

流式细胞术质量控制适当的制备方式处理红细胞实体组织来源标本用机械法温度25~37℃，pH7.0~7.2（一）单细胞悬液制备的质控温度pH染料浓度固定剂（二）免疫荧光染色的质控光路与流路校正:确保激光光路与样品流处于正交状态，减少变异（CV）。PMT（光电倍增管）校准:保证样品检测时仪器处于最佳灵敏度工作状态。绝对计数校准:保证计数的准确性。Flow-checkFlow-setFlow-count（三）仪器操作的质控同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的未标记单抗作为对照调整和设置电压，以保证特异性。全程质量控制：与待测标本一起标记和检测，结果达靶值，提示本次实验结果可靠。（四）免疫检测的质控关于同型对照例：一个双色染色的实验抗体AFITC，抗体BPE对应的同型对照是IgG1FITC,IgG1PE那么需要准备的是阴性对照：细胞加上IgG1FITC,IgG1PE单阳性对照：FITC:细胞加上AbAFITC,IgG1PEPE:细胞加上AbBPE,IgG1FITC第七节

凋亡细胞的检测Apoptotic

CellDeath

--ageneticallyencodedcelldeathprogram,whichismorphologically,biochemicallyandmolecularlydistinctfromnecrosisFlowcytometryofapoptoticcelldeath细胞散射光在细胞调亡中，细胞收缩，从而FSC下降，SSC上升或是没有明显变化Flowcytometryofapoptoticcelldeath荧光吸收细胞的胞膜对于DNA染料的通透性和细胞的活性、死亡和凋亡相关，像PI、EB、Hoechst-33342等，可以用来区分活细胞、死细胞和凋亡细胞FlowcytometryofapoptoticcelldeathFCMofCaspases通过抗体和活化的caspase-3片断相结合来检测使用特异性的caspase-3荧光底物新的抗原决定基CK18Flowcytometryofapoptoticcelldeath线粒体功能的变化

TMP会在调亡中产生，可以通过一些标记用流式细胞仪检测。使用有膜穿透性的亲脂性阳离子荧光染料，如Rh123,DiOC6,JC-1,CMXRos等，可作为流式检测的探针。当细胞发生调亡时，一个线粒体膜表面蛋白——7A6抗原会出现Bcl-2/baxfamilyofproteins.

Flowcytometryofapoptoticcelldeath钙离子流和pH值变化

胞浆内Ca2+水平的上升和由于细胞内环境酸化造成的选择性的pH值的调节降低是伴随着细胞凋亡产生的后果之一。使用Ca2+选择性荧光探针，如Quin-2,Fluo-3,Indo-1通过流式检测是测定细胞内Ca2+浓度的最佳方案酸化的检测同样可以用对pH敏感的荧光探针，如DCH,BCECF,BCECF-AM,SNAFLs,SNARFs等进行检测FlowcytometryofapoptoticcelldeathPhospholipidredistributionFlowcytometryofapoptoticcelldeathDNA链的断裂细胞凋亡晚期中，核酸内切酶（某些Caspase的底物）在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在180-200bp的DNA片段。断裂的末端可以通过末端转脱氧核苷酰酶(TdT)连接上dUTP。Flowcytometryofapoptoticcelldeath细胞DNA含量在凋亡细胞中，用PI染色，通过流式检测DNA含量，可以发现一种亚群的细胞，其染色荧光强度下降。这是由于随着调亡的进行，核酸内切酶活化，随后一部分DNA泄漏出去，造成细胞内DNA含量下降造成的。FlowCytometryofApoptoticCellsPI-Fluorescence#EventsApoptoticcellsNormalG0/G1cells第八节流式细胞术在不同领域的应用流式细胞术目前已广泛地被应用于免疫学基础研究和逐步进入临床应用各方面，用流式细胞仪对细胞表面的抗原成分进行标记分析，可区别多种细胞的特性，为细胞免疫的研究增加了有效的手段和帮助。一、在免疫学检验中的应用T淋巴细胞及其亚群分析

Th(CD3+CD4+CD8-T);Tc(CD3+CD4-CD8+T)B淋巴细胞及其亚群分析

B