猪群常见疾病实验室诊断技术doc资料

猪群常见疾病实验室诊断技术张桂红博士、教授、博士生导师华南农业大学兽医学院手机公电话mail：guihongzh@联系方式注意事项上课时间：2009年11月13日全天报到，14日～22日实验技能培训。上午8：30上课，下午2：30上课实验培训地点：华南农业大学兽医学院传染病实验室（即23号楼一楼）安全问题：吃饭：各饭堂、宾馆、东园等猪病越来越多、越来越复杂诊断病理剖检变化、流行病学资料、实验室诊断、生产记录等判定疑似疾病细菌的染色↓形态学观察↓培养基的制备↓细菌分离培养↓移植↓细菌的生化试验↓药物敏感试验病猪的现场剖检病猪病料的采集、保存总RNA的提取↓反转录↓聚合酶链式反应（PCR）猪瘟病毒抗体猪伪狂犬病病毒gPI抗体(野毒)猪流感血凝抑制试验猪细小病毒病乳胶凝集试验（LAT）猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体↓DNA提取↓PCR血清学检测分子诊断细菌分离↓结果分析上午下午14日（周六）概述：（讲授）猪的现场剖检；病料的采集猪病的流行情况；病料的采集、运输与保存实验部分：细菌的分离15日（周日）细菌的革兰氏染色；细菌的形态学观察；细菌的纯培养；常用细菌培养基的制备病毒核酸RNA的提取；反转录；PCR扩增16日（周一）电泳观察PCR结果；分离细菌的生化特性鉴定；药敏试验病毒核酸DNA的提取；PCR扩增电泳观察PCR结果17日（周二）药敏试验结果观察；生化特性结果观察；猪血清的乳胶凝集试验猪血清的ELISA检测；流感病毒的血球凝集抑制实验血清前处理18日（周三）流感病毒的血球凝集抑制实验学员自己整理实验结果；提出相关问题19日（周四）上述检测结果的分析；实验中所遇问题的分析学员可根据具体情况再补做相关实验20日（周五）荧光定量PCR（有兴趣的站）荧光定量PCR（有兴趣的站）日程安排聘请原广州力智农业公司现为德国勃林格公司高级区域技术部方树河总经理第一部分猪的现场剖检采样注意事项个人防护典型病变：具有代表性、针对性尽量无菌适时采样合理采样适量采样猪的常规检查检查外观部位：眼、口、鼻、皮肤、肛门检查器官：淋巴结、心脏、肺、肝、脾、胃、小肠、大肠、肾、膀胱、浆膜及浆膜腔、睾丸、肌肉、脑等繁殖记录采食和饮水温度……器官病理变化可能发生的疾病淋巴结颌下淋巴结肿大，出血性坏死全身淋巴结有大理石样出血变化咽、颈及肠系膜淋巴结黄白色干酪样坏死灶淋巴结充血、水肿、小点状出血

支气管淋巴结、肠系膜淋巴结髓样肿胀猪炭疽、链球菌病猪瘟猪结核急性猪肺疫、猪丹毒、链球菌病猪气喘病、猪肺疫、传染性胸膜肺炎、副伤寒各器官病理变化及可能发生的疾病肺出血斑点纤维素性肺炎心叶、尖叶、中间叶肝样变水肿，小点状坏死粟粒性、干酪样结节猪瘟猪肺疫、传染性胸膜肺炎气喘病弓形体病结核病心脏心外膜斑点状出血心肌条纹状坏死带纤维素性心外膜炎心瓣膜菜花样增生物心肌内有米粒大灰白色包囊泡猪瘟、猪肺疫、链球菌病口蹄疫猪肺疫慢性猪丹毒猪囊尾蚴病肝坏死小灶胆囊出血沙门氏菌病、弓形体病、李氏杆菌病、伪狂犬病猪瘟、胆囊炎脾脾边缘有出血性梗死灶稍肿大，呈樱桃红色郁血肿大，灶状坏死脾边缘有小点状出血猪瘟、链球菌病猪丹毒弓形体病仔猪红痢胃胃粘膜斑点状出血，溃疡胃粘膜充血、卡他性炎症，呈大红布样粘膜下水肿猪瘟、胃溃疡猪丹毒、食物中毒水肿病小肠粘膜小点状出血节段状出血性坏死，浆膜下在小气泡以十二指肠为主的出血性、卡他性炎症猪瘟仔猪红痢仔猪黄痢、猪丹毒、食物中毒大肠盲肠、结肠粘膜灶状或弥漫性坏死盲肠、结肠粘膜扣状溃疡卡他性、出血性炎症粘膜下高度水肿慢性副伤寒猪瘟猪痢疾、胃肠炎、食物中毒中肿病肾苍白，小点状出血高度郁血，小点状出血苍白、变黄、脆猪瘟急性出血圆环病毒病膀胱粘膜层有出血斑点猪瘟浆膜及浆膜腔浆膜出血纤维素性胸膜炎及粘连积液猪瘟、链球菌病猪肺疫、气喘病传染性胸膜肺炎、弓形体病睾丸1个或2个睾丸肿大、发炎、坏死或萎缩乙型脑炎、布氏杆菌病肌肉臀肌、肩甲肌、咬肌等外有米粒大囊泡肌肉组织出血、坏死，含气泡腹斜肌、大腿肌、肋间肌等处见有与肌纤维平行的毛根状小体猪囊尾蚴病恶性水肿住肉孢子虫病血液血液凝固不良链球菌病、中毒性疾病主要症状可能涉及的疾病仔猪下痢红痢、黄痢、白痢、传染性胃肠炎、流行性腹泻、轮状病毒感染、猪痢疾、副伤寒、空肠弯曲菌病、腺病毒感染、鞭虫病、胃肠炎、球虫病呼吸困难气喘病、猪肺疫、流感、接触传染性胸膜肺炎、传染性萎缩性鼻炎神经症状猪水肿病、乙型脑炎、李氏杆菌病、伪狂犬病、仔猪先天性肌陈痉、神经型猪瘟、链球菌病、传染性脑脊髓炎，食物、药物或农药中毒流产或死胎猪细小病毒感染、乙型脑炎、猪瘟、布氏杆菌病、伪狂犬病、猪繁殖与呼吸综合征、弓形体病、引起妊娠母猪体温升高的疾病及非传染病因素（包括高温、营养、中毒、机械损伤、应激、遗传等）器官病理变化可能涉及的疾病眼眼角有泪痕或眼屎、眼结膜充血、苍白、黄染、眼睑水肿流感、猪瘟、热性传染病、贫血、黄疸、猪水肿病口鼻鼻孔有炎性渗出物流出、鼻歪斜、颜面部变形、上唇吻突及鼻孔有水泡、糜烂、齿龈、口角有点状出血、唇、齿龈、颊部粘膜溃疡、齿龈水肿流感、气喘病、萎缩性鼻炎、萎缩性鼻炎、口蹄疫、水泡病、猪瘟、猪瘟、猪水肿病皮肤胸、腹和四肢内侧皮肤有大小不一的出血斑点、方形、菱形红色疹块、耳尖、鼻端、四蹄呈紫色、下腹和四肢内侧有痘疹、蹄部皮肤出现水泡、糜烂、溃疡、咽喉部明肿大猪瘟、湿疹、猪丹毒、沙门氏菌病、猪痘、口蹄疫、水疱病等、链球菌病、猪肺疫等肛门肛门周围和尾部有粪污染腹泻性疾病仔猪红痢空肠、回肠有节段状出血性坏死仔猪黄痢主要在十二指肠有卡他性炎症轮状病毒性肠炎胃内有乳凝块，大、小肠粘膜呈弥漫性出血，肠管菲薄传染性胃肠炎主要病变在胃和小肠，呈现充血、出血并含有未消化的小凝乳块，肠壁变薄流行性腹泻病变在小肠，肠壁变薄，肠腔内充满黄色液体，肠系膜淋巴结水肿，胃内空虚仔猪白痢胃肠粘膜充血，含有稀薄的食糜和气体，肠系膜淋巴结水肿沙门氏菌病盲肠、结肠粘膜呈弥漫性坏死，肝、脾郁血并有坏死点，淋巴结肿胀、出血猪痢疾盲肠、结肠粘膜发生卡他性、出血性炎症，肠系膜充血、出血猪瘟皮肤、浆膜、粘膜及肾、喉、膀胱等器官表面有出血点，淋巴结充血、出血、水肿，回盲瓣口呈扣状溃疡猪丹毒体表有充血疹块，肾充血，有出血点，脾充血，心内膜有菜花状增生物，关节炎猪肺疫全身皮下、粘膜、浆膜有明显出血，咽喉部水肿，出血性淋巴结炎，胸膜与心包粘连，肺肉变猪水肿病胃壁、结肠系膜和下颌淋巴结水肿，下眼睑、颜面及头颈皮下有水肿气喘病肺的心叶、尖叶、中间叶及部分隔叶的下端出现肉变，肺门及纵隔淋巴结肿大照集体照片第二部分病料的采集、运输与保存血清：2-5mL，不能溶血各组织脏器：新鲜、尽量无菌疑似病毒性疾病，-20℃以下保存疑似细菌性疾病，尽快分离，-4℃保存采样的时机是否适宜样品是否具有代表性样品处理、保存、运送是否合适及时

与检验结果的准确性、可靠性关系极大。一、标本的采集、运送和保管的一般要求采集检验样品时，需要符合以下规定：

1．适时采样根据检疫要求及检验项目的不同，选择适当的采样时机十分重要。样品是有时间要求的，应严格按规定时间采样；有临诊症状需要作病原分离的，样品必须在病初的发热时或症状典型时采样，病死的动物，应立即采样。2．合理采样按照检疫规定要求，须严格按照规定采集各种足够数量的样品外，不同疫病的需检样品各异，应按可能的疫病侧重采样。对未能确定为何种疫病的，应全面采样。3．典型采样选取未经药物治疗、症状最典型或病变最明显的样品，如有并发症，还应兼顾采样。

4.无菌取样采集检验样品除供病理组织学检验外，供病原学及血清学等检验的样品，必须无菌操作采样，采样用具、容器均须灭菌处理，尸体剖检需采集样品的，先采样后检查，以免人为污染样品。

5.适量采样采集样品2-5mL一次性注射器采血，将采完血样的注射器活塞，微微拔出一些，使针筒内留有部分空气，然后盖好针头盖子，将注射器针头向上成30度角，斜放，等待血液完全凝固（大概10分钟到30分钟），此过程中不能移动注射器，防止溶血。使用试管和青霉素瓶时也是一样。（1）血样采集、保存和运送（2）鼻、咽拭子的采集：用无菌棉拭子在咽部涂抹数次后，放入含0.5-2ml生理盐水、Hank液的试管中，棉拭子接触手的部分应及时折断或剪断去掉，然后盖紧试管。对黏液脓血便应挑取黏液或脓血部分；液状粪便采集水样便或含絮状物的液状粪便2～5ml；成形粪便至少取蚕豆大小粪便1块（约5g）放于灭菌容器内，最好加有保存液或增菌液；若无法获得粪便时，可用保存液或增菌液湿润过的棉拭子插入肛门4～5cm深处轻轻转动一圈，取直肠表面的黏液后取出，盛入运送培养基或保存液中送检（3）粪便标本：用于各种病毒性疾病病原检测病料的采集和保存以下提到病料样品，如不是直接进行实验，都需要冷冻保存（-20℃）以下！（4）病毒性疾病病原检测病料保证整个过程中，病料始终处于低温状态，十分重要。一个简单的方法是，用废弃的矿泉水瓶，灌水后，放置在冰箱中，制备冰块，在病料运输时，将足量的冰块和病料一起放置在保温箱中（用冰块包裹所有病料，如果冰块不够多，最好将冰块放置在病料的上面和下面。密封后，由专人快速运送到检测单位。分离病毒的组织病料：可放于50％甘油缓冲液中（pH8.0），在5℃条件下保存数周，也可用由0.5％水解蛋白，2％小牛血清，青、链霉素各500U／ml，制霉菌素50U／ml组成的溶液保存。5－10％蛋黄生理盐水。（5）细菌性疾病病料的采集、运送在选择细菌性疾病病原检测病料时，要选择有代表性的病例。未经抗生素治疗的病猪（最近1周未经抗生素治疗）。有条件的最好选用活体送检。如果是用于细菌分离的病料，必须新鲜运送，并保证整个过程中，病料始终处于低温状态（但绝对不能结冰），即4℃采样尽量无菌操作，保证无人为的污染水样：水样来源主要是下水、自来水、猪槽等。采样器具有用于手工采样的采样瓶和自动采样器。手工采样是将水样瓶用铁架固定，塞住瓶口，待瓶沉入到一定深度时拉开瓶塞，让水样进入。水样？用于调查中毒的样品：包括中毒猪的呕吐物、排泄物等。胃内容物：是确定中毒的最好样本之一。所采集的样本可用玻璃、聚乙烯或聚四氟乙烯器皿盛装，避免使用金属器皿。采集量最好达到1OOg（ml）以上。调查中毒的样品：二、疑似病原后的具体的采样部位猪瘟（CSFV）病毒分离荧光抗体试验（FAT）ELISART-PCR中和试验……白细胞减少扁桃体淋巴结肺脏精液血清（病毒血症时间短）抗体及抗原扁桃体淋巴结血清精液肺脏蓝耳（PRRSV）伪狂犬脑扁桃体肝、脾口、咽腔拭子（活体）圆环病毒诊断PCVDPCR原位PCR(ISH)免疫组织化学(IHC)诊断PMWS和PDNS，最好定量检测，因为：PMWS感染猪与PCV2亚临床感染猪区别在于PCV2的感染量血清学诊断存在一定的问题！肺脏淋巴结(各部位)脾……圆环病毒猪细小（PPV）胎儿（小于16cm）或胎儿肺脏妊娠大于70天木乃伊胎、死胎不能用于诊断检测病毒血凝素（在没有抗体时）病毒分离不适合检测新生仔猪抗体JEV胎儿、死胎、新生仔猪、青年猪病毒分离胎儿或新生仔猪取脑、肝、脾、肺和胎盘PEDV和TGEV小肠、小肠上皮（哺乳仔猪小肠切片的直接免疫荧光、免疫组化）粪便RT-PCRELISA口蹄疫水疱液水疱皮猪流感口、咽拭子肺脏气管分泌物猪脑心肌炎心脏扁桃体细菌性疾病普通琼脂血液琼脂LB固体培养基TSATSB……重点是选择合适的培养基猪副嗜血杆菌肺浆膜表面物质渗出性脑脊髓液心脏血液心包积液关节液需要NAD和V因子（1）TSA固体培养基：准确称取胰蛋白大豆琼脂（TryptoneSoyaAgar，TSA）40克，加入940ml蒸馏水，充分摇匀后加热至充分溶解，120℃高压蒸汽灭菌15min，加入50mL过滤除菌的牛血清、10mL过滤除菌的0.001%NAD，充分摇匀后倒平皿。（2）TSB液体培养基：准确称取胰蛋白大豆肉汤（TryptoneSoyaBorth，TSB）30克溶于940mL蒸馏水，充分摇匀后120℃高压蒸汽灭菌15min，加入50mL过滤除菌的牛血清、10mL过滤除菌的0.001%NAD即成。胸膜肺炎放线杆菌G—损伤的肺组织革兰氏染色绵阳血琼脂分离巧克力血琼脂特殊的生化特性：CAMP检测尿素酶链球菌肺、关节液、脑等血液琼脂大肠杆菌肠道内容物粪便萎缩性鼻炎肺鼻分泌物血液琼脂1％葡萄糖麦康凯琼脂肺炎支原体非常难分离生长时间4周核酸检测抗体检测三、实验室设计原则：要求工作环境清洁、空气清新、干燥和无烟尘、实验室尽量分区。（1）核酸检测区：核酸抽提、PCR扩增区域、电泳区。超净工作台、水浴锅、普通冰箱、离心机、PCR仪、电泳仪、电泳槽、微波炉、定时钟等等。最好分为3个房间。（2）血清学检测区，如ELISA、乳胶凝集、HI等酶标仪（ELISA）等（3）细菌分离培养区超净工作台、普通温箱、冰箱、摇床、普通天平、显微镜等等。（4）洗刷消毒区烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器等。器械：主要用于解剖动物、取材、切割组织等。常