生物化学-第七章-酶学教学内容

生物化学-第七章-酶学酶(Enzyme)：是生物活细胞产生的，以蛋白质为主要成分的生物催化剂。一、酶是生物催化剂生物催化剂（Biocatalyst）蛋白质类核酸类模拟生物催化剂胞外酶与胞内酶

酶虽是由细胞产生的,但并非必须在细胞内才能起作用,有些酶被分泌到细胞外才发生作用。这类酶称“胞外酶”。大部分酶在细胞内起催化作用称为“胞内酶”。二、酶的化学本质1.酶是蛋白质1926年Sumner第一次从刀豆种子中提取了脲酶结晶，证明其具有蛋白质性质。30年代，Northrop又分离出结晶的胃蛋白酶、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶，证明酶的化学本质是蛋白质。酶具有蛋白质的特性如：两性解离、胶体性质、加热使酶变性、颜色反应等；酶可以被蛋白酶水解而丧失活性；许多酶的氨基酸顺序已被测定；1969年人工合成牛胰核糖核酸酶。在已鉴定过的数千种酶中，绝大多数酶的化学本质是蛋白质。但在1982年，美国科学家T.Cech发现原生动物四膜虫的26SrRNA前体具有自我拼接的催化活性。T.Cech将这种RNA命名为“Ribozyme”。核酶（Ribozyme）：指具有催化活性的RNA。2、Ribozyme的化学本质是RNA二、酶的化学本质三、酶的作用特点与无机催化剂相比，有如下共同点：反应前后都不发生数量和质量变化；能加快反应速度,但不改变反应的平衡点；从热力学上看,只能催化热力学上允许进行的反应；都能降低反应所需的活化能。极高的催化效率高度的专一性

易失活（蛋白质变性）活性可调控（激活、抑制）常需辅助因子（辅酶、辅基等）三、酶的作用特点与无机催化剂相比，有如下不同点：

反应速度与不加催化剂相比可提高108～1020，与加普通催化剂相比可提高107～1013.1.极高的催化效率NH2C＝O＋H2ONH2CO2+2NH3脲酶Fe粉脲酶的催化效率比Fe粉高1015倍。2.高度的专一性一种酶只能作用于某一类或某种特定的物质，这种性质称为酶的专一性。（1）结构专一性：酶对所催化的分子化学结构的特殊要求和选择。类别：绝对专一性和相对专一性（2）立体异构专一性：酶除了对底物分子的化学结构有要求外，对其立体异构也有一定的要求。类别：旋光异构专一性和几何异构专一性绝对专一性：有些酶只作用于一种底物，催化一个反应，而不作用于任何其它物质。eg：过氧化氢酶底物：过氧化氢琥珀酸脱氢酶底物：琥珀酸相对专一性：这类酶对结构相近的一类底物都有作用。a.键专一性：只要求作用于一定的化学键，而对键两端的基团无严格的要求。b.基团专一性：作用于一定的化学键，并对键两端的基团有要求。a-葡萄糖苷酶：化学键：a-糖苷键糖苷键的一端是葡萄糖底物：麦芽糖、蔗糖旋光异构专一性：当底物具有旋光异构体时一酶只能作用于其中的一种。如：L-AA氧化酶只能催化L-AA氧化，而对D-AA无作用。L-氨基酸+H2O+O2α-酮酸+H2O2+NH3L-氨基酸氧化酶顺反异构专一性：对具有顺式和反式异构的底物具严格的选择性。第二节酶的命名与分类一、酶的分类二、酶的命名继续一、酶的分类氧化还原酶类转移酶类水解酶类裂解酶类异构酶类合成酶类氧化还原酶类：催化氧化还原反应的酶，如琥珀酸脱氢酶：2.转移酶：催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。

例如，谷丙转氨酶催化的氨基转移反应：3.水解酶：催化催化底物的加水分解反应。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶催化的脂的水解反应：4.裂合酶：催化从底物上移去某些基团而形成双键的非水解性反应及其逆反应的酶。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。例如，延胡索酸水合酶催化的反应。5.异构酶：催化同分异构体的相互转变，即底物分子内基团或原子的重排过程的酶。例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。6-磷酸葡萄糖6-磷酸果糖6.合成酶：又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N以及C-S键的形成反应。这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。如：Gln合成酶,丙酮酸羧化酶。A+B+ATPAB+ADP+Pi二、酶的命名1.习惯命名法底物名称：脲酶、淀粉酶、蛋白酶反应性质：脱氢酶、加氧酶、转氨酶两者结合：琥珀酸脱氢酶、谷丙转氨酶酶的来源：胃蛋白酶、木瓜蛋白酶2.国际系统命名法底物1：底物2反应类型如：琥珀酸：FAD氧化还原酶酶的编号：EC、类、亚类、亚亚类、顺序号类：表示反应性质，前面所述的六大类；亚类：表示反应性质：如第一类中的氧化、脱氢；亚亚类：表示作用键的类型或受体；顺序号：表示底物。国际酶学委员会标志如：1大类1亚类中的亚亚类表示受体的类型1.1.1表示氧化还原酶，作用于=CHOH基团，受体是NAD+，NADP+，

1.1.2表示氧化还原酶，作用于=CHOH基团，受体是细胞色素，

1.1.3表示氧化还原酶，作用于=CHOH基团，受体是分子氧。

当酶的编号仅有前三个数字时，就已清楚地表明了这个酶的特性：反应性质、反应物(或底物)性质、键的类型。关于编号第四个则没有什么特殊规定，只表示底物不同。例如：

EC1.1.1.27为乳酸：NAD+氧化还原酶。

EC1.1.1.37为苹果酸：NAD+氧化还原酶。

EC1.1.1.1为乙醇：NAD+氧化还原酶。

EC6.1.1.1为L-酪氨酸：tRNA-连接酶(AMP)

第三个1表示作用在-CHOH基团上，受体NAD+，第4个数字表示底物不同。第三节酶的组成与结构一、酶的组成二、酶的结构三、酶的活性中心四、酶原继续按化学成分酶分为：单纯酶和结合酶1.单纯酶：只由蛋白质组成，如脲酶、淀粉酶、蛋白酶。2.结合酶：除蛋白质外，还有对热稳定的非蛋白小分子物质，称辅因子。一、酶的组成辅因子辅酶：与酶蛋白结合疏松，用透析法可以除去辅基：与酶蛋白结合紧密，不能用透析法除去小分子有机化合物：往往是由维生素参与形成的小分子有机物。金属离子：与酶蛋白结合，有的紧，有的松二、酶的结构（一）酶的结构与蛋白质的结构相同，是具有一定空间结构的蛋白质。（二）根据酶蛋白的结构特点，酶可分为：1.单体酶:只有一条多肽链,分子量在13,000-35,000之间，一般是水解酶,如蛋白酶、羧肽酶。2.寡聚酶：由两个或两个以上的亚基组成,亚基之间由非共价键相连，亚基可以是相同的,也可以是不同的，分子量在35,000-几百万，如丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶。3.多酶复合体：由几个酶有组织的聚集在一起,功能上相互配合，第一个酶的产物是第二个酶的底物，如丙酮酸脱氢酶、脂肪酸合成酶。酶蛋白必需基团其它部分（非必需基团）活性中心维持活性中心高级结构的基团结合部位催化部位三、酶的活性中心活性中心结合部位：与底物结合，决定酶的专一性催化部位：底物的敏感键在此处断裂而形成新键，决定酶的高效性返回怎么形成的呢？怎样的结构特征？AspHisSer胰凝乳蛋白酶的活性中心活性中心重要基团:His57,Asp102,Ser195酶蛋白多肽链经过盘绕折叠形成特定的空间结构，使相关的AA形成微区。为Tyr248为Arg145为Glu270为底物羧肽酶活性中心示意图返回酶活性中心的结构特征：1.活性中心是酶分子表面的一个凹穴，一定的大小和特殊的构象，在与底物接触时表现一定的柔性。

X-Y2.构成活性中心的大多数AA残基为疏水性的，使此小区形成一个非极性的微环境，有利于与底物作用。在活性中心内仅有少数极性AA残基以其功能基团直接与底物作用。酶活性中心的结构特征：3.活性中心的AA在一级结构上相距很远，甚至不在一条肽链上，但在三级结构上比较靠近。4.在活性中心，底物以弱键与酶结合（有利于产物形成）。胰凝乳蛋白酶的活性中心1.酶原：某些酶在细胞内合成或初分泌时没有催化活性，这种无活性状态的酶前身物称为酶原。2.酶原激活：酶原变成酶的过程（切去几个AA的肽段）。实质：酶活性中心的形成或暴露过程。返回（四）酶原第四节酶的作用机制一、酶促反应的本质二、酶与底物的结合三、酶反应的高效性机制四、酶催化机理的实例继续一.酶促反应的本质：降低反应活化能。E+SP+EESGE1E2S能量水平反应过程中间产物学说——酶降低活化能的原因酶（E）与底物（S）结合生成不稳定的中间物（ES），再分解成产物（P）并释放出酶，使反应沿一个低活化能的途径进行，降低反应所需活化能，所以能加快反应速度。许多实验事实证明了E－S复合物的存在。E－S复合物形成的速率与酶和底物的性质有关。二、酶与底物的结合1.锁钥学说认为底物分子或底物分子的一部分象钥匙那样，专一地楔入到酶的活性中心部位，也就是说底物分子进行化学反应的部位与酶分子活性中心具有紧密互补的关系。酶专一性的“锁钥学说”这种学说不能解释酶活性中心的结构与底物和产物结构都吻合的现象，也不能解释酶专一性中的所有现象。2.诱导契合学说该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状。“诱导契合学说”三、酶反应的高效性机制1.邻近及定向效应2.“张力”和“形变”3.酸碱催化4.共价催化5.酶活性中心是低介电区域1.邻近及定向效应

靠近作用：底物分子结合到酶的活性中心，有效浓度大大增加，有利于提高反应速度；

定向作用：使底物分子中参与反应的基团相互接近，分子间反应类似分子内反应，活化能降低。不适合的靠近不适合的定向适合的靠近不适合的定向适合的靠近适合的定向2.“张力”和“形变”底物与酶结合诱导酶的分子构象变化，变化的酶分子又使底物分子的敏感键产生“张力”甚至“形变”，更易于发生反应。3.酸碱催化：指通过质子酸提供部分质子,或是通过质子碱接受部分质子的作用，达到降低反应活化能的过程。酶活性部位上的某些基团可以作为良好的质子供体或受体对底物进行酸碱催化。酶分子中可作为酸碱催化的功能基团组氨酸的咪唑环：（1）pK值约为6.7-7.1，在接近中性的条件下，一半以广义酸的形式存在，另一半以广义碱的形式存在，因而它既能作为质子供体，又能作为质子受体，有效地进行酸碱催化。（2）咪唑环供出和接受质子的速度很快，其半衰期短，小于0.1毫微秒。所以许多酶活性中心都有组氨酸残基。4.共价催化某些酶在催化过程中，能通过共价键与底物结合成不稳定的酶-底物复合物，这个中间产物很容易变成过渡中间物，反应的活化能大大降低。（1）亲核催化：指酶分子中具有非共用电子对的亲核基团攻击底物分子中具有部分正电性的原子，并与之作用形成共价键而产生不稳定的过渡态复合物，活化能降低。（2）亲电催化亲电基团：Zn2+、Fe3+、Mg2+、NH3+等5.酶活性中心是低介电区域（疏水的微环境）某些酶分子表面常出现凹陷，而活性中心多半靠近或位于疏水微环境的凹陷中；

疏水环境的介电常数较极性环境的介电常数低，在疏水环境中两个带电场之间的作用力比在极性环境中的显著增加；四、酶催化机理的实例胰凝乳蛋白酶:(EC3.4.4.5)1.241个AA残基组成，分子量250002.

专一性:在酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸（都是芳香族氨基酸）的羧基处切断肽键3.

活性中心:Ser195,His57,Asp102，构成一个氢键体系,His57成为桥梁。(一)酶的特点（二）作用机理1.通过电荷转移，使Ser有更强的亲核力；2.形成酰化酶，放出产物P1；3.脱酰（水解），形成产物P2；底物结合底物形成共价ES复合物His57质子供体C-N键断裂R-NH2氨基产物释放水亲核攻击H2O四面体中间物的瓦解羧基产物释放胰凝乳蛋白酶催化反应的详细机制返回第五节酶促反应动力学一、酶促反应速度（V）二、酶活力的测定三、底物浓度对酶反应速度的影响四、酶浓度对酶促反应速度的影响五、pH对酶促反应速度的影响七、激活剂对酶促反应速度的影响六、温度对酶促反应速度的影响八、抑制剂对酶促反应速度的影响继续一、酶促反应速度（V）：单位时间内产物的生成量或单位时间内底物的消耗量。斜率=[P]/

t=V（初速度）[P]t二、酶活力的测定1.概念2.酶活力的表示方法3.酶的比活力4.酶活力的测定检测酶含量及存在，很难直接用酶的“量”（质量、体积、浓度）来表示，而常用酶催化某一特定反应的能力来表示酶量，即用酶的活力表示。酶催化一定化学反应的能力称酶活力，酶活力通常以最适条件下酶所催化的化学反应的速度来确定。1.概念：2.酶活力的表示方法活力单位：规定条件（最适条件）下，一定时间内催化完成一定化学反应量所需的酶量。

国际单位（U）:指在标准条件下，1分钟内催化1微摩尔(umol)底物的酶量，或是转化1微摩尔(umol)底物中的有关基团的酶量。

Katal：指在最适条件下，每秒钟催化1mol底物转化所需的酶量。简称Kat。1Kat=6×107U注意：以上的酶单位定义中，如果底物（S）有一个以上可被作用的化学键，则一个酶单位表示1分钟使1μmol有关基团转化的酶量。如果是两个相同的分子参加反应，则每分钟催化2μmol底物转化的酶量称为一个酶单位。在“U”和“kat”酶活力单位的定义和应用中，酶催化底物的分子量必须是已知的，否则将无法计算。习惯单位：在实际使用中，结果测定和应用都比较方便、直观、规定的酶活力单位，不同酶有各自的规定，如：①α-淀粉酶活力单位：每小时分解1g可溶性淀粉的酶量为一个酶单位。也有规定每小时分解1mL2%可溶性淀粉溶液为无色糊精的酶量为一个酶单位。②糖化酶活力单位：在规定条件下，每小时转化可溶性淀粉产生1mg还原糖（以葡萄糖计）所需的酶量为一个酶单位。③蛋白酶：规定条件下，每分钟分解底物酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量。④DNA限制性内切酶：推荐反应条件下，一小时内可完全消化1μg纯化的DNA所需的酶量。3.酶的比活力酶的比活力：是指每mg蛋白所含的酶活力单位。比活力是表示酶制剂纯度的一个指标。比活力=总活力单位总蛋白mg数=U(或IU)mg蛋白实际应用中也用每单位制剂中含有的酶活力数表示（如：酶单位/mL（液体制剂），酶单位/g（固体制剂）），对同一种酶来讲，比活力愈高则表示酶的纯度越高（含杂质越少）。在评价纯化酶的纯化操作中，还有一个概念就是回收率。回收率=某纯化操作后的总活力/某纯化操作前的总活力［总活力=比活力×总体积（总重量）］4.酶活力的测定终点法:酶反应进行到一定时间后终止其反应，再用化学或物理方法测定产物或反应物量的变化。动力学法:连续测定反应过程中产物\底物或辅酶的变化量，直接测定出酶反应的初速度。三、底物浓度对酶促反应速度的影响pH、T、[E]固定时，V对[S]作下图：米氏方程（Michaelis-Mentenequation）E+SESP+Ek1k2k3k4基础：中间产物学说k1,k2,k3,k4分别是正反应和逆反应的速度常数k1([E]—[ES])[S]d[ES]dt==d[ES]dtk2[ES]k3[ES]+k2

+

k3k1([E]-[ES])[S][ES]=k2

+

k3k1=Kmv=k3[ES]vmax=k3[ES]=k3[E]v=vmax[S]Km+[S]米氏方程（1）[S]很小时，[S]《Km，则V=Vmax[S]/Km，一级反应；（2）[S]很大时，[S]》Km，则V=Vmax，零级反应；（3）[S]处于Km附近时，混和级反应。由米氏方程可以看出：米氏常数Km的意义（1）Km：当酶反应速度达到最大反应速度的一半时的底物浓度，单位mol/L。即：（2）Km是酶的特征常数之一。只与酶的性质有关,而与酶浓度无关。（3）如果一种酶有几种底物,就有几种Km值，Km值最小的底物称该酶的最适底物。Km值还受pH及温度影响。因此Km值作为常数是在一定条件下而言的。（4）1/Km可以近似地表示酶对底物亲和力的大小，1/Km愈大，Km愈小，达到最大反应速度一半时所需浓度就愈小，亲和力就越大。米氏常数Km的意义测定一个酶促反应的Km的方法很多,一般最常用双倒数作图法:改写成直线方程：斜率=Km/Vmax1/Vmax-1/KmKm值的求法——双倒数作图法注意：米氏方程只是反映了底物单分子时酶反应速度与底物浓度之间的定量关系，但这个方程不适应包括一种以上的底物和其他物质的影响的酶反应。但可以根据这个方程推出各种复杂酶促反应的动力学方程。Km值与米氏方程的实际用途：a、由所要求的反应速度（应达到Vmax的百分数），求出应当加入底物的合理浓度。b、由已知的底物浓度，求出该条件下的反应速度。eg1.若要求反应速度到达Vmax的99%，其底物浓度应为：

99%=100%[S]/（Km+[S]）∴[S]=99Km

eg2.若要求反应速度达到Vmax的90%，其底物浓度应为：

90%=100%[S]/（Km+[S]）∴[S]=90Km练习题：已知某酶的Km值为0.05mol.L-1，要使此酶所催化的反应速度达到最大反应速度的80％时底物的浓度应为多少？四、酶浓度对酶反应速度的影响[E]vvmax=k3[E]v=vmax[S]Km+[S][ES]k2k1k3[S][S][E]v=k3[S]Km+[S][E]

底物浓度足够大，足以使酶饱和，反应速率与酶浓度成正比。五、pH对酶促反应的影响pH最适pHv最适pH一般4～8动物酶5.5～6.5；植物酶6.5～8.0；酶的最适pH受酶纯度、底物的种类、缓冲液等影响。酶有最适pH的原因：酶分子的解离状态；底物的解离状态；[ES]的形成。六、温度对酶促反应的影响v温度最适温度(1)在达到最适温度之前，温度升高，活化分子数增加，反应速度加快。温度系数（Q10）：温度每提高10℃其反应速度与原来的反应速度之比。对于许多酶来说，Q10多为1-2之间。(2)超过最适温度时,温度升高，酶逐步变性，V降低。酶的最适温度不是一个固定不变的常数。七、激活剂对酶反应速度的影响凡能提高酶活性的物质,都称为激活剂,其中大部分是离子或简单有机化合物。按其分子大小可分为：2.有机分子（1）某些还原剂GSH、半胱氨酸等；（2）EDTA、金属螯合剂，能除去酶中的重金属杂质，解除抑制。1、无机离子（1）金属离子：K+、Na+、Mg2+、Zn2+、Fe3+、Cu2+等；（2）阳离子,α-淀粉酶受Cl-激活；（3）H+，胃蛋白酶受H+激活；3.具有蛋白质性质的大分子物质酶原蛋白酶酶八、抑制剂对酶促反应的影响有些物质能与酶分子上某些必需基团结合（作用),使酶的活性中心的化学性质发生改变，导致酶活力下降或丧失，这种现象称为酶的抑制作用。

抑制剂(inhibitor)：能够引起酶的抑制作用的化合物。酶的抑制剂一般具备两个方面的特点：a.在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过渡状态相似。b.能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体或结合物。抑制作用的类型：根据抑制剂与酶的作用方式及抑制作用是否可逆，分为两大类：可逆性抑制作用不可逆性抑制作用（一）可逆性抑制作用可逆性抑制作用：抑制剂与酶蛋白以非共价键可逆结合，可用透析的方法除去。可逆性抑制作用可以分为三种类型：

竞争性抑制作用

非竞争性抑制作用

反竞争性抑制作用（1）抑制剂的化学结构与底物相似，与底物竞争酶活性中心，形成EI，减少了酶与底物的结合，降低酶反应速度；（2）抑制作用的强弱取决于[I]/[S]；（3）可采用提高[S]来消除这种抑制作用。E＋SESP＋E1.竞争性抑制作用E＋IEIP＋E双倒数方程：磺2.非竞争性抑制作用（1）非竞争性抑制剂与酶活性中心以外的部位结合，引起酶分子构象变化，使酶活性中心催化作用降低。（2）抑制作用的强弱取决于抑制剂的绝对浓度。（3）不能用增大[S]的方法来消除抑制作用。双倒数方程：竞争性抑制与非竞争性抑制作用的区别底物与酶专一性结合竞争性抑制作用非竞争性抑制作用3.反竞争性抑制作用抑制剂不能与游离酶结合，只与ES复合物