蛋白质组学知识分享

蛋白质组学新合成的蛋白质翻译后的修饰(糖基化、磷酸化等）亚细胞定位或迁移分子间的相互作用等都会造成蛋白质分子的构象和功能发生变化

一个已知的基因序列也很难预测其编码的蛋白质的功能。同时，蛋白质翻译的修饰、结构形式、蛋白质分子的相互作用及蛋白质分子与其他分子的相互作用等问题，都是基因组学所不能回答的。因此，科学家们就把研究的重心由基因转向了其编码合成的全部蛋白质。产生背景20世纪中后期，生命科学研究进入了分子生物学时代。2.随着人类基因组全序列测定，生命科学跨入了后基因组时代。3.因mRNA的表达情况不能直接反应蛋白质的表达水平。4.蛋白质有自身特有的活动规律，如动态修饰、加工、转运定位、结构形成、代谢等，均无法从基因组水平上的研究获知。蛋白质构象病更难于只靠DNA序列来解释。5.蛋白质不能动态反映生物系统所处的状态。

6.蛋白质组与蛋白质组学（1）蛋白质组(Proteome)：1994年由澳大利亚Macquarie大学的学生Wilkins和他的老师提出，最早见文献是1995年7月的“Electrophoresis”杂志上。指基因组表达的所有相应的蛋白质，也可说是指细胞或机体全部蛋白质的存在及其活动方式。（2）蛋白质组学：研究细胞内全部蛋白质的组成及其活动规律的科学。

7.蛋白质组具有多样性和可变性的特点（1）蛋白质的种类和数量在同一机体的不同细胞中是各不相同的。（2）同一细胞，在不同时期、不同条件下，蛋白质组也是在不断改变的。（3）在病理或治疗过程中，细胞蛋白质的组成及其变化与正常生理过程的也不同。

蛋白质组学不是一个封闭的、概念化的、稳定的知识体系,而是一个领域。它旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式,其内容包括蛋白质的定性鉴定、定量检测、细胞内定位、相互作用研究等,最终揭示蛋白质功能,是基因组DNA序列与基因功能之间的桥梁,是在蛋白质水平上定量、动态、整体性地研究生物体。基因组与蛋白质组比较

基因组转录组蛋白组ThestudyofproteinsexpressedbygenomesCompletionofthesequencingofthe1stdraftofhumangenomeindicatesthereareapproximately250,000proteinsinthehumangenomeOnly2-5%ofproteinsinhumangenomehavebeenidentified表达蛋白质组学研究细胞所表达的蛋白质种类结构蛋白质组学研究细胞内蛋白质的结构功能蛋白质组学

研究细胞内蛋白质的功能，是指从动态和整体的角度研究蛋白质的功能及其结构基础，是位于对个别蛋白质的传统研究和以全部蛋白质为研究对象的蛋白质组研究之间的层次。蛋白质组学的研究内容细胞或组织内蛋白质的表达模式及修饰(表达蛋白质组学):关键技术：2-D电泳2.蛋白质的序列和高级结构（结构蛋白质组学）：X-射线单晶衍射分析（晶体结构分析）、多维核磁共振波谱分析、电镜二维晶体三维重构术（电子晶体学）。3.蛋白质的胞内分布及移位（细胞图谱蛋白质组学）：确定蛋白质在亚细胞结构中的位置，通过纯化细胞器或用质谱仪鉴定蛋白复合物组成等。4.蛋白质的功能模式（功能蛋白质组学）：蛋白质与蛋白质及其与其他分子的相互作用与蛋白质工程密切相关的蛋白质组研究蛋白质表达模式的研究蛋白质序列结构和功能研究蛋白质分离纯化技术蛋白质鉴定技术表达系统的蛋白质组研究大肠杆菌的蛋白质组研究酿酒酵母的蛋白质组研究大肠杆菌的蛋白质组研究

大肠杆菌全部4000多个基因的DNA序列已被测定,建立蛋白质基因联合数据库,并希望籍此来回答以下几方面的问题:a.所有编码基因的产物在双向图谱上的位置ｂ各种蛋白质的丰度ｃ不同条件下各种蛋白质表达水平及合成速率的变化ｄ各种蛋白质在细胞内的定位ｅ某些蛋白质翻译后修饰的方式及水平目前,大肠杆菌的联合数据库已更新到第六版,大约包括1600个蛋白质斑点的数据,其中大约400个蛋白质斑点已与大约350个基因相对应(有些基因可能有多个蛋白质产物),对于这些蛋白质,这个数据库可以提供基因名称、蛋白质名称、EC编号、功能范畴、Swiss-prot数据库编号、Genbank序列号、基因图谱的位置、染色体上的转录方向以及一些生理信息(如在不同生长条件下该蛋白质在细胞内的丰度).酿酒酵母的蛋白质组研究

利用双向电泳技术分析酵母蛋白谱的工作早于蛋白质组概念的提出.酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)基因组的完成及其蛋白质数据库在互联网上的建立,大大加速了这一工作.最新版的数据库包括6000多页,每页代表一个已知或推测的酵母蛋白.它包含以下几方面的信息:ａ以序列为基础的已知和推测的酵母蛋白的特征信息,如分子质量、等电点、氨基酸组成、多肽片段大小等ｂ一些研究得到的关于各种蛋白质在翻译后加工、亚细胞定位、功能分类方面的信息ｃ从以往的超过5000篇关于酵母蛋白研究的文章中获得的有关各种蛋白质功能、相互作用、突变表型的信息.借助数据库的有力推动,在双向电泳蛋白质谱上最明显的蛋白质斑点的大部分得到鉴定

正在丹麦进行的一项研究计划分别作出野生型和将基因系统缺失的缺陷型酵母的双向蛋白质图谱。初步的研究表明，缺失单一基因将导致的结果并不只是缺乏此基因编码的蛋白质，而是能导致其他一系列蛋白质量的改变。一些蛋白质减少而另一些蛋白质增多，当然还有一些蛋白质被加工修饰而导致性状改变。单一基因缺失的结果总是引起蛋白质组全局性的变化。大约20%的酵母基因缺失是致死性的，另外80%则不然,这时机体能通过调节蛋白质的表达来对抗这种内源性的变化。这种基因缺失的研究可能会告诉我们一些关于细胞内蛋白质分子间相互“对话”和“作用”的重要信息，如蛋白质间的物理联系(这些蛋白质可能会组成蛋白质复合物)，信号传递途径，以帮助我们了解细胞是如何构成的以及是如何协同工作的。人类的蛋白质组研究

对人蛋白质组的研究主要聚焦在特异的组织、细胞和疾病上.证据表明,尽管人的不同组织有着很大的功能差别,但其中的许多蛋白质是看家蛋白,因此它们的双向图谱可能也是近似的.这点与简单生物不同,简单生物在不同的发育阶段有着极不相同的蛋白质组.因此对于人类来说,一个高质量的基本的双向图谱是非常有用的,它可以作为其他组织、细胞的参照图谱.人的各种组织、器官、细胞乃至各种细胞器已被广泛研究.

人的各种体液都被用于研究与某些疾病的关系.最近澳大利亚科学家利用双向电泳技术研究眼泪中的蛋白质与生理状态的关系.他们发现了一种新的蛋白质,这个蛋白质非常相似于在乳腺癌细胞里高表达的另一种蛋白质.这个发现可能会提供疾病诊治的新的手段.在一项利用蛋白质组研究技术进行的酒精对人体毒性的研究中发现,乙醇会改变血清蛋白糖基化作用,导致许多糖蛋白的糖基缺乏,如转铁蛋白。

癌细胞不仅有许多特异蛋白质产物,而且这些产物还会影响其他蛋白质的翻译后加工及许多蛋白质的表达水平.肿瘤的蛋白质组研究能提供一些以往其他技术所不能提供的早期诊断依据,例如利用不同细胞组织的特征蛋白质谱,可以判别一些难以判定来源的肿瘤细胞的来源.蛋白质组研究的相关技术（一）研究细胞或组织内蛋白质表达模式的技术：2-D电泳1.1975年，PatrickOˊFarrel发明了二维凝胶电泳。2.操作（1）等电聚焦。（2）平衡胶条。（3）第二相SDS。3.2-D胶上蛋白质鉴定(1)早期Westernblot鉴定(2)Edman降解法鉴定(3)肽质量指纹（peptide-massfingerprinting）技术鉴定(4)蛋白质组信息学2D電泳→

Mass定序分析（二）构象解析技术实际测定具体蛋白质的三维结构：X-射线单晶衍射分析（晶体结构分析）、多维核磁共振波谱分析、电镜二维晶体三维重构术（电子晶体学）。X-射线单晶衍射分析：最成熟和最有力的方法。（1）局限性（2）改进措施：已经运用原子力显微镜及多功能光学诊断技术深入研究蛋白质晶体生长的机理；高能量光源的使用。

2.通过氨基酸序列知识去辨识和推引出其决定的三维结构（1）用分子力学、分子动力学的方法，根据理化的基本原理，从理论上计算蛋白质分子的空间结构。（2）通过对已知空间结构的蛋白质进行分析，找出一级结构与空间结构的关系，总结出规律，用于新蛋白质空间结构的预测。（三）蛋白质序列测定1.蛋白质直接测序的用途2.肽序列分析的基本步骤：（1）分析已纯化蛋白质氨基酸残基的组成。（2）测定头尾氨基酸。（3）把肽链水解成片段，分别进行分析，得到肽图。（4）Edman降解

蛋白质测序发展简史1.英国科学家Sanger测序（20世纪50年代）。2.建立色谱技术和定量氨基酸分析技术（20世纪50年代）。3.Edman降解（20世纪70年代出现）。仪器自动化：液相自动测序仪和固相蛋白质自动测序仪。进入20世纪80年代，气相测序技术出现并实现了仪器自动化。灵敏度显著提高，样品量只需10pmol以下，一次连续测定的顺序甚至可超过80个残基。样品处理远比固相方法简单和操作方便。4.20世纪70年代，华裔学者张瑞耀提出的有色Edman试剂——DABITC，使手工测序技术更加灵敏可靠。5.对2-D胶上的点进行测序：将蛋白质转印到PVDF（聚偏二氟乙烯）膜上，然后将膜片放入测序仪的反应室中进行Edman降解。6.毛细管电泳技术（20世纪90年代发展起来的微量分析技术）的采用，是蛋白质N端微量顺序测定方法学一个引人注目的发展。其灵敏度比HPLC高两个数量级。可在10fmol的水平检测氨基酸。微型测序仪与毛细管电泳联用的微量蛋白质测序方法已经呈现很好的前景。7.蛋白质C端测序：C端测序的重要性：为PCR扩增出某一蛋白的完整基因提供合成C端引物的重要依据；以及为基因表达的蛋白质的鉴定提供关键的证据等。（1）最成功的方法是在Schlack早年提出的异硫氰酸法的基础上发展起来的。（2）直到20世纪90年代初由于发展出一些新的偶联和裂解试剂，配合用HPLC对乙酰内硫脲氨基酸（TH）的鉴定，该方法才得以较快地发展。目前已有自动化C端测序仪，能常规地进行6-8个残基的C端顺序测定。8.质谱法用于蛋白质顺序测定：（1）必要性：DNA顺序测定解决不了翻译后加工所导致的氨基酸残基的修饰问题，Edman降解不能解决N端封闭肽的测序问题，而质谱法能使上述问题迎刃而解。（2）20世纪80年代初出现快原子轰击质谱（FAB质谱）能准确确定的分子量达到数千。相继发展的串行质谱可以把FAB得到的分子离子进行再一次惰性原子轰击，使肽链在不同部位断裂从而得到一组片段的质谱信息，使多肽顺序测定得以实现。（3）20世纪80年代末出现了电喷雾质谱和基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱。电喷雾质谱测定分子量数万的蛋白质准确度可达万分之一，主要优点是可与HPLC仪实现液质联用，因而能使一个蛋白质的酶解产物在得到HPLC肽谱的同时得到一张精确的肽质量谱。飞行时间质谱能对分子量达30万道尔顿的分子进行准确质谱分析。误差率可精确到十万分之一，因而该技术对蛋白质化学结构分析已呈现极大应用前景。该技术结合羧肽酶或氨肽酶的应用可成功地进行蛋白质C端与N端的顺序测定，该方法一个显著的优点是用样品量极微（1-2pmol），且非常快速，每次质谱分析只需数分钟。9.质谱技术不能完全取代Edman降解与其他蛋白质分析方法。通常是联合运用这些技术。10.蛋白质测序展望：（1）N端测序仪在灵敏度上还需提高。（2）C端测序技术需要更新型的偶联试剂和更有效的裂解方法。（3）质谱技术将有令人刮目相看的作为。（4）一些新的分析技术很可能进入蛋白质顺序分析领域，如多维核磁共振方法。（四）研究蛋白质胞内分布及移位的方法1.研究蛋白质组的高通量方法。分别收集细胞不同区域内蛋白质，然后进行2-D电泳和蛋白质鉴定。不能采用离心的方法获取各组分蛋白，而用顺序抽提亚细胞结构的方法。2.将胞内特定蛋白质进行荧光标记，然后在荧光显微镜下进行观察蛋白质移位。（五）研究蛋白质功能模式的技术

酵母双杂交系统、选择性噬菌体感染技术、质谱技术可用于确定蛋白质作用区域。四、蛋白质组学研究的应用1.用于寻找疾病相关的蛋白质：标志物。2.用于微生物蛋白组研究，彻底阐明病原微生物的致病机理并寻找全新的药物作用靶点。3.蛋白质组数据库将成为药物设计的路标