AB液质操作规程

第一部分开关机AA、开机打开UPS电源，打开氮气发生器（气瓶），确认Curtaingas的输入压力为0.4MPa,gas1/2为0.7MPa，exhuast为0.4MPa。打开机械泵电源开关（5500系列直接打开质谱主机电源，仪器自动启动机械泵）等机械泵工作至少30min打开质谱主机电源开关过夜抽真空BB、关机停止输液：关停针泵或液相泵，或新开输液管线（一般质谱主机Standby后液相系统也自动待机，输液泵自动关停，但建议操作人员再次确认，必须保证没有任何液体再泵入质谱）使仪器待机，并灭活配置关闭质谱仪主机电源开关（5500系列只需按下电源开关旁的VENT按键排放真空）机械泵继续工作至少30min关闭机械泵上的电源开关（5500系列会自动关停机械泵，待机械泵停止后即可关闭5500系列主机上的电源开关）关闭气体发生器或气瓶第二部分调谐1、 PPG就是正寓子校正液，PPG3000负寓子调谐液，本台仪器只用两瓶校正液，正寓子一瓶，负寓子一瓶。洗液一瓶50%的甲醇水。调谐前先用洗液洗针两次。吸校正液的时候慢慢吸，避免吸入气泡，吸好以后将针泵卡往。再将高度调到5，将管路重新连接。不再连接六通阀，由质谱直接进样，且将针泵的速度调到10flL/mlo2、 调谐液弄好后在仪器面板工具栏上：TOOl—项目—创建项目。此项目为一个文件夹，文件夹里面包括所有此次采集的信息，方法、序列等，且所有采集的项目都固定在一个文件夹下面：D：/AnalystData/Project。新建项目的时候，弹出窗口中有个AddAll,可以创建文件夹。3、 联机：软件打开后在左上方硬件配置（单机选中，双击打开）—只需选中仪器MS—activeprofile。图标变为绿色，表示联机成功。调谐只需要选中质谱。仪器的实肘状态可以点击右下方的图标，质谱和液相都是单独观察，质谱要注意真空度，为0.5.4、 调谐—手动调谐—项目（文件夹）选中下拉菜单中的Installation20161102（为系统默认的调谐文件夹），先Q1—startsyringpump（打开针泵）—start（质谱），开始采集以后观察基线是否平衡，若等两分钟还未平衡好，则手动将针泵往上抬。5、 平衡好后（基线平稳则为平衡好），重新进样，重新点击startsyringpump。Resolution（分辨率）—advanced（高级选项）（看到结果后调节质量轴和分辨率做准备，只能先打开这个，再打开谱图）—实时质谱图右键—openfile—随便点一个框—软件上方的从谱图校正—PPG.POS（正寓子）—start—出现三行：（1、质量轴。2、分辨率。3、两次调谐的差异）—若质量轴有差异—右上角—yes—若分辨率飞寓出虚线—offset（偏大调火，偏小调小）输入校正的数值，再重新进样，如此反复，直到点落在虚线以，实线代表最合适。6、 校正好后仪器会自动保存，直接关掉窗口即可。负寓子调谐和正寓子调谐步骤一样，只是在选择方法的时候要注意选择负寓子模式。还有看结果时要选择PPG3000.此为负离子调谐液。调谐因针泵减速很小，10"L/ml，所以不需要设定离子源温度及辅助气，直接设定啧雾器减速为50，就可以将样品雾化，气帘气也不需要设置，因为没有多余的溶剂需要吹走。第三部分：方法优化在Analyst软件Tools菜单中选择Project—CreateProject。在Projectname项下输入新建的Project名称。注意，不要点选窗口中的其他按钮！点击OK，确认新建Projecto在Analyst软件界面下，双击导航栏HardwareConfiguration。在弹出窗口中选择MassOnly,点击ActivateProfile，激活MassOnly（只联接质谱主机）。在导航栏单击TuneandCalibrate,进入调谐模式。点击上方工具条中的T钮。此时，应注意到主机有“扑”声音，表明进入调谐状态。此时右下角质谱状态显示绿色。双击ManualTuning,进入质谱参数设置及运行窗口。使用1mL玻璃进样针吸取适当标准溶液，置于进样针座上。点击MSMethod下拉菜单，选择SyringePumpMethod,设定针泵减速FlowRate为10〃L/min。点击StartSyringePump按钮开针泵进样。返回MSMethod，选择扫描模式ScanType为Q1MS，设定扫描速度ScanRate为10Da/s，设定扫描围Start——Stop设定为50——化合物分子量。DP预输入60。点击start开始采集数据。运行稳定后，注意观察是否有预期的母离子出现，并控制其响应值在约£4以下。点击stop，选择第一个峰（后而是同位素峰）的平稳段，双击，选中母寓子。点击右键，选择DeletePane。设定Scantype为产物寓子扫描ProductIon（Ms2），扫描速度200Da/s，选择扫描正/负寓子，输入母寓子（productof），设定扫描围start stop为50——MW+20，覆盖可能的子离子质量围，点击compoud标签，设定（DP）60，（CE）5。点击start，开始采集数据，注意观察是否有预期的母离子出现。手动调节CE，以5eV为步长，逐渐增加。每次增加后稍作等待，直至目标化合物的子离子清晰着见。选择平稳的一段，双击，选择子离子。选择ScanType为MRM。设定参数表格中的Q1对应的母寓子，Q3对应的子离子，time（ms）为50，ID值设为名称1（定量），名称2（定性）。点击EditRamp，在Parameter下选择CollisionEnergy，点击OK。点击start开始采集数据，记录每个MRM通道的最佳CE电压。在MRM参数设定表中，右键点击。选择CollisionEnergyCE，调出表格中的CE列，输入每个MRM通道的最佳CE电压值，精确到个位数。重复以上步骤，在Parameter项下选择DeclusteringPotential，优化并保存DP。完成后选择菜单File/Save保存采样方法，［文件名］.dam。第四部分：方法建立一、LCMS方法的建立：1、 连接仪器：打开HPLC质谱电源，将HPLC系统接上柱子，将6号出口管线与寓子源连好。调离子源啧雾针位置到2mm处，双击HardwareConfigure，在硬件配置菜单下单击LCMS（液相与质谱联用），单击Activateprofile激活仪器，会听到笛的一声，说明仪器巳经连接上。2、 确认液质同步：选择项目（之前优化方法的时候巳经建立的项目，双击Buildacquisitionmethod新建方法，弹出新建方法棋板。在棋板左侧点击acquisitionmethod，棋板右边显示对应的参数，确认synchronizationmode选择LCSync,表示液质同步。3、 设置MRM参教：点击方法棋板左侧的MRM,在棋板右侧ScanType下选择MRM；在polarity下选择化合物极性：Positive（正离子）、Negative（负寓子）；Duration为15min（与液相分离相同的时间）；表格中Q1:母寓子分子量，Q3（Da）：子寓子分子量，Time（msec）：50，ID栏：化合物名称（寓子对名称后空格加1为定量，空格加2为定性），在表格中右键分别单击DP、CE，点击工具栏的OPEN打开之前优化的方法参数，调出DP,CE值，选中整行，Ctrl+c（复制）参数，关闭窗口，再Ctrl+v（粘贴）参数）；最后点击Editparameter＜置寓子源参数：Source/Gas项用以下推荐值：CUR35,IS:5500（正寓子）或-4500（负离子），TEM600，GS160，GS270，点击OK。4、 设置液相参教：点击棋板左边的shimadzuLCsystem，①在右边的pumps栏下，设置stoptime（运行时间）为15min,flow减速为1mL/min,A为水相设为95%,B为有机相设为5%（设置时改B,A自动九泵最大压力为50；点击timeprogram设置液相梯度：例咪唑类梯度设置：Time(min)AB—95%5%55%95%105%95%10.195%5%1595%5%②接着在右边的Autosampler栏下，设置请洗时间，在Rinsemode下选择Beforeandafter（前后都冼），并设置请冼时间为5s，清洗液用50%甲醇水。最后点击保存按钮，在保存窗口输入该方法的名称。二、建立批处理：1、 双击Buildacquisitionbatch,在右边窗口set栏为批处理保存的文件夹命名以便识别，再点击addset,最后点击addsample,再选择之前建立的LC-MS方法，在弹出的窗口的number（进样样品数）处填入需要进样的样品个教，点击OK。2、 在加入的样品列表依次填写samplename（样品名滁）、viaposition（坪品瓶的位置人inj.volunme（进样体积：一般5微升或10微升）。3、 在submit项下点击submit按钮以提交样品序列。4、 点击工具条上左上角的viewqueue按钮，可查看巳提交的样品。此时将仪器从校正状态退出，进入分析模式。确认泵巳打开，首次进样液相先排气，再平衡仪器：先点击工具条上的equilibrate平衡按钮，在弹出的平衡窗口中输入平衡时间10min,点击ok。右下角图标会变黄，待平衡结束后此处图标会变成绿色，此时即可点击startsample按钮采集样品信息，仪器会自动对巳提交的全部样品进行采集。第五部分数据处理双击打开Multiquilt，选择项目，点击File下的荧光棒型图标，点击sample，选择需要的标准品和样品救据，点击next，createnewmethod，为方法命名，点击next，选择一个有代表性的样品（一般选择浓度较大的标品救据），设置分组（同一物质定量寓子和定性寓子设置为一组），并指定标，next，对每个物质进行积分。设置积分参教：a、 CausianSmoth（平滑）：一般是0，如有毛刺可改成1或2；b、 ExpecetedTime（保留时间）：一般不动c、 Expectedtime围：一般30s，表示在保留时间d15s围d、 最小峰宽e、 最小、峰高f、 背景噪音扣除：可调整目标峰基线以下被积分的面积，比例越高积分越往下，必要时调整。g、 分峰因子：峰有分叉时设置，如有两个分叉，设置为2，峰分叉不能大于2h、 单位：设置单位，勾选Applyunitstoall可将此单位用于所有化合物点击next，点击finish。在新跳出窗口将标准品选定，输入浓度。查着各化合物积分是否正常，点击第三个图标查看标准曲线。报告打印：点击File,createreport,Reporttemplate（选择报告棋板，一般用samplel和标线，标报告只能用sample1,2,3），命名，选择存储报告位置，点ok。信噪比：选择项目，双击opendatefile，点击sample，选择低浓度样品，点击ok，点击XIC，选择定量寓子，点击ok，选中峰，按住shift，选峰附近的一段时间，点Script，点击S-To—N—Script，即可得到结果。第六部分：LC-MS寓子阱原理及其应用原理：在进行多级质谱分析（MS-MS）时，首先限定目标质量的寓子。通过调整交变电压，将大于以及小于目标质量的寓子射出，从而使得仅有一个质量的寓子存在于离子阱中并将其富集。目标质量的围被称为IsolationWidth。之后通过向寓子阱注入气体（通常为氨气或氮气），与寓子发生碰撞使其被打成碎片。操作方法：首先在Analyst中打开一个成熟的MRM采样方法，然后右键单击AcquisitionMethod中的MRM，在弹出菜单中选择AddIDACriteriaLevel。在新增的IDA-FirstLevelCriteria页面中设置相关逻辑选项（其中四项尤为重要）1）Select"X”to"Y”mostintensepeaks，表示在多个组分色谱共流出时，指定触发最强的若干个母寓子，“1to2”表示最强和次强的两个母寓子，“1to3”表示最强和次强和第三位三个母离子，以此类推。请注意，如果选择了“1to2”或“1to3”，则后续的EPI个数应调整为对应的两个或三个。（一般选择两个以下）2） AfterDynamicBackgroundSubtractionofSurveyScan，表示执行动态背景扣除，使得感兴趣的母寓子都尽可能的获得触发EPI的机会。该选项尤为重要，为必选项。3） Excludeformertargetions。在某些情况下，一