生物钟基因、免疫系统及骨骼系统的关系研究综述,免疫学论文

生物钟基因、免疫系统及骨骼系统的关系研究综述,免疫学论文摘要：昼夜节律是生命体为适应自然环境而产生的一种生物特性,生物钟基因调节着生命体的节律,Bmal1、Clock、PERs、CRYs、Rev-erb等生物钟基因及下游的钟控基因发挥了重要作用。免疫细胞与骨细胞之间通过共同的细胞因子和信号通路互相作用,调节骨代谢平衡,免疫紊乱会导致骨代谢异常。骨免疫学的诞生有利于深切进入研究骨骼系统与免疫系统的互相作用,骨免疫介入了很多骨科疾病和免疫性疾病的发生和进展。生理状态下,生物钟基因通过调控骨骼系统与免疫系统的生物节律,在维持骨免疫的平衡状态中发挥着重要作用。病理状态下,生物钟基因功能异常不但导致骨骼系统和免疫系统的节律紊乱,进一步导致骨量丢失和免疫炎症反响,而且通过IL-1、IL-6、TNF-、RANKL等骨免疫因子对骨代谢产生作用。反过来,免疫炎症反响也会对生物钟基因正常功能产生影响,进而影响骨代谢。根据生物钟基因和骨代谢本身的特点,认识生理病理状态下生物钟基因与骨免疫的互相作用,对骨骼系统疾病和免疫系统疾病的防治有一定的指导意义。本文关键词语：生物钟基因;骨免疫;骨代谢;免疫细胞因子;Abstract：Thecircadianrhythmisabiologicalcharacteristicoflivingorganismsinordertoadapttothenaturalenvironment.TheclockgenessuchasBmal1,Clock,PERs,CRYs,Rev-erbandclockcontrolgenesexertvitalfunction.Theinteractionbetweenimmunecellsandbonecellsregulatesthebalanceofbonemetabolismthroughtheinteractionofcommoncytokinesandsignalingpathways,andimmunedisorderscouldcauseabnormalbonemetabolism.Thebirthofosteoimmunologyisbeneficialtothefurtherstudyoftheinteractionbetweenskeletalsystemandimmunesystem,andosteoimmunologyisinvolvedintheoccurrenceandprogressionofmanyorthopedicdiseasesandimmunediseases.Inthephysiologicalstate,clockgenesplayanimportantroleinmaintainingthebalanceofosteoimmunologybyregulatingthecircadianrhythmofskeletalsystemandimmunesystem.However,inthepathologicalstate,clockgenesmalfunctionnotonlycausesthedisordersofcircadianrhythmoftheskeletalsystemandtheimmunesystem,itfurtherleadstolossofbonemassandimmuno-inflammatoryreactions.ItalsoexertseffectsonbonemetabolismthroughosteoimmunologyrelatedfactorssuchasIL-1,IL-6,TNF-andRANKL.Theimmuno-inflammatoryreactionsalsoaffectthenormalfunctionofclockgenes,whichinturnaffectsbonemetabolism.Accordingtothecharacteristicsofclockgenesandbonemetabolism,understandingtheinteractionbetweenclockgenesandosteoimmunologyunderphysiologicalandpathologicalconditionswillhavecertainguidingsignificanceforthepreventionandtreatmentofskeletalsystemdiseasesandimmunesystemdiseases.Keyword：clockgenes;osteoimmunology;bonemetabolism;immunologicalcytokines;生物体的生命活动遭到生物钟的调控,包括睡眠-觉悟周期、体温、心率、血压、激素水平和认知的变化等。哺乳动物生物钟的中枢起搏器位于下丘脑视穿插上核,外周的器官、组织、细胞的生物钟同步于中枢生物钟节律。生物钟的构成需要钟基因的介入。首先,Bmal1(brainandmuscleARNT-like-1,Bmal1)基因与Clock基因构成异二聚体,与周期基因(Period,per1-3)和隐花色素基因(Cryptochrome,cry1-2)启动子的E-box结合,驱动PERs和CRYs基因的表示出,同时构成PER/CRY蛋白复合物。PER/CRY蛋白复合物先聚集在细胞质中,随后磷酸化迁移到细胞核中,抑制Clock-Bmal1的活性,关闭PER/CRY转录。这个反应环路由核受体Rev-Erb通过抑制Bmal1的转录调节实现[1]。当细胞核中的PER/CRY复合物降解后,PER/CRY蛋白复合物对Clock-Bmal1的抑制消除,开场新的昼夜循环。迄今人们已经发现10多种核心生物钟基因,主要包括Bmal1、Clock、PERs、CRYs、Csnk1、Rev-erb、RORt等以及转录翻译后的产物。外界光、摄食等信号输入中枢节律起搏器后,通过生物钟基因转录、翻译,然后与输出系统构成一个完好的负反应节律通路。Bmal1和Clock是生物钟的主要正向调控元件,Cry1、Cry2、Per1和Per2则是主要的负向调控元件。生物钟基因介入了细胞生长、能量代谢、免疫调节、肿瘤构成等诸多的生理经过,生物钟基因异常会直接导致生命体昼夜节律紊乱,还会使心血管疾病、代谢性疾病、免疫系统疾病和肿瘤等疾病的发生风险增大。1、骨代谢的本身调控特点人体骨骼是一个不断更新的动态经过,成年人每年约有10%的骨骼会发生骨重塑,以维持骨骼的内稳态。骨吸收和骨构成的动态平衡在骨稳态中发挥着关键作用,成骨细胞(osteoblast,OB)和破骨细胞(osteoclasts,OC)介导了这一经过。OC起源于单核-巨噬细胞产生的多核巨细胞。核因子-B受体活化因子配体(receptororactivatorofNF-Bligand,RANKL)是OC的分化成熟的重要因子。OB、软骨细胞、T细胞、B细胞等均表示出RANKL。在肿瘤坏死因子受体相关因子-6存在时,RANKL与其受体核因子B受体活化因子(nuclearfactorBreceptoractivator,RANK)结合并激活核转录因子-B(nuclearfactorkappaB,NF-B),上调c-fos基因、活化T细胞核因子c(activationofTcellnuclearfactorc,NFATc)活性,促进OC分化。RANKL活性同样遭到骨保卫素(osteoporogeterin,OPG)调控,OB和基质细胞分泌的OPG可作为诱饵受体通过结合RANKL而阻止RANKL与RANK结合,在体外阻断OC分化成熟。所以,OPG/RANKL/RANK系统是调节骨代谢的重要反响器。很多细胞因子能对OC的活性产生作用,如白介素-1(Interleukin1,IL-1)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白介素-17(Interleukin-17,IL-17)、肿瘤坏死因子-(tumornecrosisfactor-,TNF-)、1,25二羟基维生素D3[1,25dihydroxyvitaminD3,1,25(OH)2D3]、RANKL等诱导OC分化;白介素-4(Interleukin-,IL-4)、白介素-10(Interleukin-10,IL-10)、干扰素-(Interferon-,IFN-)、转化生长因子(transforminggrowthfactor-,TGF-)、OPG等对OC的活性产生负向调控;IL-6和TGF-因OC分化的阶段产生不同影响。不同的基因、生长因子、细胞因子等通过NF-B、BMP/Smads、Wnt/-catenin及OPG/RANKL/RANK等信号通路对骨代谢结局产生不同影响。2、免疫系统对骨代谢的调节作用免疫与骨代谢关系复杂多样,为了从细胞分子水平研究两者的互相作用和机制,诞生了骨免疫学。骨细胞和免疫细胞均从骨髓间充质干细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs)分化而来,巨噬细胞、髓样树突细胞与OC共同来源于髓系前体细胞,OB、血液细胞和免疫细胞均来源于骨髓中的造血干细胞。生理条件下,T细胞通过CD40配体与CD40结合可促进B细胞产生OPG,骨髓中45%的OPG来源于成熟B细胞。B细胞可直接介入OC的生成,可以通过RANKL介导OC分化[2]。B细胞敲除的小鼠出现骨质疏松症和骨髓OPG缺陷,T细胞缺陷的老鼠同样如此,导致骨吸收加强[3]。但活化的T细胞和B细胞分泌促进OC的生成因子,包括促进骨丢失的RANKL、IL-17A和TNF-等炎症因子,骨吸收作用加强。T细胞分泌的细胞因子中,RANKL、TNF-、IL-6等促进骨吸收,TGF-、IL-4、IL-10和IFN-等阻碍骨吸收。T细胞活化后激活RANKL/RANK信号通路,对骨吸收产生正向调控。源自CD4+T细胞中的TNF-、RANKL可诱导OC的构成增加,TNF-是炎症中产生OC最有效的因子之一,在存在正常水平的RANKL的情况下,TNF-直接刺激巨噬细胞和OC的分化[4]。IL-6被以为是炎症反响中生物效应的放大因子,是RANKL表示出的受体激活剂。滑膜细胞产生的IL-6能够作为RANKL表示出的受体激活剂,激活粘附分子,将白细胞募集到骨关节处,毁坏细胞外基质。RANKL能够使基质金属蛋白酶9、组织蛋白酶K、酒石酸盐酸性磷酸酶、碳酸酐酶II对IL-1产生反响,共同上调NFATc1的表示出,诱导滑膜细胞增殖和OC分化[5]。研究表示清楚[6],TNF/IL-6复合物能够通过IL-6R、NFATc1、DNAX活化蛋白12和细胞增殖途径,诱导OC在RANK敲除小鼠的骨髓和滑膜培养物中产生。同时,IL-6、白血病抑制因子、制瘤素M在炎症性关节炎的滑膜中表示出增加。讲明TNF与IL-6类细胞因子能够通过非RANKL依靠性途径诱导的OC产生,导致骨毁坏。Wnt信号与成骨密切相关,IL-6与TNF-能够一起抑制滑膜细胞和OB中Wnt信号的激活。而shRNA介导的IL-6基因敲除的小鼠能够在炎症环境中促进骨形态发生蛋白异源二聚体的表示出,诱导OB的发生[7]。用重组小鼠IL-6和IL-6R处理骨样细胞MLO-Y4并与OC前体细胞共培养,发现IL-6和IL-6受体在骨样细胞MLO-Y4的mRNA和蛋白水平上加强了RANKL的表示出和RANKL/OPG表示出比。但使用JAK2抑制剂后发现OC分化能力下降。这表示清楚IL-6可以通过激活JAK2和RANKL介导OC分化[8]。比照健康人群与类风湿关节炎(rheumatoidarthritis,RA)患者发现[9],RA患者更容易发生骨质疏松,这与RA患者体内的免疫细胞因子水平升高相关。同时,RA患者的I型胶原羧基端交联肽(C-terminaltelopeptidescollagen,CTX)水平升高,Ⅰ型前胶原N端前肽(N-terminalpropeptideoftype1precollagen,P1NP)水平降低,这也增加了骨质疏松发生的几率。3、生物钟基因介入骨节律和骨代谢3.1、生物钟基因调节骨组织的节律骨组织具有自个的生物钟,遭到Bmal1、Clock、PERs等时钟基因的调控。将离体小鼠的软骨细胞置于三维海绵上培养后,通过分析胞浆、胞核和细胞骨架的12000多种基因的微点阵,均能发现节律钟基因Clock、Per1和Per2在软骨细胞上的表示出,并呈现明显的节律性[10]。在3～9周龄小鼠的股骨中发现[11],Per2基因转录的节律明显,并且对由于外界影响导致的节律紊乱具有可逆性,表示清楚在骨组织具有相对稳定的生物钟。将小鼠进行光暗周期处理,从松质骨提取mRNA并分析OC相关基因和时钟基因,OC相关基因显示出与时钟基因Per1、Per2和Bmal1同步的节律性。研究表示清楚[12],OC上Bmal1基因和酪氨酸激酶家族互相作用进而与NFATc1启动子结合控制骨吸收。时钟基因Bmall的功能蛋白与NFATc1启动子上的E-box结合,上调钙调神经磷酸酶的活性,使NFATc去磷酸化,激活CN/NFATc信号通路。很多骨转换标志物在血浆或尿液中表现出昼夜变化。研究通过每间隔2h测量10名健康男性血清中的硬骨素、CTX和P1NP,CTX存在明显的昼夜节律,并且在5:30到达峰值[13]。研究人员通过对志愿者进行3周的睡眠限制,比照了20～27岁的年轻人与55～65岁的老年人之间4种骨生物标志物,包括CTX、P1NP、硬骨素和成纤维细胞生长因子23。发现年轻人P1NP的下降幅度比老年人更大,骨构成减少但骨吸收不变,表示清楚昼夜节律紊乱可能在成年早期对骨代谢影响更大[14]。3.2、生物钟基因毁坏对骨代谢的影响时钟基因功能异常会影响骨量。研究发现Per2基因突变和Cry2基因敲除的小鼠在12周龄时骨量显着增加,骨转换率增高。并且Cry2和Per2通过不同的途径调节骨体积,Cry2主要影响OC,而Per2作用于OB[15]。从妊娠4.5d的Per2转基因大鼠分离子宫内膜间质细胞,Per2-dLuc生物发光活性显着下降。用Bmal1特异性siRNA转染的子宫内膜间质细胞发现,Rev-erb表示出下调,骨形态发生蛋白(bonemorphogeneticproteins,BMPs)中BMP2、BMP4和BMP6上调,华而不实Rev-erb在BMPs基因转录沉默中起重要作用。表示清楚BMPs基因通过生物钟基因的衰减而上调,有利于向软骨组织和骨组织分化[16]。研究者通过转录组测序在小鼠椎间盘中发现607个基因的表示出在生理状态中具有节律性。敲除Bmal1的小鼠表现出与年龄正相关的椎间盘退变,讲明了生物钟基因的毁坏可能会影响椎间盘生理病理[17]。随着机体的衰老,老化的BMSCs会减弱向骨细胞分化增殖的能力,导致骨骼衰老。当Rev-erb过表示出时,会促使BMSCs提早衰老,细胞增殖能力下降,进而导致骨构成减少,表示清楚Rev-erb与机体衰老有一定关系[18]。在Bmal1过表示出的小鼠胚胎成纤维细胞中,Bmal1蛋白水平与BMSCs增殖活性之间呈正相关。这可能是由于Bmal1的过表示出激活了经典Wnt途径中-catenin因子,使其表示出增加[19]。另外,研究者通过敲低Clock和Per2两个主要时钟基因,观察到BMSCs分化成脂肪细胞的能力遭到显着抑制,而OB分化能力没有改变[20]。1,25(OH)2D3对OC和OB构成均有调节作用。在Bmal1缺陷型骨细胞中,1,25(OH)2D3能够诱导RANKL的活性加强,导致骨毁坏,而Bmal1/Clock的过表示出则能够在OB中抑制这种情况[21]。Clock基因作为重要的节律调控基因,可以以控制1,25(OH)2D3的受体蛋白质二硫键异构酶A3的转录,调节骨的构成。蛋白二硫键异构酶A3也被证明是一种钟控基因,受上游节律钟基因的控制。而Clock基因突变导致小鼠细胞凋亡增加,骨密度明显降低[22]。4、免疫与生物钟基因互相作用影响骨免疫4.1、生物钟基因调控免疫系统的节律生理状态下,免疫系统具有昼夜节律,免疫功能一定程度上遭到生物钟基因的调控。巨噬细胞、NK细胞、肥大细胞、T细胞和B细胞等细胞的昼夜节律受时钟基因的调节,并且TNF-、IL-6、IL-13、IFN-等细胞因子分泌的节律同样遭到生物钟基因的调控。在健康人的CD4+T细胞中发现时钟基因E4bp4、Per2、Per3、Rev-erb和Ror的mRNA表示出,在时钟基因的刺激下,IL-2、IL-4和IFN-的表示出具有稳定的节律性[23]。IL-17是连接T细胞活化和OC的Th细胞亚群,主要由辅助性T细胞17(Thelpcell17,Th17)产生。在野生小鼠小肠固有层中发现,Th17细胞的节律遭到Clock基因的调节[24]。时钟基因E4bp4介入了Th17细胞的发育。E4bp4通过与RORt结合会抑制Th17细胞的发育,但E4bp4能够通过Rev-erb将Th17细胞发育与生物钟网络相连接[25,26]。4.2、抑制生物钟基因能够促进免疫炎症反响Cry1过度表示出则抑制昼夜节律紊乱导致的血管炎症,这与NF-B信号通路和cAMP/PKA途径激活有关[27]。时钟基因Cry1和Cry2的缺失会引起蛋白激酶A活化,介导p65磷酸化,诱导NF-B活化和IL-6、TNF-的表示出[28]。Rev-erb是具有改变时钟功能的核激素受体之一,主要介入脂质代谢、脂肪构成和炎症反响。Rev-erb可在炎异常感觉和状态态下直接抑制Ccl2启动子中的Rev-erb结合区域,抑制Ccl2下游的MAPK/ERK和p38MAPK信号介导的炎症反响,调节巨噬细胞的炎症浸润,Rev-erb缺损的小鼠巨噬细胞中Ccl2表示出增加证实了Rev-erb的作用[29]。脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)能够刺激TNF-、IL-2和IFN-等细胞因子的表示出,导致炎症反响。实验表示清楚[30],Per2是NK细胞节律功能的重要调节因子。用LPS攻击Per2缺陷小鼠,与野生型小鼠相比,Per2缺陷小鼠血清中促炎细胞因子IFN-和IL-1的水平明显降低,而TNF-、IL-6和IL-10大致正常。肝癌骨质疏松发病率明显升高,且发病率随肝功能损害的逐步加重而逐步升高。在Per2突变的肝癌小鼠模型上发现[31],肝脏IL-6蛋白浓度的失常,肝脏增殖基因包括c-Myc、Wee1、Ccnb1和K-rasmRNA的表示出失调,同时炎症反响加强。在RA缺氧的关节腔内,Clock可诱导血管氧化损伤、炎症反响和骨质毁坏。进一步研究发现这是通过上调IL-1、IL-6、TNF-、细胞间粘附分子1的表示出水平,随后激活NF-B信号,对OC产生调控,导致骨吸收加强[32]。4.3、免疫炎症反响使生物钟基因功能障碍进而影响骨代谢免疫反响也能通过影响生物钟基因对骨代谢产生影响。成纤维样滑膜细胞(fibroblast-likesynoviocytes,FLS)是人类和动物RA模型中的炎症介质之一。在炎症环境中FLSs被激活,导致其表观遗传修饰,侵袭性加强,释放多种细胞因子和生长因子,毁坏软骨和骨[33]。在RA小鼠模型上发现[34],黑暗条件下两个负性调控的时钟基因CRY1和CRY2抑制了FLSs介导的炎症反响。在RA和骨关节炎患者身上发现[35],炎症刺激扰乱了FLSs的节律,并且在生物钟重置之后IL-6和IL-1分泌的昼夜节律毁坏,而ARNTL2和NPAS2似乎是炎症条件下受影响最大的时钟基因。华而不实,TNF-能直接干扰FLSs的时钟基因表示出[36]。表示清楚炎异常感觉和状态态使时钟基因功能障碍,影响正常的生物节律。在RA滑膜细胞中进一步发现,TNF-还加强Bmal1和Cry1的mRNA表示出,但不影响Clock、Per1和Cry2的表示出[37]。另外,TNF-在滑膜成纤维细胞中以NF-B依靠性方式在mRNA和蛋白质水平上刺激钟控基因DEC2的表示出[38]。但在钙信号存在时,TNF-与TNFR1互相作用导致Dbp表示出快速下调,时钟基因Per1、Cry1上调,同时使分化型胚胎软骨发育基因1表示出加强,有利于向软骨细胞分化[39]。研究显示,TNF和IL-1能够抑制Per1-3、Cry1-2、PAR-bZip等多种时钟基因以及钟控基因的表示出[40]。这是由于TNF导致Twist1的过表示出与CLOCK竞争性结合PERs和Dbp的E-box,导致时钟基因转录受阻[41]。在衰老小鼠OA模型中,Per2转录的昼夜节律性在软骨组织中显着降低[42]。除了年龄的影响,还由于炎异常感觉和状态态下,IL-1消除Cry1转录和Per2转录表示出的昼夜节律,而NF-B信号通过干扰Clock/Bmal1复合物的功能介入了这一经过[43]。5、结束语免疫系统与骨骼系统有复杂的关系,免疫系统对骨代谢结局有双向作用,细胞因子的种类起着关键作用。生物钟基因既能调节免疫系统和骨骼系统的生物节律,可以以直接对骨免疫产生影响,还能够通过骨免疫相关的细胞因子对骨量产生不同作用。免疫反响也能抑制或加强生物钟基因的功能,进而影响骨代谢。但由于生物钟基因诸多,当前的研究对生物钟基因的功能尚不能完全解释。同时,骨免疫经过生理机制复杂多变,免疫系统的细胞因子与骨细胞的关系需更多研究说明,生物钟基因怎样影响骨免疫来调节骨细胞功能的机制需深切进入研究。以下为参考文献：[1]YamajukuD,ShibataY,KitazawaM,etal.CellularDBPandE4BP4proteinsarecriticalfordeterminingtheperiodlengthofthecircadianoscillator[J].FEBSLett,2018,585(14):2217-2222[2]LiY,ToraldoG,LiA,etal.BcellsandTcellsarecriticalforthepreservationofbonehomeostasisandattainmentofpeakbonemassinvivo[J].Blood,2007,109(9):3839-3848.[3]ManabeN,KawaguchiH,ChikudaH,etal.ConnectionbetweenBlymphocyteandosteoclastdifferentiationpathways[J].JImmunol,2001,167(5):2625-2631.[4]SakaiE,AokiY,YoshimatsuM,etal.SanguiinH-6,aconstituentofRubusparvifoliusL,inhibitsreceptoractivatorofnuclearfactor-Bligand-inducedosteoclastogenesisandboneresorptioninvitroandpreventstumornecrosisfactor--inducedosteoclastformationinvivo[J].Phytomedicine,2021,23(8):828-837.[5]JulesJ,ZhangP,AshleyJW,etal.MolecularbasisofrequirementofreceptoractivatorofnuclearfactorBsignalingforinterleukin1-mediatedosteoclastogenesis[J].JBiolChem,2020,287(19):15728-15738.[6]OBrienW,FisselBM,MaedaY,etal.RANK-independentosteoclastformationandboneerosionininflammatoryarthritis[J].ArthritisRheumatol,2021,68(12):2889-2900.[7]M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