痰抗酸杆菌的荧光染色法

关于痰抗酸杆菌的荧光染色法第一页，共十九页，2022年，8月28日抗酸杆菌的荧光染色检查法主要内容1.原理2.操作程序3.舜宇EX30荧光显微镜的操作使用4.质量控制第二页，共十九页，2022年，8月28日抗酸杆菌荧光染色的原理抗酸杆菌是无色半透明的有阴电荷和很微弱的固有荧光的微生物，而荧光素金胺O是一种含有自由氨基的金黄色碱性染料，它的离子带有阳电荷，因此金胺O能和带阴电荷的抗酸杆菌结合而使其着荧光色素，当其遇到紫外线或青色线时，即可激发出桔黄色荧光。第三页，共十九页，2022年，8月28日抗酸杆菌荧光染色检查操作程序（一）涂片①取经95%乙醇擦拭脱脂过的干燥、清洁、无油污、无划痕的新玻片，于玻片磨砂端用铅笔在背面左端1/3标注实验编号和序号；②在生物安全柜内，小心打开标本容器，用折断的竹签（需事先准备好）茬端挑取痰标本的脓样、干酪样部分，于玻片右侧2/3处均匀涂抹成10×20mm卵圆形痰膜，待自然干燥。第四页，共十九页，2022年，8月28日抗酸杆菌荧光染色检查操作程序（二）染色1．把痰片放在染色架上，痰片间距应大于10mm，火焰固定(5秒钟火焰在玻片下方通过4次)；2.滴加0.1%金胺Ｏ染液，盖满痰膜，保持染色15分钟。染色时应始终保持痰膜被染色液覆盖，必要时可续加染色液。第五页，共十九页，2022年，8月28日抗酸杆菌荧光染色检查操作程序（二）染色3．流水自玻片上端轻缓冲洗，洗去染色液后倾斜玻片沥去残余水；4．滴加脱色液（3%盐酸乙醇），脱色3分钟或至痰膜无色；5.流水自玻片上端轻洗，如果脱色不彻底，重复脱色操作；第六页，共十九页，2022年，8月28日抗酸杆菌荧光染色检查操作程序（二）染色6．沥去残余水；7．滴加0.5%高锰酸钾复染液，保持染色1～4分钟（根据试剂说明书或经验）；流水自玻片上端轻洗，洗去复染液，沥去残余水，待自然干燥。第七页，共十九页，2022年，8月28日抗酸杆菌荧光染色检查操作程序（三）镜检和报告使用汞光源灯或LED光源的荧光显微镜，用10×目镜，20×物镜观察，发现疑似抗酸菌的杆状物，转用40×物镜确认。在黑暗背景下，抗酸杆菌呈黄色绿荧光，杆状略弯曲。按下列标准报告结果：1.抗酸杆菌阴性：连续观察50个视野，未发现抗酸杆菌。第八页，共十九页，2022年，8月28日抗酸杆菌荧光染色检查操作程序（三）镜检和报告2.抗酸杆菌（1~9条）：1～9条抗酸杆菌/50个视野（报告抗酸杆菌数）。3.抗酸杆菌阳性（1＋）：10～49条抗酸杆菌/50个视野。4.抗酸杆菌阳性（2＋）：1～9条抗酸杆菌/每视野。第九页，共十九页，2022年，8月28日抗酸杆菌荧光染色检查操作程序（三）镜检和报告5.抗酸杆菌阳性（3＋）：10～99条抗酸杆菌/每视野。6.抗酸杆菌阳性（4＋）：≥100条抗酸杆菌/每视野。镜检结果应及时记录在“结核病细菌学实验室登记本”和检验报告单上。第十页，共十九页，2022年，8月28日抗酸杆菌荧光染色检查操作程序（四）痰片保存荧光染色的痰涂片，在存放过程中抗酸杆菌的荧光会随时间的延长而衰减，因此，荧光染色的标本片必须尽快放置到避光环境、4℃冰箱保存，一般可保存半年。注意:荧光染色的痰涂片必须避光低温存放，否则阳性标本因荧光衰退，可导致抽查复检时呈假阴性!第十一页，共十九页，2022年，8月28日舜宇EX30显微镜荧光镜操作简要程序1.接通电源之前，确认荧光器组的调光手轮是断开（OFF）状态；2.把外接电源变压器输出接口（直流6V）插入LED荧光照明器组的电源插口，然后把另一端直接插到供电插座上；3.缓缓顺时针方向开启荧光器组件的调光手轮，不必开到最大；4.将荧光滤光块箭头切换到指向Flourescence标志第十二页，共十九页，2022年，8月28日舜宇EX30显微镜荧光镜操作简要程序5.把荧光染色并已干燥的痰片装入载物台，目镜10×配合物镜20×寻找荧光物，在黑暗背景中寻找到荧光镜象，发现形似抗酸杆菌的荧光物时，转用40×物镜确认。6.镜检完毕，逆时针方向旋转荧光器组件的调光手轮至关断（OFF）位置，最后关断电源插座开关或拨出显微镜变压器供电端的插头。(镜检后的标本置于标本盒内，放4℃冰箱避光保存)第十三页，共十九页，2022年，8月28日

萋—尼氏法与荧光法的主要区别：

项目萋—尼氏染色法荧光染色法初染色碱性复红热染5分钟（或冷染15分钟）0.1%金胺Ｏ染液，不加热染色15分钟，脱色时间1分钟（脱色不彻底可重复）3分钟（脱色不彻底可重复）复染液亚甲兰复染，30秒高锰酸钾复染，1～4分钟镜检普通显微镜，目镜10×，油镜100×荧光显微镜，目镜10×，物镜40×阴性报告300个视野未发现抗酸杆菌50个视野未发现抗酸杆菌报告抗酸杆菌数1~8条抗酸杆菌/300视野1~9条抗酸杆菌/50个视野抗酸杆菌阳性(1＋)3－9条抗酸杆菌/100视野10~49条抗酸杆菌/50个视野抗酸杆菌阳性(2＋)1－9条抗酸杆菌/10视野1~9条抗酸杆菌/每视野抗酸杆菌阳性(3＋)1－9条抗酸杆菌/每视野10~99条抗酸杆菌/每视野抗酸杆菌阳性(4＋)≥10条抗酸杆菌/每视野≥100条抗酸杆菌/每视野标本片保存拭去镜油后放玻片盒，室温保温玻片盒避光、4℃冰箱保存标本片保存期长期半年内第十四页，共十九页，2022年，8月28日抗酸杆菌荧光染色检查质量控制主要包括：标本收集、试剂、涂片、染色操作、显微镜维护、镜检和结果登记及痰片的保存。1.标本收集：用密封有盖盒收集痰标本，容器应标明病姓名、送检日期及门诊号。标本性质：应为深咳痰液，痰性状类别：脓样痰、干酪样痰、血性样痰、脓性粘液痰和水样痰。第十五页，共十九页，2022年，8月28日抗酸杆菌荧光染色检查质量控制2.试剂：染液外观无沉淀、无悬浮物（金胺O非常稳定，一般不产生沉淀），贮存环境避光通风、避免高温，每次使用后及时盖紧，已开瓶的试剂的使用，一般控制在6个月内用完或弃去。3.涂片：应当取痰的脓样、干酪样部分，于玻片右侧2/3均匀涂成10×20mm痰膜，自然干燥，染色前固定。第十六页，共十九页，2022年，8月28日抗酸杆菌荧光染色检查质量控制4.染色：初染15分钟要避免染液干燥，可续加染液；脱色符合要求，复染操作根据试剂说明书或经验控制好时间，时间过长可导致荧光亮度消失。初染、脱色、复染的水洗后，都要沥去玻片上的残余水。5.显微镜维护：防尘、防潮、防震、避免阳光直射，按操作规范使用，定期清扫灰尘。为延长光源灯的使用寿命，一般不把光源调到最强，并且注意使用后及时关闭光源灯开关和变压器电源。第十七页，共十九页，2022年，8月28日抗酸杆菌荧光染色检查质量控制6.镜检：镜头清晰，无霉菌，视野清晰，物镜20