多糖的提取分离方法

/91.多糖的提取方法生物活性多糖主要有真菌多糖、植物多糖、动物多糖 3大类。多糖的提取首先要根据多糖的存在形式及提取部位，决定在提取之前是否做预处理。动物多糖和微生物多糖多有脂质包围，一般需要先加入丙酮、乙醚、乙醇或乙醇乙醚的混合液进行回流脱脂，释放多糖。植物多糖提取时需注意一些含脂较高的根、茎、叶、花、果及种子类，在提取前，应先用低极性的有机溶剂对原料进行脱脂预处理，目前多糖的提取方法主要有溶剂提取法、生物提取法、强化提取法等。1． 1溶剂法1． 1．1水提醇沉法水提醇沉法是提取多糖最常用的一种方法。多糖是极性大分子化合物，提取时应选择水、醇等极性强的溶剂。用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提渗滤，然后将提取液浓缩后，在浓缩液中加乙醇，使其最终体积分数达到70%左右，利用多糖不溶于乙醇的性质，使多糖从提取液中沉淀出来，室温静置5h,多糖的质量分数和得率均较高。影响多糖提取率的因素有：水的用量、提取温度、浸提固液比、提取时间以及提取次数等。水提醇沉法提取多糖不需特殊设备，生产工艺成本低，安全，适合工业化大生产，是一种可取的提取方法。但由于水的极性大，容易把蛋白质、苷类等水溶性的成分浸提出来，从而使提取液存放时腐败变质，为后续的分离带来困难，且该法提取比较耗时，提取率也不高。1．1．2酸提法为了提高多糖的提取率，在水提醇沉法的基础上发展了酸提取法。如某些含葡萄糖醛酸等酸性基团的多糖在较低 pH值下难以溶解，可用乙酸或盐酸使提取液成酸性，再加乙醇使多糖沉淀析出，也可加入铜盐等生成不溶性络合物或盐类沉淀而析出。由于H+的存在抑制了酸性杂质的溶出，稀酸提取法提取得到的多糖产品纯度相对较高，但在酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂，且酸会对容器造成腐蚀，除弱酸外，一般不宜采用。因此酸提法也存在一定的不足之处。1．1．3碱提法多糖在碱性溶液中稳定，碱有利于酸性多糖的浸出，可提高多糖的收率，缩短提取时间，但提取液中含有其它杂质，使粘度过大，过滤困难，且浸提液有较浓的碱味，溶液颜色呈黄色，这样会影响成品的风味和色泽。1．1．4超临界流体萃取法超临界流体萃取技术是近年来发展起来的一种新的提取分离技术。超临界流体是指物质处于临界温度和临界压力以上时的状态，这种流体兼有液体和气体的特点，密度大，粘稠度小，有极高的溶解，渗透到提取材料的基质中，发挥非常有效的萃取功能。而且这种溶解能力随着压力的升高而增大，提取结束后，再通过减压将其释放出来，具有保持有效成分的活性和无溶剂残留等优点。由于CO2的超临界条件(TC=304.6C,Tp=7.38MPa)容易达到，常用于超临界萃取的溶剂，在压力为8〜40MPa时的超临界CO2足以溶解任何非极性、中极性化合物，在加入改性剂后则可溶解极性化物。该法的缺点是设备复杂，运行成本高，提取范围有限。1．2酶解法1．2．1单一酶解法单一酶解法指的是使用一种酶来提取多糖，从而提高提取率的生物技术。其中经常使用的酶有蛋白酶、纤维素酶等。蛋白酶对植物细胞中游离的蛋白质具有分解作用，使其结构变得松散；蛋白酶还会使糖蛋白和蛋白聚糖中游离的蛋白质水解，降低它们对原料的结合力，有利于多糖的浸出。1．2．2复合酶解法复合酶解法采用一定比例的果胶酶、纤维素酶及中性蛋白酶，主要利用纤维素酶和果胶酶水解纤维素和果胶，使植物组织细胞的细胞壁破裂，释放细胞壁内的活性多糖，多糖释放的多少和复合酶的加入量、酶解温度、酶解时间、酶解pH值有直接的关系。酶解法提取的实质是通过酶解反应强化传质过程。此法具有条件温和、杂质易除和得率高等优点。1．3物理强化法1．3．1微波辅助提取法微波萃取是高频电磁波穿透萃取媒质，到达被萃取物料的内部，能迅速转化为热能使细胞内部温度快速上升，细胞内部压力超过细胞壁承受力，细胞破裂，细胞内有效成分流出，在较低的温度下溶解于萃取媒质，通过进一步过滤和分离，获得萃取物料。微波辅助提取多糖和其他的萃取方法比较，微波萃取效率高，操作简单，且不会引入杂质，多糖纯度高，能耗小，操作费用低，符合环境保护要求，是很好的多糖提取方法。1．3．2超声波辅助提取法超声波提取是利用超声波的机械效应、空化效应及热效应。机械效应可增大介质的运动速度及穿透力，能有效的破碎生物细胞和组织，从而使提取的有效成分溶解于溶剂之中；空化效应使整个生物体破裂，整个破裂过程在瞬间完成，有利于有效成分的溶出；热效应增大了有效成分的溶解速度，这种热效应是瞬间的，可使被提取成分的生物活性尽量保持不变；此外，许多次级效应也能促进提取材料中有效成分的溶解，提高了提取率。超声波提取与水煮法醇沉法相比，萃取充分，提取时间短；与浸泡法相比，提取率高。1．3．3高压脉冲法高压脉冲法是对两电极间的流态物料反复施加高电压的短脉冲（典型为20〜80kV/cm）进行处理，作用机理有多种假说，如细胞膜穿孔效应、电磁机制模型、粘弹极性形成模型、电解产物效应、臭氧效应等，研究最多的是细胞膜穿孔效应。动物、植物、微生物的细胞，在外加电场作用下，产生横跨膜电位，绝缘的生物膜由于电场形成了微孔，通透性发生变化，当整个膜电位达到极限值（约为1V）时，膜破裂，膜结构变成无序状态，形成细孔，渗透能力增强。电位差达到临界点，细胞破裂。2.多糖的分离纯化2．1除蛋白2.1.ISevage法根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的特点，用V（氯仿）：V（戊醇或正丁醇）为5：1或4：1,混合物剧烈振摇20〜30min,蛋白质变性生成凝胶，离心分离，分去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质。此种只能除去少量蛋白质，效率不高，须反复多次，多糖有损失。但此方法比较温和，在避免多糖降解上效果较好，如配合加入一些蛋白质水解酶，用 Sevage法效果更佳。此法不能除去脂蛋白，因为脂蛋白溶于氯仿。2．1．2三氟三氯乙烷法将多糖溶液与三氟三氯乙烷等体积混合，低温搅拌 10min左右，离心分离得上层水层，水层继续用上述方法反复处理几次，得无蛋白质的多糖溶液，此法效率较Seavg法高，但溶剂沸点低，易挥发，不宜大量应用。2．1．3三氯乙酸法三氯乙酸是一种有机酸，使多糖提取液中的蛋白质与有机酸作用而变性沉淀。该法是在多糖水提液中滴加 5%~10%与多糖水提取液等体积的三氯乙酸，混匀静置过夜，离心除去胶状沉淀，重复以上的操作直至溶液不再继续混浊为止，得无蛋白质的多糖。三氯乙酸浓度越大，除蛋白质效果越好，但对多糖的影响也越大，可能是三氯乙酸对多糖结构具有破坏作用，使多糖降解，而且这种破坏作用随着三氯乙酸浓度增大而增强。植物多糖常采用三氯乙酸法除蛋白质，也可先用蛋白水解酶，使样品中的蛋白质部分降解后再用Sevag法效果更好；微生物多糖去除蛋白常采用Sevag法、三氟三氯乙烷法；也可用盐析法、有机溶剂萃取等方法除蛋白。2．2多糖的分离主要有分级沉淀、季铵盐沉淀法、金属盐沉淀法、色谱分离、膜分离、透析、电渗析等，目前大多采用 DEA3凝胶或其他各种不同类型的凝胶柱层析以及离子交换色谱法。2．2．1分级沉淀法大多数活性多糖可溶于水，3个碳以下的多糖还可溶于乙醇，随着聚合度的增大，多糖在乙醇中的溶解度逐渐降低。根据这一性质可在多糖的浓缩水溶液中分批加入乙醇，使乙醇的体积浓度逐渐增加到 50,100,200,900mL/L,从而使不同聚合度的多糖分别沉淀析出。2．2．2色谱分离法常用两种色谱分离方法：一是凝胶柱色谱法，二是离子交换色谱法。2．2．3膜分离法膜分离技术（membraneseparationtechnology,MST）是一种高效分离技术，分离过程以选择透过性膜作为分离介质，通过在膜两侧施加某种推动力（压力差、化学位差、电位差等），使原料液中组分有选择性的通过膜。目前应用较多的是超滤和微滤技术。3多糖的分析鉴定3．1含量的测定测定方法：硫酸－苯酚法、硫酸－蒽酮法、比色定量法、分光光度法、纸色谱法、离子交换色谱法、yaphe法、薄层色谱法、酶法、原子吸收法、 HPLC法、凝胶电泳法、亲和电泳法、连续流动分析法检测法[44]、次亚碘酸盐定量法、意酮—硫酸法（总糖）、DNS法（还原法）、磷铝比色法、邻钾苯胺比色法等。每种方法只对某些多糖的测量效果好。比色法、分光光度法、离子交换色谱法、酶法和电泳法等可同时用于多糖的定性定量分析。3．2纯度鉴定多糖是高分子化合物，其纯品微观上是不均一的，通常所说的多糖纯品实质上是一定分子量范围的均一组分。多糖纯度鉴定的常用方法：超离心、高压电泳、凝胶层析、HLPC1等。现在应用较多的是HLPCI,旋光度测定也是纯度测定的一种方法。3．3分子量的测定多糖分子量的测定是研究多糖性质的一项重要工作。常用方法：渗透压法、蒸气压渗透剂法、端基法、粘度法、光散射法、凝胶色谱法、超过率法、沉淀法、凝胶电泳法、HPLC1、超离心分析法、分子筛色谱法、 GPC!、MALDI—TOF—MS法。3．4结构测定3．4．1多糖一级结构测定多糖的一级结构分析，主要是分析组成多糖的单糖类型、数目、连接方式及苷建构型。常用化学法和仪器分析法。多糖组分与分子比例测定法：部分酸解法、完全酶解法、色谱法；吡喃、呋喃环形式结构的分析：红外光谱；连接次序：选择性光谱法、糖昔键顺序水解、核磁共振；％-B-异头异构体：糖昔酶水解、核磁共振；羟基被取代情况：甲基化反应、气相色谱、过碘酸氧化、Smith降解法和测硫酸基法（terho法）、核磁共振、质谱法；糖链、肽链连接方式：单糖与氨基酸组成、稀碱水解法、肼解反应；多糖结构的分析方法很多，迄今没有一种方法可以单独完成多糖结构的分析。仪器分析与化学方法相结合是常用的多糖结构测定方法。3．4．2多糖高级结构测定目前研究多糖的二级结构常用的手段是 NMR技术，如2D—NMR,13C谱,通用的方法是将现代NMR技术与理论计算相结合通过一定的理论计算筛选构象，主要的理论计算方法有从头计算、丰度经验计算及经验力场计算。圆二色谱法（CD）也可用于糖的构象分析，近年来，以精确三维结构知识为基础揭示重要生命活动的规律已达到前所未有的深度和广度，多糖作为一类重要的生物活性大分子其结构的研究势必推动对多糖的认识向深层次发展。3、通过活动，使学生养成博览群书的好习惯。TOC\o"1-5"\h\zB比率分析法和比较分析法不能测算出各因素的影响程度。 VC采用约当产量比例法，分配原材料费用与分配加工费用所用的完工率都是一致的。XC采用直接分配法分配辅助生产费用时，应考虑各辅助生产车间之间相互提供产品或劳务的情况。错C产品的实际生产成本包括废品损失和停工损失。 VC成本报表是对外报告的会计报表。 XC成本分析的首要程序是发现问题、分析原因。xC成本会计的对象是指成本核算。xC成本计算的辅助方法一般应与基本方法结合使用而不单独使用。 VC成本计算方法中的最基本的方法是分步法。XD当车间生产多种产品时，“废品损失”、“停工损失”的借方余额，月末均直接记入该产品的产品成本中。xD定额法是为了简化成本计算而采用的一种成本计算方法。 xF废品损失”账户月末没有余额。VF废品损失是指在生产过程中发现和入库后发现的不可修复废品的生产成本和可修复废品的修复费用。XF分步法的一个重要特点是各步骤之间要进行成本结转。（a/）G各月末在产品数量变化不大的产品，可不计算月末在产品成本。错G工资费用就是成本项目。（x）G归集在基本生产车间的制造费用最后均应分配计入产品成本中。对J计算计时工资费用，应以考勤记录中的工作时间记录为依据。J计算计时工资费用，应以考勤记录中的工作时间记录为依据。J简化的分批法就是不计算在产品成本的分批法。 （x）J简化分批法是不分批计算在产品成本的方法。对J加班加点工资既可能是直接计人费用，又可能是间接计人费用。VJ接生产工艺过程的特点，工业企业的生产可分为大量生产、成批生产和单件生产三种，XK可修复废品是指技术上可以修复使用的废品。错K可修复废品是指经过修理可以使用，而不管修复费用在经济上是否合算的废品。XP品种法只适用于大量大批的单步骤生产的企业。 XQ企业的制造费用一定要通过 制造费用”科目核算。XQ企业职工的医药费、医务部门、职工浴室等部门职工的工资，均应通过应付工资”科目核算。XS生产车间耗用的材料，全部计入 直接材料”成本项目。XS适应生产特点和管理要求，采用适当的成本计算方法，是成本核算的基础工作。（X）W完工产品费用等于月初在产品费用加本月生产费用减月末在产品费用。对Y预提费用”可能出现借方余额，其性质属于资产，实际上是待摊费用。对Y引起资产和负债同时减少的支出是费用性支出。XY以应付票据去偿付购买材料的费用，是成本性支出。XY原材料分工序一次投入与原材料在每道工序陆续投入，其完工率