培养基的制备与消毒灭菌

实验三

培养基的制备与消毒灭菌一、实验目的1．掌握培养基的配制、分装方法2．掌握各种实验室灭菌方法及技术。内容：1．牛肉膏蛋白胨固体培养基的配制及分装2．培养基的灭菌牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（用于分离和培养细菌，是一种天然培养基）配方如下：

牛肉膏3g

蛋白胨5g

氯化钠3g

琼脂20g

自来水1000mL

pH7.2~7.4

灭菌1.05kg/cm2，25~30min二、实验材料和用具

牛肉膏、蛋白胨、琼脂、

NaCl

等；试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、角匙、pH试纸、记号笔、高压蒸气灭菌锅、等。三、操作步骤（一）培养基的配制1．称药品

先按配方计算再称量如需加蛋白胨，应迅速．因其易吸湿．2．溶解3．调pH

制固体培养基时，先调完pH再加琼脂应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。4．过滤：供一般使用的培养基，这步可省略。5．分装

分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。分装量：固体培养基约为试管高度的1/5，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。半固体培养基以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。液体培养基分装高度为试管高度的1/4为宜.6．加塞7．包扎

若培养基分装于试管中，则应以5支或7支在一起，再于棉塞外包一层牛皮纸，用绳扎好。然后用记号笔注明培养基名称、组别、日期（eg:牛肉/070101/090330）。8．灭菌将上述培养基于121℃湿热灭菌20min。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。9．摆斜面

灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，便斜面的长度不超过试管总长的1/2。（二）培养基的灭菌1．加水2．装料注意不要装得太挤，以免防碍蒸气流通而影响灭菌效果3．加盖将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内，两两对称的方式旋紧螺栓4．加热打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸气压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用0.1Mpa，121.3℃，20min灭菌。灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力。灭菌锅留有不同分量空气时，压力与温度的关系

5．灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。

压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤操作者。6．将取出的灭菌培养基，需摆斜面的则摆成斜面，待用。

[注意事项]1.称药品每一种成分用一个药匙，防止相互污染。固体培养基琼脂用量为2%。

天平用完要及时关毕。

2.定容培养基定容要在所有成分加好溶解后再定容。

3.分装分装要趁热，并且不要把培养基弄到试管口或三角瓶口，防止污染

4.各种培养基要做好标记

5.各种器皿用完及时清洗。

分组及分工(每5人一组,共4组)第一、二组:牛肉膏蛋白胨培养基200mL，分装2只三角瓶，包扎、灭菌。第三、四组、牛肉膏蛋白胨培养基200ml，分装小试管，包扎,灭菌，摆斜面．交教师备用。每组：

三角瓶装99ml蒸馏水（加玻璃珠），1只；大试管装9ml蒸馏水，5只；培养皿5套角匙（称土壤用），1只包扎、灭菌实验安排配培养基灭菌土壤稀释液制备分离稀释倾注平板法分离土壤微生物培养基及灭菌实验(每4人一组)

三角瓶装99ml自来水（加玻璃珠），1只；每组准备：大试管装9ml自来水，若干只；包扎、灭菌角匙（称土壤用），１只第一组＼第二组:配200mL培养基，分装2个三角瓶中，灭菌第三组＼第四组：配200mL培养基，分装试