生物大分子课件：bio-coures-3

蛋白质的分离和提纯蛋白质分离提纯的一般原则蛋白质的分离纯化是研究蛋白质的基础和起点。蛋白质在组织或细胞中通常都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质。目前为止，还没有一个单独的方法能把任何的一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来。但是对于任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离提纯程序以获得高纯度的制品。蛋白质提纯的总目标是增加制品纯度或比活性。为了成功地分离和纯化一种蛋白质，需要有一个根据背景知识和下述准则建立起来的合适策略

什么是最好的来源？需考虑来源是否方便得到和来源的量，以及所需蛋白质是否丰富等。过去在实验室中常从动物的肝脏中得到大量的蛋白质；现在，大多数生化学家则是采用培养的细胞如细菌、酵母或哺乳动物细胞。目前，利用基因克隆的长处，所需的蛋白质可以通过表达来大量得到，从而使纯化方法更具有意义。

关于蛋白质我们已知什么？如果一个蛋白质过去已从不同的来源纯化得到，它的很多信息可应用到新来源的蛋白质。例如：分子的大小、定位、等电点、疏水性及翻译后的修饰等，应该保持相同。如果蛋白质是一个酶或受体，则根据该蛋白质与底物或配体的关系可以制定出一个成功的纯化策略。

蛋白质需要有多纯？蛋白质纯化的程度通常取决于它最后的用途。如果蛋白质是供研究用的，则它应该是非常纯的，如果蛋白质是用于工业的，部分纯化就足够了。

纯化蛋白的量要多少?对于活性研究用的，只需要比较少量的活性蛋白质；而对于进行结构研究用的蛋白质来说，则需要比较大量的高纯度蛋白质。

蛋白质应该如何进行鉴定?在蛋白质纯化过程中，为了进行蛋白质的追踪，必须有一个快速、重复性好而且灵敏的鉴定方法。此鉴定方法还应该是经济的，能在小体积下进行操作，而且不要求采用昂贵的仪器。

纯化时间应该多长?纯化步骤应该很快，以减少蛋白质活力的丧失和蛋白质降解等。一般来说．蛋白质的量在纯化过程的各步中均会有损失，因此应当尽量减少纯化步骤，以期获得最大的产率。

什么是最终花费?对于商用蛋白质来说费用和时间非常重要。•••••••••蛋白质分离提纯的一般程序分离提纯某一特定蛋白质的一般程序可分为前处理、粗分级和细分级三步：前处理：分离提纯蛋白质，首先要求把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不至于丢失其生物活性。不同的组织或细胞可用不同的方法破碎；组织或细胞破碎以后，选择适当的介质（一般用低浓度的缓冲液）把所要的蛋白质提取出来。有时在肌肉组织中抽提时也用稀碱（肌肉中含有乳酸）；在提取膜蛋白或包含在体内的蛋白质时，可加入表面活性剂以增加溶解度。由于在细胞中普遍存在各种蛋白质水解酶，有时需低温操作和加一些相应的蛋白酶抑制剂、螯合剂可防止蛋白质的降解。粗分级：当蛋白质混合物提取液获得后，选用一套适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白质分离开来。一般这类的分级用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。其特点是简便、处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质溶液。细分级：即样品的进一步提纯。一般使用层析法包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择电泳法，包括区带电泳、等电聚焦电泳等作为后续的提纯步骤。

结晶是蛋白质分离提纯的最后步骤。尽管结晶并不能保证蛋白质的均一性，但只有某种蛋白质在溶液中数量上占优势时才能形成结晶。结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯，而重结晶又可除去少量的夹杂蛋白质。由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。蛋白质的纯度越高、溶液浓度越浓就越容易结晶。结晶的最佳条件是使溶液略处于过饱和状态，这可以借控制温度、加盐盐析、加有机溶剂或调节pH等方法来达到。蛋白质的分离根据蛋白质在溶液中的性质分离蛋白质混合物的方法根据分子大小不同的分离方法透析和超过滤：利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。常用的半透膜是赛璐玢纸、赛璐啶纸或其它合成以及天然材料。超过滤是利用压力或离心力强行使水和其它小溶质分子通过半透膜。密度梯度（区带）离心：蛋白质颗粒的沉降不仅决定于它的大小，也取决于它的密度。如果蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，并且每种蛋白质颗粒沉降到于自身密度相等的介质梯度时，就停滞不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成各自独立的区带，并于离心管的底部被收集。凝胶过滤，即凝胶过滤层析：这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。当不同分子大小的蛋白质混合物流经凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构而被排阻在凝胶珠外，随溶剂在凝胶珠之间的空隙向下移动并最先流出柱外；比网孔小的分子能不同程度地自由出入凝胶珠的内外。这样由于不同大小的分子所经的路径不同而得到分离。利用溶解度差别的分离方法利用蛋白质的溶解度差别来分离各种蛋白质是实践中最常用的方法。影响蛋白质溶解度的因素很多，但在同一的特定外界条件下，不同蛋白质应具有不同的溶解度，因为溶解度归根结底取决于蛋白质本身的分子结构。适当地改变外界因素，就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度。等电点沉淀和pH控制：蛋白质是带有正电荷和负电荷的两性电解质，带电基团的电荷数量则因pH的不同而变化。当蛋白质处于等电点pH时，蛋白质的净电荷为零，以至于蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于集聚、沉淀，因此其溶解度达到最低点，由此可将蛋白质混合物彼此分开。如此沉淀出来的等电蛋白质保持着天然构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。蛋白质的盐溶和盐析：中性盐对球状蛋白质的溶解度有显著的影响。低浓度时，中性盐可增加蛋白质的溶解度－盐溶，其机理为蛋白质分子吸附某种盐离子后，带电表层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质与水分子间的相互作用却增强。当溶液的离子强度增加到一定数值时，蛋白质的溶解度开始下降，离子强度足够高时，很多蛋白质可从水溶液中沉淀出来－盐析。主要是大量的中性盐的加入，使水的活度降低，原来的大部分自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子间的相互作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。有机溶剂分级法：与水互溶的有机溶剂（如甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下，有机溶剂不仅能引起蛋白质沉淀，而且伴随着变性。若将溶剂冷却到－40C～－60C，然后在不断搅拌下逐滴加入有机溶剂以防局部浓度过高，变性问题可在很大程度上得以解决。在一定温度、pH和离子强度下，引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度会有差别，由此控制有机溶剂浓度也可以分离蛋白质。有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因有二，一是改变了介质的介电常数，即导致了两个相反电荷之间吸引力的变化；二是与蛋白质争夺水化水（同盐析现象类似），促使蛋白质集聚并沉淀。温度对蛋白质溶解度的影响：在一定的温度范围内（约0～40C之间），大部分球状蛋白的溶解度随温度的升高而增加，但也有例外。在40～50C以上，大部分蛋白质变得不稳定并开始变性，一般在中性pH介质中即失去溶解能力。根据携带电荷不同的分离方法根据蛋白质的电荷不同即酸碱性质不同分离蛋白质混合物的方法通常有两种电泳：在外电场的作用下，带电颗粒，如不处于等电状态的蛋白质分子，将向着与其电性相反的电极移动，这种现象被称为电泳或离子泳；或者说，电泳是在外电场存在下，利用分子携带的净电荷不同分离分子混合物的一种实验技术。带电颗粒在电场中的泳动速度主要决定于它所带的净电荷量以及颗粒的大小和形状。离子交换层析：这是一种用离子交换树脂（在蛋白质和核酸的分离中，常用离子交换纤维素和离子交换交联葡聚糖作为支持介质）作为支持剂的层析法。阴离子交换树脂含有碱性基团，可解离出OH－，能和溶液中的阴离子发生交换而使之结合在树脂上。在离子交换层析中，蛋白质对离子交换剂的结合力取决于彼此间相反电荷基团的静电吸引，而后者又于溶液的pH有关，因为pH决定离子交换剂和蛋白质的电离程度。蛋白质混合物的的分离可以由改变溶液中的盐离子强度和pH来完成，对离子交换剂结合力最小的蛋白质首先由层析柱中洗脱出来。蛋白质的选择吸附分离某些物质，如极性的硅胶和氧化铝以及非极性的活性炭等粉末具有吸附能力，能将其它种类的分子吸附在其粉末颗粒的表面，而吸附力的强弱又随被吸附的物质性质不同而异。吸附层析法就是利用这种吸附力的强弱不同而达到分离的目的。蛋白质分子与各种吸附剂结合的真实性被了解得很少：认为与非极性吸附剂作用可能主要是靠范德华力和疏水相互作用，而与极性吸附剂作用可能是离子吸引和（或）氢键键合。蛋白质提纯中使用最广泛和最有效的吸附剂是结晶磷酸钙[Ca10(PO4)6(OH)2]。具推测，蛋白质中带负电荷的基团与其的钙离子结合。根据对配基的生物学特异性的分离方法－亲和层析

这是分离蛋白质的一种极为有效的方法，是基于某种蛋白质所具有的生物学特异性，即它与另一种被称为配基的分子能特异而非共价地结合（有别于前面所讨论的各种分离方法，它们都是根据混合物中蛋白质间的化学和物理性质上的差别而达到分离的目的）。基本点为：先把待提纯的某一蛋白质的特异配基，通过适当的化学反应共价地连接到象琼脂糖凝胶一类载体表面的功能基上。当混合样品经过这种多糖材料的层析柱时，待提纯的蛋白质将于其特异的配体结合而吸附在配体的载体－琼脂糖颗粒的表面上，而其它的蛋白质，因对此配体不具有特异的结合位点，将通过柱子流出。被特异地结合在柱子上的蛋白质可用自由配体分子溶液洗脱下来。蛋白质的纯度分析蛋白质制品的纯度鉴定通常采用分辨率高的物理化学方法，如电泳分析、沉降分析和扩散分析等。如果制品是纯的，在这些分析的图谱上只呈现一个峰或一条带。必须指出，任何单独的一种鉴定只能认为是蛋白质分子均一性的必要条件而不是充分条件。遗传工程产品蛋白质的纯度是一个重要的指标，也是一个相对的指标，纯度要求需根据实际要求而制定。蛋白质的纯度一般指是否含有其它杂蛋白，而不包括盐、缓冲液离子、SDS等小分子在内。一些蛋白质在硫酸铵糊中相当安定，一些酶在甘油中保存则很稳定。而在遗传工程产品中．据中国生物制品检定所要求，却要考虑这些小分子的存在与否。蛋白质纯度如用百分数表示，有时还和检测、定量方法、所选用仪器的参数有关。如在HPLC分离蛋白质并分析纯度时，一般要求以280nm检测，这是蛋白质的吸收高峰，而很可能不是非蛋白质杂质的紫外吸收峰，小分子物质在该处甚至没有吸收，因此都以280nm的光吸收来定量，检测不到非蛋白质杂质和小分子物质的存在，显然所得的蛋白质纯度会偏高。在色谱中普遍采用积分面积的方法，这也不是很妥当的。而且在用微机或积分仪在线检出时，仪器的参数设置与所得的报告很有关系，设置不妥往往导致结果不够准确。目前常用的鉴定蛋白质纯度的方法有：PAGE和SDS、毛细管电泳(CE)、IEF和HPLC，其包括凝胶过滤、各种反相和离子色谱、疏水色谱等。按照严格的要求，用电泳法证明蛋白质的纯度，在一种pH下电泳说明该蛋白质是纯的，这是不够充分的。应该取二种pH，它们分布在蛋白质等电点的二侧，在这二种pH下电泳都证明此蛋白质是纯的，这样才可靠。一些新的有效方法也被引入分析蛋白质的纯度。如质谱等。特别是电喷雾质谱(ESI)的发展，只要pmol级的样品就能作一测定。此外也用一些化学法，例如观察蛋白质N端或C端是否均一，也是相当有效的方法，有时甚至比常用的HPLC更有效。比如有一个产品在HPLC中已是一对称的峰，但在蛋白质的N端分析中指出纯度可能还不到90％．有一定量的其他蛋白质存在。用末端分析法检查蛋白质的纯度，在国内目前还没有引起重视，其实在测N端序列的同时，应该也给出N端均一性(蛋白质纯度百分比)的数据。蛋白质的分子量测定蛋白质分子量的测定早期采用超离心分析法和光散射法，这需要较高级的专用仪器和较多量的蛋白质的样品，目前应用较少。可采用凝胶过滤法测定蛋白质的分子量。近年来由于解决了分离介质的刚性问题，有了HPLC的凝胶过滤系统，测定分子量只需一小时即可。但在一般实验室应用的常规方法是SDS－PAGE，这种方法误差约5～10％，但极为简便。凝胶过滤是测定完整蛋白质分子的分子量，而SDS－PAGE是测定蛋白质亚基的分子量，同时用这两种方法测定同一蛋白质分子量，可以方便地判断样品蛋白质是否寡聚蛋白质。更新方法是用毛细管电泳(凝胶或无胶筛分)测定蛋白质的分子量，仅需ng量，而且还可用积分仪或电脑在线精确定量。同时此法对蛋白质的分辨力和准确性比SDS方法为好。用SDS得到均一的区带，但在毛细管筛分电泳中可能为二个毗邻的峰，分子量有约1000的差异。80年代，质谱用于测定蛋白质分子量的代表是飞行时间（TOF，time-of-flight)质谱。近年来，高分辨力的磁质谱可精确测定分子量2000以下的多肽；最近由于电喷雾质谱(ESI)有了长足的发展，可以用于测定1～20万分子量的蛋白质，而且只需pmol量的蛋白质。背景介绍质谱（MassSPectrometry）是带电原子、分子或分子碎片按质荷比（或质量）的大小顺序排列的图谱。质谱仪是一类能使物质粒子高化成离子并通过适当的电场、磁场将它们按空间位置、时间先后或者轨道稳定与否实现质荷比分离，并检测强度后进行物质分析的仪器。质谱仪主要由分析系统、电学系统和真空系统组成。电喷雾质谱技术和基质辅助激光解吸附质谱技术是诞生于80年代末期的两项轨电离技术。这两项技术的出现使传统的主要用于小分子物质研究的质谱技术发生了革命性的变革。它们具有高灵敏度和高质量检测范围，使得在pmol（10-12）甚至fmol（10-15）的水平上准确地分析分子量高达几万到几十万的生物大分子成为可能，从而使质谱技术真正走入了生命科学的研究领域，并得到迅速的发展。质谱原理和仪器Howdoesamassspectrometerwork?电喷雾质谱技术电喷雾质谱技术（ElectrosprayIonizsationMassSpectrometry,ESI-MS）是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子，使质量电荷比（m/z）降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围，因而大大扩展了分子量的分析范围，离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电行数算出。基质辅助激光解吸附质谱技术基质辅助激光解吸附质谱技术（MatriXAssistedLaserDesorption/Ionization,MALDI）的基本原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相。MALDAI所产生的质谱图多为单电荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有一一对应关系。MALDI产生的离子常用飞行时间（Time-of-Flight,TOF）检测器来检测，理论上讲，只要飞行管的长度足够，TOF检测器可检测分子的质量数是没有上限的，因此MALDI-TOF质谱很适合对蛋白质、多肽、核酸和多糖等生物大分子的研究。TOFNCA法合成窄分子量分布的(嵌段)聚氨基酸ActivechainDeadchainMALDI-TOFofhomopolypeptide带NH2端基的聚氨基酸片段具有活性，可再次引发其它氨基酸的NCA开环而形成链结构明确的嵌段共聚氨基酸BLGunitAlaunitPBLG25-b-PAla11Mn=6319,PDI=1.10嵌段共聚氨基酸的MALDI-TOF图谱ab在水/空气界面诱导半球状方解石的生成在溶剂中聚集形成的微纤亲和层析亲和层析：分子间的专一性相互作用是所有生物学过程的基础，特别是蛋白质与特异结合组分之间（即酶与底物、激活剂和抑制剂、抗体与抗原以及某些蛋白质与DNA/RNA的特定区域或者受体与其相对应的效应分子如激素和递质等）的相互作用已相当明确。亲和层析技术即建立在此生物特异亲和性的基础之上。固定在层析介质骨架上的结合分子称为配体，要纯化的蛋白称为反配体或目的蛋白。目的蛋白通过它表面上的生物功能位点，特异并可逆地结合在固定的配体上。因此，利用蛋白质的特异结构，亲和层析可使大多数蛋白质纯化到接近单一的组分。一些特殊人工化合物，如蒽醌或偶氮染料，由于它们对多种不同的蛋白质如脱氢酶、激酶、转移酶、还原酶等都具有亲和性，因而能够成功地用作配体以纯化这些蛋白质。假亲和层析，也称假生物特异性亲和层析，是指人工配体与蛋白质特定基团之间的特异相互作用，在这个意义上，甚至也可以包括称为共价层析的配体，如硼酸衍生物和某些糖蛋白之间的共价结合。虽然人工配体与蛋白质的相互作用还没有搞清楚，但这类亲和层析已非常普遍。亲和层析(色谱)的基本原理亲和作用：静电作用氢键疏水性相互作用配位键弱共价键亲和吸附载体膜要求：具亲水性多孔结构，无非特异性吸附，比表面积大；物理和化学稳定性高；含有可活化的反应基团常用亲和作用体系抗原－单克隆抗体；核酸－互补碱性链段、核酸结合蛋白酶－底物、产物、抑制剂；免疫球蛋白－A蛋白、G蛋白凝集素－糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体；酶、蛋白质－肝素、活性色素、过渡金属离子（Cu2+Zn2+）氨基酸（组氨酸等）膜材料随着高分子材料以及成型加工工艺学的不断发展，为亲和膜分离技术提供了许多不同形状、不同化学组成的膜组件，如平板膜和中空纤维膜等。所用的基质膜材料主要分两大类：天然高分子材料，如纤维素及其衍生物；多糖类物质（葡聚糖、琼脂糖等）人工合成高分子材料，如聚乙烯（PE）、聚丙烯（PP）、聚砜、聚丙烯睛（PAN）、聚乙烯醇（PVA）、聚酰胺等。载体功能基团的活化方法：

载体分子结构要具有能与间隔臂和配位基进行化学反应的活性基团，或可以选用合适的活化试剂对载体基质进行化学改性。亲和介质的活化方法主要有：溴化氰法：利用含邻位羟基的介质与CNBr在碱性条件下反应环氧法：活化效率高（如表氯醇、双环氧基团）碳二亚胺（R1NCNR2）法：主要与介质的羧基反应对不耐碱的介质比较有利另外，羰基二咪唑法、三嗪活化法、戊二醛法、亚硫酰氯法等间隔臂：减弱生物大分子与亲和配基活性位接近时的空间位阻作用

商振华等发现在去除内毒素的实验中，当间隔臂长度增加2.28nm时，内毒素的去除率从未接间隔臂时的40％升至90％理想的间隔臂要求：合适的长度（太长则会封闭相邻的活性位而同样引起空间位阻），无活性吸附位，必须具有两个官能团，分别与基质和配基反应。常用：二胺类、多肽、氨基酸类等

亲和配基:酶的抑制剂抗体A蛋白凝集素（lectin）辅酶三嗪类色素过渡金属离子组氨酸肝素测定方法：

一般说来，单位质量介质上固载化配基含量越高、越均匀，纯化分离所得产品含量也越高。元素分析法光谱分析高效液相色谱法（HPLC）:测定固载化前后配基样品溶液浓度的改变来确定质上固载化配基的含量酸碱滴定法放射性标记和免疫测定法固定化金属螯合亲和层析（IMAC）和亲硫吸附层析（TAC）是假生物特异亲和层析的重要例子和应用固定化金属螯合亲和层析：这种高效纯化方法的基础是共价结合在层析载体上的金属离子螯合剂能与表面含有组氨酸残基的蛋白质相互作用。FractogelEMD是选用亚氨基二乙酸作为金属螯合配体，其两个齿状螯合部分在固定化后仍保持自由状态，因而各种金属离子就能结合到静止相上，而特殊的蛋白质或肽就能通过金属离子的自由配位位点结合上去。亚氨基二乙酸是以共价形式高密度地固定在连接臂上，从而保证了高度的亲水性、柔性和结合容量，使金属离子更容易结合在蛋白质表面的结合位点上，有利于络合物的形成，并使蛋白质十分牢固地结合在FractogelEMD螯合介质上。当然，蛋白质表面组氨酸残基的结合能力，对于结合蛋白质也十分重要。对肽来说，-氨基也能起到决定性的作用，即使没有组氨酸残基存在也能滞留多肽。也有报道认为，其它结合金属的氨基酸，如半胱氨酸和色氨酸也对蛋白质的螯合有作用。IMAC的优点:与真正的生物专一性亲和层析相比，IMAC操作更容易、更快速。IMAC除了广泛的用途和较低的价格外，还具有能与高盐浓度缓冲液相匹配的优点，所以从离子交换介质上收集下来含有高盐浓度的组分，可以直接上金属螯合亲和柱。在多数情况下，能避免在上柱前对样品进行更换缓冲液或透析等耗时操作。另外，不同的金属离子都能够络合到柱子上，这样相同的吸附剂就能产生不同的吸附选择性。一般来讲，结合蛋白质能力最强的是铜离子，其次是镍离子，而锌离子和钴离子结合力较弱。固定化金属螯合亲和层析实例IDA-Cu(II)柱上的肽层析图谱。将神经降压素、舒缓激肽、生长激素释放抑制因子、血管紧张素和铃蟾肽混合物上样于螯合有Cu(II)的IDA-FractogelEMD螯合柱。用0.02mol/LNaCl(pH7.0)的缓冲液平衡柱，洗柱之后用0.1mol/L磷酸钠，1mol/LNaCl(pH3.8)在流速为1mL/min下进行pH梯度洗脱。神经降压素(峰1)与柱不结合，在洗涤步骤中即被洗下；具有最强结合力的为含有组氨酸的铃蟾肽(峰4)和血管紧张素III(峰5)。含有丝氨酸的舒缓激肽(峰2)和生长激素释放抑制因子(峰3)表现出较弱的亲和力。亲硫吸附层析（TAC）亲硫吸附层析:这类高效的假生物特异性亲和层折是基于盐驱动吸附原理，将蛋白质（特别是抗体）吸附到含有砜基和硫醚基的杂脂肪族配体上。蛋白质的吸附作用主要是通过对色氨酸和苯丙氨酸残基的作用发生在抗体分子保守区中结构域上，因此，含有所谓亲硫区的蛋白质，如免疫球蛋白和含有芳香族氨基酸残基的肽最适于TAC纯化。由于白蛋白不能吸附在亲硫介质上，因而大大简化了从血清中高效分离抗体。根据最近的研究结果，采用亲硫吸附技术成功地实现了对大肠杆菌(E.coli)表达的重组单链抗体片段的有效纯化，用这种方法对其他在表面上带有亲硫区的蛋白质和肽的分离纯化结果也已有报道。TAC的优点：对于抗体的纯化来讲，TAC纯化的最大优点是配体的高化学稳定性，尤其是与其他生物特异性配体相比；TAC方法的另一优点是其与标准的蛋白纯化过程十分相配：经硫酸铵沉淀或离子交换步骤后，样品中残留的盐浓度只需调节(如通过电导测定)到使靶蛋白与柱结合的盐浓度。而且，各种不同来源的抗体蛋白和各种免疫球蛋白都与亲硫吸附剂结合。亲硫吸附层析的实例抗体在FractogelEMDTA650(S)上的亲硫吸附层析。将含有白蛋白和免疫球蛋白的混合样品上样FractogelTA柱，柱的大小为50mm10mm，用含有0.8mol/L硫酸铵的20mmol/L磷酸钠缓冲液(pH7.0)先平衡，用无硫酸铵的20mmol/L磷酸钠缓冲液B组成的递降硫酸铵梯度洗脱，流速为1ml/min。第一个峰为不结合的白蛋白组分，多克隆抗体可用递减的盐梯度进行洗脱。电泳电泳是指荷电的胶体颗粒在电场中通过介质的移动。在不同pH条件时带电荷状态会有不同：氨基酸中的羧基和氨基均是可解离基团，因此氨基酸可以形成两性离子蛋白质的净电荷是组成它的氨基酸残基的侧链基团上所有正、负电荷的总和，并取决于它所处环境的pH值。在低pH，蛋白质的净电荷为正，高pH，其为负；且离等电点越远，荷电越多。但蛋白质必定在某一pH值的溶液中其净电荷为零（滴定曲线与横坐标相交），此pH即为蛋白质的等电点pI。蛋白质的等电点仅决定于它的氨基酸组成，是一个物理化学常数。每一个蛋白质或多肽是由不同数目和比例的氨基酸组成的，因此蛋白质的等电点范围很宽。有一种酸性糖蛋白，它的pI低达1.8，而人胎盘溶菌酶的pI高达11.7。这样一个宽广的等电点范围使得可以利用它来进行蛋白质的分离和分析。而且蛋白质分子的大小，形状，活性免疫性能等也各不相同。根据蛋白质分子的这些物理化学特性便可以使用各种不同原理的电泳方法和介质来探求蛋白质分子的各种特性，如分子量，等电点，电荷分布，免疫行为，生化特性等。蛋白质的滴定曲线常规聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶已成为目前生化实验室最常用的支持介质。由于它的分子筛效应，提高了电泳分辨率，不仅能分离含有各种大分子物质的混合物，而且可以研究生物大分子的特性，诸如电荷、分子量、等电点以至于构象。常规聚丙烯酰胺凝胶电泳(conventionalPAGE，又称天然状态生物大分子聚丙烯酰胺凝胶电泳)是在恒定的，非解离的缓冲系统中来分离蛋白质，属于非解离电泳。在电泳过程中仍然保持蛋白质的天然构象、亚基之间的相互作用及其生物活性，因而根据其电泳迁移率，还可得到天然蛋白质的分子量。聚丙烯酰胺凝胶电泳具有以下三个优点：1)可以在天然状态分离生物大分子；2)可分析蛋白质和别的生物分子的混合物；3)电泳分离后仍然保持生物活性。使用聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质进行蛋白质的分离，在电泳过程中不仅取决于蛋白质的电荷数量，还取决于蛋白质的尺寸（电荷密度）和形状。在连续缓冲系统中，主要取决于电荷数量；在不连续缓冲系统中，由于介质的分子筛效应，后二者有较大影响。Nativepolyacrylamidegelelectrophoresis.Theproteinsamplesareloadedintothesamplewellsformedinthetopofthegel.Anelectricfieldisappliedacrossthegelfromtoptobottomandtheproteinsmigrateddownthroughthegel.Thesmallertheproteinandthegreateritsnetnegativecharge,thefurtheritwillmigrate.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质样品在100C用SDS和DTT处理3～5分钟后解聚成亚基在蛋白质样品和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质被解离成亚基且其电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。在SDS（蛋白质的变性剂和助溶剂）和DTT（二硫苏糖醇，破坏二硫键）的作用下，蛋白质分子被解聚。解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质－SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量。这就消除了不同分子之间原有的电荷差异。蛋白质－SDS胶束在水溶液中的形状像一个长椭圆棒。椭圆棒的短轴对不同的蛋白质亚基－SDS胶束基本上是相同的，约为18A，但长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比。因此这种胶束在SDS－聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或亚基分子量的大小。当蛋白质的分子量在15KD到200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。由此可见，SDS电泳不仅可以分离蛋白质，而且可以根据迁移率大小测定蛋白质亚基的分子量。蛋白质等电聚焦电泳蛋白质等电聚焦(isoelectricfocusing，IEF)技术在60年代后才得到迅速发展和推广应用，现在它已成为一种被广泛采用的蛋白质分析和制备技术。与常规电泳不同之处是在IEF时，蛋白质分子是在