《分子生物学》研究生课件核酸分子杂交(研究生)

核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)

核酸分子杂交是目前分子生物学和生物医学领域一项应用十分广泛的技术。根据核酸杂交探测靶分子的不同，核酸杂交分为：

1、Southernblot：检测经凝胶电泳分开的DNA分子,

需转印到膜上

2、Northernblot：检测经凝胶电泳分开的RNA分子，需转印到膜上

3、斑点杂交（dotblot)：检测未经分离的，固定在膜上的DNA或RNA分子

4、菌落或噬斑杂交(colony/plaqueblots):指检测固定在膜上的，经裂解后从细菌和噬菌体中释放的

DNA分子

5、原位杂交（insituhybridization):检测细胞或组织中的DNA或RNA分子。

第一节核酸分子杂交的基本原理核酸分子杂交是指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。在此过程中，核酸分子经历了变性和复性的变化。

探针（probe)：在杂交体系中带有标记的已知序列的DNA或RNA片段，通常先将待测的单链靶核酸固定在适当的载体上，然后置于含相应单链核酸探针的杂交反应体系中，通过碱基互补配对原则，形成双链结构，通过对标记探针的检测，可以判定待检测样品中相应序列的存在与否与分子量大小。

一、DNA变性与复性（denaturationand

renaturation)（一）变性：在理、化因素作用下（加热、酸碱或紫外线照射下），两条DNA链之间氢键断裂，变成两条单链。变性的本质：双链间氢键断裂。未影响共价键（磷酸二酯键）。变性常用的方法：

1、热变性

1）DNA分子中G=C含量越多，解链所需的温度就越高

2）DNA变性后理化性质改变黏度降低

A260升高增色效应

3）Hyperchromiceffect:DNA变性后，双螺旋结构解开，碱基暴露，对紫外光吸收增加的现象。

4）解链曲线：热变性过程中，将温度升高并以

O.D260作图，可得一“S”型曲线，即解链曲线可见DNA变性是在一个狭窄的温度范围内发生的突跃过程，类似晶体的融化，所以又称融解曲线（meltingcurve)5)融解温度（Tm）：DNA变性50%时的温度，多数在85-90度左右。

2酸碱变性：当核酸溶液的pH<3，或pH>10时，核酸变性,分子杂交中常用碱变性（0.5mol/LNaOH溶液）

3化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等可破坏氢键（二）复性：DNA的变性是可逆的，即两条互补的单链

DNA分子在变性条件去除后如条件适宜，

DNA可恢复其双螺旋结构。减色效应(hypochromiceffect)：伴随复性会出现

DNA溶液紫外光吸收降低的现象。

二影响杂交的因素

1、核酸分子的浓度和长度核酸浓度越大，碰撞几率越高，复性速度越快核酸分子越长，越难形成正确配对，复性速度越慢

2、温度温度不宜太低（少数碱基配对形成的局部双链能解离）温度也不宜太高（不能形成碱基配对）所以复性的最适温度是较Tm低25℃3、离子强度足以消除两条链P的静电斥力，常用0.15-0.5mol/LNaCl高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，所以进行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交液和洗膜液的高盐浓度。

4、杂交液的甲酰胺：甲酰胺能破坏氢键，降低核酸杂交的Tm

含30%-50%甲酰胺的杂交溶液温度能降低30-42℃5、核酸分子的复杂性：指DNA分子中不重复碱基的总量核酸分子的复杂性小（重复顺序多，分子量小），复性快

6、非特异性杂交反应：为减少非特异性杂交反应，在杂交前先进行预杂交封闭，以减少非特异性吸附。常用鲑鱼精子DNA

或高分子化合物

第二节核酸分子杂交的基本方法一

Southern印迹杂交

Southern印迹杂交是E.Southern于1975年创立的杂交方法，是指DNA与DNA的杂交，属固相杂交（一）待测核酸样品的制备

1、制备待测DNA

DNA酶、蛋白酶

细胞或组织裂解细胞DNA

酚/氯仿

2、DNA的限制酶消化选择一种或两种限制酶，对DNA进行部分或充分消化（二）待测DNA样品的电泳分离通常用0.8-1.0%琼脂糖凝胶进行电泳，对DNA片段进行分离。（三）凝胶中核酸的原位变性

DNA样品在制备和电泳过程中始终保持双链结构电泳后必须将DNA片段变性并转移到适当的固相支持物上，才能进行Southern印迹杂交原位变性琼脂糖凝胶电泳后将凝胶浸入1.5mol/LNaCl、

中和

0.5mol/LNaOH中，室温30’用Tris-HCL、

Nacl溶液中和转膜（四）Southern转膜将凝胶中的DNA片段转移到固相支持物上。常用的固相支持物：化学活化膜、硝酸纤维素膜（NC膜），尼龙膜，

Southern转膜的方法：

1、毛细管虹吸法：利用高盐转移缓冲液的推动作用和虹吸作用

2、电转印法：利用电泳作用将凝胶中的DNA转移到膜上适用于转移大片段DNA3、真空转移：原理同毛细管虹吸，需真空泵(3)真空转移法：真空转移法可在转膜的同时进行DNA的变性和中和，一般先用变性液转移15～30分钟，然后换用中和液转移15～30分钟，整个过程只需30分钟至1小时左右。但应注意两个问题：①真空压力不能太大，若压力过大，凝胶被压缩，转移效率会降低；②真空转移仪要密封严，防止漏气影响压力的产生。（五）探针的制备核素或非核素标记的探针（六）

Southern预杂交和杂交预杂交的目的：将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭预杂交液：不含探针的杂交液，其中含鲑鱼精子DNA（该

DNA与哺乳动物的DNA同源性低，不会与探针杂交）、聚乙烯吡咯烷酮，牛血清白蛋白等大分子物质。杂交：含有探针，通常在相对高离子强度的缓冲盐溶液中杂交过夜，杂交液按50μl/cm2加入

（七）洗膜目的：洗去未结合的、游离的放射性探针及可能非特异性结合的DNA

方法：将薄膜先高盐后低盐溶液进行漂洗（八）杂交结果的检测—放射自显影将薄膜与X-光胶片接触，暴光1—7天，显影、定影，即可在

X光片上见到清晰的黑色条带二Northern印迹杂交（一）类似于Southernblot的测定RNA分子的杂交技术称为

Northernblot（二）与Southernblot的主要区别：在变性剂存在下，以琼脂

糖电泳分离RNA（变性剂的作用是防止RNA分子形成发夹结构，维持其单链线性状态）（三）常用变性剂：乙二醛、甲醛、甲基氢氧化汞（四）转膜：电泳结束后，不需要再进行变性和中和，直接转膜三斑点及狭缝印迹杂交将DNA或RNA变性后直接点样于NC膜优点：简单、快速、可在同一张膜上进行多个样品的检测缺点：不能鉴别所检测核酸的分子量，且特异性不高四原位杂交（insituhybridization）

核酸保持在细胞或组织中，经适当的方法处理细胞或组织后将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交。原位杂交不需要从组织或细胞中提取核酸，能完整的保持组织与细胞的形态。

细胞内原位杂交杂交反应在载玻片上进行组织切片原位杂交原位杂交的步骤：

1、组织或细胞的固定用10%甲醛、4%多聚甲醛、乙醇：冰乙酸（3：1）等将组织或细胞固定在载玻片上

2、杂交前的预处理目的：降解核酸表面的蛋白，提高探针的穿透力方法：蛋白酶、去垢剂（TritonX-100、SDS）

注意：蛋白酶不能含有核酸酶消化时间不宜过长、否则会导致细胞结构的破坏、脱片

3、探针的选择核素标记探针：DNA、RNA、寡核苷酸探针均可非核素标记

4、杂交取10-20μL杂交液滴在预处理过的玻片上，盖上硅化盖玻片排除气泡，用液体石蜡或胶泥封片，以防杂交液流失。

5、杂交结果检测：同位素：放射自显影生物素或地高辛配基标记的探针：显色反应五液相杂交液相杂交是指待测核酸分子与核酸探针都存在于杂交液中碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子第三节探针的标记一探针的种类（一）cDNA探针：经RT-PCR可制备大量的cDNA探针

cDNA探针是目前应用最广泛的一种探针（二）基因组DNA探针：此类探针来源于染色体DNA，一般是从G-文库中获取或利用PCR扩增基因组中某特定片段（三）寡核苷酸探针：根据已知的核酸序列，人工合成一定长度的寡核苷酸片段（20-50个碱基的单链）作为探针（四）RNA探针：较少应用，可从细胞中直接提取RNA或以目的基因为模板，转录合成出高放射性的RNA探针二、标记物（一）核素标记物（放射性同位素）：灵敏度高，常用

32P,35S,3H,125I,14C（二）非核素标记物：灵敏度低，但无放射性污染，探针标记后可长期保存（2年以上），常用生物素、地高辛、辣根过氧化物酶（HRP）、荧光素（FITC、罗丹明类）、化学发光剂三、标记方法主要介绍DNA探针的体外酶促标记法（一）缺口平移法（nicktranslation）

1、利用DNase

Ⅰ在DNA双链上随机切割，造成单链缺口

2、缺口处一个5’-末端，一个3’-末端，3’-OH可作为引物，在DNApolⅠ的催化下，按5’3’方向合成新的DNA单链

3、DNApolⅠ的5’3’外切酶活性在切口处将旧链5’-端逐步切除，新合成链不断合成，因为新合成链的底物是带标记的*dNTP,从而使原DNA分子上的部分核苷酸被标记的核苷酸所取代

（二）随机引物法（randomprimer）

随机引物是人工合成的长度为6个核苷酸残基的寡聚核苷酸的混合物，对于任意一个DNA片段，随机引物混合物中都含有

一些核苷酸片段与之结合，起到引物的作用。以带标记的

*dNTP

为底物，合成带有标记的探针（三）PCR标记法在PCR反应底物中，将一种

dNTP换成带标记的*dNTP（四）末端标记法只标记DNA的5’-端或3’-端，而非DNA全长，标记活性低四探针的纯化（一）乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，而dNTP等小分子物质则留在上清中，所以用无水乙醇沉淀2-3次即可达到纯化的目的。此法由于操作简便，一般常被用来纯化探针。

（二）

SephadexG-50柱层析法：利用

SephadexG-50凝胶的分子筛作用，将DNA探针与

dNTP等小分子物质分离。（大分子探针随着流动相流出，而小分子物质则滞留在凝胶层

析柱中。SephadexG-50层析柱的柱床不宜过大，以防第一峰体积过大，影响杂交液的配制。如果体积过大，可用乙醇沉淀