双抗体夹心一步半法检测乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)实验设计

双抗体夹心一步半法检测乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)【技术背景】目前检测HBsAg的技术有：①两位点一步法：可出现钩状效应，待测抗原浓度过高出现假低值或假阴性；②两步法：无钩状效应；③一步半法：减少钩状效应。本实验所采用的方法为一步半法，此法是基于抗原抗体特异性反应的原理，因此对于所检测的抗原其对应的抗体是特异性的此法用于乙肝表面抗原是比较准确的。【病人准备】服用任何对检测结果有影响的药物。【标本的采集与保存】血清：采用正确医用技术采集静脉血2ml，待血液自然完全凝固后，2000-3000转/分离心10分钟，取新鲜血清用于检测。血浆：用抗凝血浆管（EDTA盐、肝素之一作抗凝剂）采集静脉血3000-3500转10分钟，取新鲜血浆用于检测。血清样品：5天内测定，可以放置于4℃；超过一周，-80℃保存2.实验前准备用前三十分钟从冰箱中取出的试剂盒和待测标本，平衡至室温18-2℃；将恒温箱或恒温水箱调至反应温度。【原理】将抗HBs的单克隆抗体（简称单抗）或多克隆抗体（简称多抗）板等固相载体上，加人待测血清和酶标记抗体（抗HBs-HR，血清中HBsAg与微孔板上（抗HBs-HBsAg-HBs-HRP复合物中的HRP（A高低）HBsAgHBsAg的有无及相对含量。显色为阳性，不显色为阴性。【试剂与器材】试剂 抗HBs包被的微孔板HBsAg阳性对照HBsAg阴性对照酶标试剂浓缩洗液、显色剂A、显色剂、终止剂、封板膜器材 加样枪（20μ50μL-25μ、恒温设备（恒温水浴箱或恒温箱、洗板机酶标仪、吸水纸、消毒缸要求：a）酶标仪在450nm和492nm的波长不精密度应在≤1%，分别在449nm-451nm491nm-493nm之间，吸光度值）要求可以测到小数点后两位；b）100μl50μl%99-101μL49.5μL-50.5μL之间；c）恒温系统在37℃、43℃的温度变异应成±1℃。【操作方法】编号将微孔板按序编号。每批实验应设阴性对照3孔、阳性对照2孔、空白对照1孔，其余为待测血清孔孔。加样品稀释液：每孔加入样品稀释液20μL或一滴，空白孔不加。加样：在待测血清孔、阴性对照孔和阳性对照孔中加入相应血清匀。37。50μL或1匀。37。将浓缩洗涤液用新鲜蒸馏水或去离子水稀释20倍后备用。5次，每次都要在吸水纸上尽量拍干或用洗板机洗涤5次，最后一次尽量扣干。A和显色剂B50μL1。比色测定：每孔加终止剂450nm，次波长630nm，10min内测定各孔吸光度（A）值【结果判定】1．临界值Cutoff（CO）的计算：CO=阴性对照孔A均值×2.1（阴性对照孔A值低于0.05者，按0.05，高于0.05按实际A值计算计算）2.计算S/CO比值（S为样品A值）阳性结果：样品A值≥CO值或S/CO1为HBsAg阳性阴性结果：样品ACO值或S/CO1为HBsAg阴性有效性判断：阴性对照孔A值≤0.1，阳性对照孔A值≥0.8。否则试验无效。【质量控制】室内质量控制血清的两个浓度值分别为：1ng/ml、2ng/ml，均购自卫生部临床检验中心，每批次试验加入两个水平质控血清各一孔，同其他待测样本一同记录S/CO值。一、分析前质量控制1、标本采集：规范操作意识；防止溶血；要正确使用抗凝剂和真空采血管；2、标本处理：及时分离血清或血浆；高危标本应注明；标本闭光、应专人运送。二、分析中质量控制1、试剂、校准品和耗材必须取得国家相关部门的批文，在有效期内正确使用，妥善保藏，质检;2、选购高质量、有批文的仪器设备，要正确使用、定期检查、维护和保养，使其在最佳状态下运转；3、实验室内检测结果比对：一个实验室对同一项目用不同方法，试剂，仪器，或在不同地点进行检测，需对不同方法，试剂，仪器，不同地点的检测结果进行比对；4、严格规范操作程序：HBsAg测定项目和仪器应有SOP，并严格遵守；参考区间等性能进行核实、确认和评价；6、对于脂血、溶血标本应采取一定措施，做室内质控和室间质控；7、室内质控应连续每天监测，且试验时带质控物随标本一起测定，并对质控结果进行分析判断。三、检验后质量控制1、检验结果的审核和发放：评价HBsAg的测定结果与检验对象的符合性；根据检验结检验结果的真实性和可靠性；判断标本的检验结果是否可靠，检验报告是否可发出。量评价。【影响因素与注意事项】混合血清、血浆或其他体液样本，特殊检材的要求及结果判断见其具体要求。37℃孵育1.5～2时，2000RPM5分钟，分离血清。③采用含有分离胶和促凝剂的试管采集的血液样本，采集后在37℃孵育0.5～1小时，2000RPM以上离心5分钟，分离血清。④不使用任何热处理过的标本，严重溶血或脂血标本不能使用。高浓度RF、高胆红素、溶血、高脂等标本可能干扰实验，应避免使用。⑤.存放：样本于2-8℃可储存一周；样本长期储存应放置于-20℃或-20℃以下环境中，且不宜反复冻融。试剂切勿混用或互换。HBsAg定处理所使用组分及样品。读数为准。洗板结束后，必须立即进行下一步，不可使酶标板孔干燥。封板膜不能重复使用显色