第3章荧光分析法课件

第3章荧光分析法3.1概述3.2荧光光谱的基本原理3.3定量分析方法3.4荧光分析技术及应用第3章荧光分析法3.1概述13.1概述荧光和磷光的发展简史基本概念3.1概述荧光和磷光的发展简史216世纪：在矿物和植物提取液中发现荧光；1575年：Monardes-植物愈创木切片黄色水溶液-天蓝色荧光；1852年：Stokes阐明荧光发射机制(奎宁和叶绿素的荧光)；1905年：Wood发现气体分子的共振荧光；1926年:Gaviola直接测定了荧光寿命；1923年：荧光X射线光谱；1964年：原子荧光光谱分析的建立；1965年：荧光分析在生物分析中广泛应用；15世纪:磷光被发现(重晶石在强烈阳光下的发光)1944年：Lewis提出磷光用于分析的可能性；1957年：Keirs将磷光分析用于定量分析及多组分混合物分析；1963年：广泛用于血液及尿液中痕量药物及农药残留量分析。3.1概述>>

3.1.1荧光和磷光的发展简史16世纪：在矿物和植物提取液中发现荧光；3.1概述>>

333.1概述>>

3.1.2.基本概念处于基态的分子吸收能量被激发至激发态，然后从不稳定的激发态释放能量返回至基态。如果通过碰撞以热能或动能的形式释放能量回到基态，称为无辐射跃迁；如果是以辐射(发射光子)的形式回到基态，此种现象称为光致发光。常见的光致发光包括荧光和磷光。荧光光谱法：基于化合物的荧光测量而建立起来的分析方法，称为荧光光谱法。特点：灵敏度高，检测限通常在ppb级(荧光10-7-10-9mg/mL)；发光参数多，可进行动力学分析；分析线性范围比吸收光谱法宽；选择性比吸收光谱法好。3.1概述>>

3.1.2.基本概念处于基态的分子吸收能量43.2基本原理3.2.1分子荧光光谱的产生3.2.2激发光谱和发射光谱3.2.3发光参数3.2.4影响物质发光的因素3.2基本原理3.2.1分子荧光光谱的产生53.2基本原理>>

3.2.1分子荧光光谱的产生分子能级与电子能级的多重态荧光和磷光的产生3.2基本原理>>

3.2.1分子荧光光谱的产生分子能级63.2基本原理>>

3.2.1分子荧光光谱的产生分子能级与电子能级的多重态基态：处于基态的分子，由于成对电子填充在能量最低的各轨道中，能量最低最稳定，所处的能态称为基线单重态(图示A状态)。单重态：当基态一对电子中的一个被激发到较高能级，其自旋方向不会立刻改变，分子仍处于单重态—激发单重态(图示B状态)。三重态：如果某电子在跃迁过程中，发生自旋方向改变，则分子具有两个自旋不配对、自旋方向平行的电子，即分子处于激发三重态。激发三重态能量比激发单重态略低(图示C状态)。3.2基本原理>>

3.2.1分子荧光光谱的产生分子能级与7光吸收过程失活过程发光失活分子间能量转移失活非辐射失活荧光磷光振动驰豫内转换外转换系间窜跃3.2基本原理>>3.2.1分子荧光光谱的产生>>

2.荧光和磷光的产生光吸收过程失活过程发光失活分子间能量转移失活非辐射失活荧光磷8复习电磁波谱：光的波粒二象性γ射线X射线紫外光可见光红外光微波无线电波λ/nm

0.01104007605×1058×105MHz

波长频率短高长低3.2基本原理>>3.2.1分子荧光光谱的产生>>

2.荧光和磷光的产生复习电磁波谱：光的波粒二象性γ射线X射线紫外光可见光红外光微9吸收荧光磷光激发单重态激发三重态内转换振动驰豫系间窜跃振动驰豫外转换基态3.2基本原理>>3.2.1分子荧光光谱的产生>>

2.荧光和磷光的产生吸收荧光磷光激发单重态激发三重态内转换振动驰豫系间窜跃振动驰103.2基本原理>>3.2.1分子荧光光谱的产生>>

2.荧光和磷光的产生辐射跃迁－发光失活荧光：激发态分子从第一激发单线态S1的最低振动能级回到基态S0所发出的辐射。磷光：激发态分子从第一激发三重态T1的最低振动能级回到基态S0所发出的辐射。波长关系：激发光＜荧光＜磷光。3.2基本原理>>3.2.1分子荧光光谱的产生>>

2.113.2基本原理>>3.2.1分子荧光光谱的产生>>

2.荧光和磷光的产生无辐射失活振动弛豫：激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级转至较低振动能级的过程，其效率较高内转换：当两个电子能级非常接近以致其振动能级有重叠时，电子由高能级回到低能级的过程。外转换：激发态分子与溶剂、溶质分子之间发生相互碰撞而失去能量的过程。系间窜越：激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多重态发生变化的过程。3.2基本原理>>3.2.1分子荧光光谱的产生>>

2.12任何荧光化合物都具有激发光谱(吸收光谱)和发射光谱(荧光或磷光光谱)两种特征光谱3.2基本原理>>

3.2.2激发光谱和发射光谱任何荧光化合物都具有激发光谱(吸收光谱)和发射光谱(荧光或磷133.2基本原理>>

3.2.2激发光谱和发射光谱激发光谱和发射光谱具有三个特点：⑴斯托克斯位移，波长：荧光＞激发光；⑵荧光光谱和激发光谱大致成镜像对称；⑶荧光发射光谱的形状与激发光波长无关。图11-3蒽的激发光谱和荧光光谱3.2基本原理>>

3.2.2激发光谱和发射光谱激发光143.2基本原理>>

3.2.2激发光谱和发射光谱图11-4蒽(乙醇)的激发光谱和不同激发波长下的荧光发射光谱/nm3.2基本原理>>

3.2.2激发光谱和发射光谱图11153.2基本原理>>

3.2.3发光参数荧光寿命(τf)：除去激发光源后，分子的荧光强度降低到激发时最大荧光强度的一半所需的时间称为荧光寿命(10-8∼10-10s)。荧光物质受到一个极短时间的脉冲光激发后，荧光强度从激发态到基态的变化，可用指数衰减定律表示：Ft=F0e-Kt。F0、Ft

：开始时和t时的荧光强度，K为衰减常数。荧光产率()：又称为荧光量子产率、荧光效率。3.2基本原理>>

3.2.3发光参数荧光寿命(τf)163.2基本原理>>

3.2.4影响物质发光的因素1.内部因素：分子结构对荧光效率的影响2.外部因素：外界条件对荧光效率的影响3.2基本原理>>

3.2.4影响物质发光的因素1.内17内部因素：分子结构对荧光效率的影响。物质分子有强的紫外吸收和一定的荧光产率是发射荧光的两个必备条件。分子结构中有π→π﹡跃迁（K带强吸收）或n→π﹡跃迁（R带弱吸收）。⑴长共轭结构：分子中必须具有大的共轭π键结构。共轭度越大，发射波长长移，发光强度增加。⑵分子的刚性和共平面性：具有刚性平面性结构的分子荧光量子产率高。⑶取代基的影响：给电子取代基使荧光强度增大；而吸电子取代基则使荧光强度降低。3.2基本原理>>

3.2.4影响物质发光的因素>>1.内部因素内部因素：分子结构对荧光效率的影响。物质分子有强的紫外吸收和183.2基本原理>>

3.2.4影响物质发光的因素>>1.内部因素长共轭结构示例苯205/278/0.11萘286/321/0.29蒽356/404/0.36维生素Aλex＝327nm；λem＝510nm3.2基本原理>>

3.2.4影响物质发光的因素>>1193.2基本原理>>

3.2.4影响物质发光的因素>>1.内部因素刚性和共平面结构示例形成络合物后，如果分子的刚性和共平面性增强，可使荧光增强。联苯f＝0.2芴f＝1.08-羟基喹啉8-羟基喹啉镁3.2基本原理>>

3.2.4影响物质发光的因素>>1203.2基本原理>>

3.2.4影响物质发光的因素>>1.内部因素空间位阻使分子共平面性下降，荧光减弱。顺反异构体：反式分子有荧光，而顺式分子没有荧光(位阻原因)。例如：1，2－二苯乙烯反式有强烈荧光，而顺式无荧光。①1-二甲胺基萘-7-磺酸盐②1-二甲胺基萘-8-磺酸盐f＝0.75f＝0.033.2基本原理>>

3.2.4影响物质发光的因素>>1213.2基本原理>>

3.2.4影响物质发光的因素>>1.内部因素取代基作用第一类取代基是给电子基团，能增加分子的电子共轭程度，使荧光效率提高，荧光波长长移。如：－NH2、－OH、－OCH3、－NHR、－CN等。第二类取代基是吸电子基团，会妨碍分子的电子共轭性，使荧光减弱甚至熄灭。如：－COOH、－NO2、－CO、－NO、－SH、－NHCOCH3、－X(卤素原子序数↑，荧光效率↓)等。第三类取代基对电子共轭体系作用较小，对荧光的影响不明显。如：－R、－SO3H、－NH3＋等。3.2基本原理>>

3.2.4影响物质发光的因素>>122表苯环上取代基对荧光的影响化合物分子式λF/nm相对荧光强度苯C6H6270-31010甲苯C6H5CH3270-32017丙基苯C6H5C3H7270-32017氟代苯C6H5F270-32010氯代苯C6H5Cl275-3457溴代苯C6H5Br290-3805碘代苯C6H5I-0苯酚C6H5OH285-36518苯酚阴离子C6H5O-310-40010甲氧基苯C6H5OCH3285-34520苯胺C6H5NH2310-40520苯胺正离子C6H5NH3+-0苯甲酸C6H5COOH310-3903腈基苯C6H5CN280-36020硝基苯C6H5NO2-0表苯环上取代基对荧光的影响化合物分子式λF/nm相对荧光强23外部因素：外界条件对荧光强度的影响⑴温度的影响：温度降低会使荧光强度增大；温度升高荧光强度减小。⑵溶剂的影响：溶剂极性增加有时会使荧光强度增加，荧光波长长移；溶剂的黏度减小，荧光强度减弱。⑶pH的影响：对于弱酸或弱碱性荧光物质，溶液的pH值改变，影响其解离平衡，使荧光强度发生变化。⑷荧光熄灭的影响：荧光物质与荧光熄灭剂相互作用，引起荧光强度降低。⑸散射光的干扰：瑞利光和拉曼光。3.2基本原理>>

3.2.4影响物质发光的因素>>2.外部因素外部因素：外界条件对荧光强度的影响3.2基本原理>>

3243.2基本原理>>

3.2.4影响物质发光的因素>>2.外部因素pH值影响荧光强度示例

pH值：<27～12>13存在形式：离子分子离子有无荧光：无蓝色荧光无3.2基本原理>>

3.2.4影响物质发光的因素>>2253.2基本原理>>

3.2.4影响物质发光的因素>>2.外部因素熄灭剂：卤素离子、重金属离子、溶解氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物。瑞利光(Reyleighscatteringlight)：光子与分子发生弹性碰撞时，仅改变光子运动方向，不发生能量交换，这种散射光称为瑞利光。特点：波长与入射光相同。拉曼光(Ramanscatteringlight)：光子与物质分子发生非弹性碰撞时，不仅改变光子运动方向，而且发生能量交换，这种散射光称为拉曼光。特点：当光子失去部分能量时，波长比入射光长，干扰最大；当光子多得到部分能量时，波长比入射光短。消除方法：选择适当的激发光波长可消除拉曼光干扰。3.2基本原理>>

3.2.4影响物质发光的因素>>2263.2基本原理>>

3.2.4影响物质发光的因素>>2.外部因素例如：硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光光谱和散射光谱3.2基本原理>>

3.2.4影响物质发光的因素>>227320448448360320350400350激发350nm硫酸奎宁激发320nm硫酸奎宁激发350nm0.1mol/LH2SO4激发320nm0.1mol/LH2SO4强度(a)强度(b)λ/nmλ/nmλ/nmλ/nm图11-6硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光光谱和散射光谱3.2基本原理>>

3.2.4影响物质发光的因素>>2.外部因素320448448360320350400350激发350n283.3定量分析方法3.3.1荧光强度与浓度的关系3.3.2定量分析方法3.3定量分析方法3.3.1荧光强度与浓度的关系29荧光是物质吸收光子之后发出的光，荧光强度(F)与荧光物质吸收光的程度以及发射荧光的能力有关。测试荧光的方向与激发光入射方向垂直，吸收池是四面透光的。荧光分析定量依据：荧光强度F与浓度c成线性关系。3.3定量分析方法>>

3.3.1荧光强度与浓度的关系荧光是物质吸收光子之后发出的光，荧光强度(F)与荧光物质吸收30标准曲线法用已知量的标准物质经过和试样相同的处理之后，配制一系列标准溶液，测定该标准系列的荧光强度，绘制F(纵)-c(横)标准曲线，然后在同样条件下测定试样溶液的荧光强度，从标准曲线求出待测荧光物质的含量。比例法若标准曲线通过原点，在线性范围内可采用比例法(只需1个标准溶液)；若标准曲线不通过原点，则应扣除空白溶液的荧光强度后再计算：多组分混合物的荧光分析3.3定量分析方法>>

3.3.2定量分析方法标准曲线法用已知量的标准物质经过和试样相同的处理之后，配制313.4荧光分析技术及应用3.4.1荧光仪器简介3.4.2应用与示例3.4.3荧光分析技术3.4荧光分析技术及应用3.4.1荧光仪器简介32荧光分光光度计方框图光源第一单色器第二单色器检测器放大记录器I0IF样品吸收池1．光电荧光计：基本淘汰。2．荧光分光光度计：能绘制激发光谱和荧光光谱。第一单色器(激发单色器)选择激发光波长(＞250nm)第二单色器(荧光单色器)与激发光入射方向垂直，选择荧光波长，可提高方法的选择性和准确度。3.4荧光分析技术及应用>>

3.4.1荧光仪器简介荧光分光光度计方框图光源第一第二检测器放大I0IF样品1．光33图11－8荧光仪器的光路示意图A光电荧光计第一滤光片第二滤光片电表光电管样品池狭缝汞弧灯样品池检测器光源B荧光分光光度计3.4荧光分析技术及应用>>

3.4.1荧光仪器简介图11－8荧光仪器的光路示意图A光电荧光计第一滤光片343.4荧光分析技术及应用>>

3.4.2应用与示例1.无机化合物的荧光分析荧光法灵敏度高、选择性好，可用于痕量分析，但是能发生荧光的化学体系不多，这是荧光法的应用特点。无机物通过与荧光试剂(如下图)作用生成荧光螯合物而进行荧光分析，非过渡金属离子的荧光螯合物较多，荧光试剂具有两个(或以上)与MZ+形成螯合物的电子给予体官能团的芳香结构。参阅P291.表11－2无机离子的荧光测定法。能引起荧光熄灭(猝灭)化合物，可用荧光猝灭法测定。SO3NaN=NOHHOON8-羟基喹啉石榴茜素R3.4荧光分析技术及应用>>

3.4.2应用与示例1353.4荧光分析技术及应用>>

3.4.2应用与示例2.有机化合物的荧光分析(1)荧光胺(2)邻苯二甲醛(3)丹酰氯荧光胺及其水解产物不显荧光荧光胺与脂肪族或芳香族伯胺类形成的衍生物有高强度荧光3.4荧光分析技术及应用>>

3.4.2应用与示例236

3.4荧光分析技术及应用>>

3.4.4荧光分析新技术1.时间分辨荧光分析2.同步荧光分析3.胶束增敏荧光分析4.磷光分析法5.化学发光和生物发光分析(课后阅读教材)3.4荧光分析技术及应用>>

3.4.4荧光分37课后作业思考题：1、2(课后复习)、3(第一问)习题：2、3课后作业思考题：1、2(课后复习)、3(第一问)38第3章荧光分析法3.1概述3.2荧光光谱的基本原理3.3定量分析方法3.4荧光分析技术及应用第3章荧光分析法3.1概述393.1概述荧光和磷光的发展简史基本概念3.1概述荧光和磷光的发展简史4016世纪：在矿物和植物提取液中发现荧光；1575年：Monardes-植物愈创木切片黄色水溶液-天蓝色荧光；1852年：Stokes阐明荧光发射机制(奎宁和叶绿素的荧光)；1905年：Wood发现气体分子的共振荧光；1926年:Gaviola直接测定了荧光寿命；1923年：荧光X射线光谱；1964年：原子荧光光谱分析的建立；1965年：荧光分析在生物分析中广泛应用；15世纪:磷光被发现(重晶石在强烈阳光下的发光)1944年：Lewis提出磷光用于分析的可能性；1957年：Keirs将磷光分析用于定量分析及多组分混合物分析；1963年：广泛用于血液及尿液中痕量药物及农药残留量分析。3.1概述>>

3.1.1荧光和磷光的发展简史16世纪：在矿物和植物提取液中发现荧光；3.1概述>>

3413.1概述>>

3.1.2.基本概念处于基态的分子吸收能量被激发至激发态，然后从不稳定的激发态释放能量返回至基态。如果通过碰撞以热能或动能的形式释放能量回到基态，称为无辐射跃迁；如果是以辐射(发射光子)的形式回到基态，此种现象称为光致发光。常见的光致发光包括荧光和磷光。荧光光谱法：基于化合物的荧光测量而建立起来的分析方法，称为荧光光谱法。特点：灵敏度高，检测限通常在ppb级(荧光10-7-10-9mg/mL)；发光参数多，可进行动力学分析；分析线性范围比吸收光谱法宽；选择性比吸收光谱法好。3.1概述>>

3.1.2.基本概念处于基态的分子吸收能量423.2基本原理3.2.1分子荧光光谱的产生3.2.2激发光谱和发射光谱3.2.3发光参数3.2.4影响物质发光的因素3.2基本原理3.2.1分子荧光光谱的产生433.2基本原理>>

3.2.1分子荧光光谱的产生分子能级与电子能级的多重态荧光和磷光的产生3.2基本原理>>

3.2.1分子荧光光谱的产生分子能级443.2基本原理>>

3.2.1分子荧光光谱的产生分子能级与电子能级的多重态基态：处于基态的分子，由于成对电子填充在能量最低的各轨道中，能量最低最稳定，所处的能态称为基线单重态(图示A状态)。单重态：当基态一对电子中的一个被激发到较高能级，其自旋方向不会立刻改变，分子仍处于单重态—激发单重态(图示B状态)。三重态：如果某电子在跃迁过程中，发生自旋方向改变，则分子具有两个自旋不配对、自旋方向平行的电子，即分子处于激发三重态。激发三重态能量比激发单重态略低(图示C状态)。3.2基本原理>>

3.2.1分子荧光光谱的产生分子能级与45光吸收过程失活过程发光失活分子间能量转移失活非辐射失活荧光磷光振动驰豫内转换外转换系间窜跃3.2基本原理>>3.2.1分子荧光光谱的产生>>

2.荧光和磷光的产生光吸收过程失活过程发光失活分子间能量转移失活非辐射失活荧光磷46复习电磁波谱：光的波粒二象性γ射线X射线紫外光可见光红外光微波无线电波λ/nm

0.01104007605×1058×105MHz

波长频率短高长低3.2基本原理>>3.2.1分子荧光光谱的产生>>

2.荧光和磷光的产生复习电磁波谱：光的波粒二象性γ射线X射线紫外光可见光红外光微47吸收荧光磷光激发单重态激发三重态内转换振动驰豫系间窜跃振动驰豫外转换基态3.2基本原理>>3.2.1分子荧光光谱的产生>>

2.荧光和磷光的产生吸收荧光磷光激发单重态激发三重态内转换振动驰豫系间窜跃振动驰483.2基本原理>>3.2.1分子荧光光谱的产生>>

2.荧光和磷光的产生辐射跃迁－发光失活荧光：激发态分子从第一激发单线态S1的最低振动能级回到基态S0所发出的辐射。磷光：激发态分子从第一激发三重态T1的最低振动能级回到基态S0所发出的辐射。波长关系：激发光＜荧光＜磷光。3.2基本原理>>3.2.1分子荧光光谱的产生>>

2.493.2基本原理>>3.2.1分子荧光光谱的产生>>

2.荧光和磷光的产生无辐射失活振动弛豫：激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级转至较低振动能级的过程，其效率较高内转换：当两个电子能级非常接近以致其振动能级有重叠时，电子由高能级回到低能级的过程。外转换：激发态分子与溶剂、溶质分子之间发生相互碰撞而失去能量的过程。系间窜越：激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多重态发生变化的过程。3.2基本原理>>3.2.1分子荧光光谱的产生>>

2.50任何荧光化合物都具有激发光谱(吸收光谱)和发射光谱(荧光或磷光光谱)两种特征光谱3.2基本原理>>

3.2.2激发光谱和发射光谱任何荧光化合物都具有激发光谱(吸收光谱)和发射光谱(荧光或磷513.2基本原理>>

3.2.2激发光谱和发射光谱激发光谱和发射光谱具有三个特点：⑴斯托克斯位移，波长：荧光＞激发光；⑵荧光光谱和激发光谱大致成镜像对称；⑶荧光发射光谱的形状与激发光波长无关。图11-3蒽的激发光谱和荧光光谱3.2基本原理>>

3.2.2激发光谱和发射光谱激发光523.2基本原理>>

3.2.2激发光谱和发射光谱图11-4蒽(乙醇)的激发光谱和不同激发波长下的荧光发射光谱/nm3.2基本原理>>

3.2.2激发光谱和发射光谱图11533.2基本原理>>

3.2.3发光参数荧光寿命(τf)：除去激发光源后，分子的荧光强度降低到激发时最大荧光强度的一半所需的时间称为荧光寿命(10-8∼10-10s)。荧光物质受到一个极短时间的脉冲光激发后，荧光强度从激发态到基态的变化，可用指数衰减定律表示：Ft=F0e-Kt。F0、Ft

：开始时和t时的荧光强度，K为衰减常数。荧光产率()：又称为荧光量子产率、荧光效率。3.2基本原理>>

3.2.3发光参数荧光寿命(τf)543.2基本原理>>

3.2.4影响物质发光的因素1.内部因素：分子结构对荧光效率的影响2.外部因素：外界条件对荧光效率的影响3.2基本原理>>

3.2.4影响物质发光的因素1.内55内部因素：分子结构对荧光效率的影响。物质分子有强的紫外吸收和一定的荧光产率是发射荧光的两个必备条件。分子结构中有π→π﹡跃迁（K带强吸收）或n→π﹡跃迁（R带弱吸收）。⑴长共轭结构：分子中必须具有大的共轭π键结构。共轭度越大，发射波长长移，发光强度增加。⑵分子的刚性和共平面性：具有刚性平面性结构的分子荧光量子产率高。⑶取代基的影响：给电子取代基使荧光强度增大；而吸电子取代基则使荧光强度降低。3.2基本原理>>

3.2.4影响物质发光的因素>>1.内部因素内部因素：分子结构对荧光效率的影响。物质分子有强的紫外吸收和563.2基本原理>>

3.2.4影响物质发光的因素>>1.内部因素长共轭结构示例苯205/278/0.11萘286/321/0.29蒽356/404/0.36维生素Aλex＝327nm；λem＝510nm3.2基本原理>>

3.2.4影响物质发光的因素>>1573.2基本原理>>

3.2.4影响物质发光的因素>>1.内部因素刚性和共平面结构示例形成络合物后，如果分子的刚性和共平面性增强，可使荧光增强。联苯f＝0.2芴f＝1.08-羟基喹啉8-羟基喹啉镁3.2基本原理>>

3.2.4影响物质发光的因素>>1583.2基本原理>>

3.2.4影响物质发光的因素>>1.内部因素空间位阻使分子共平面性下降，荧光减弱。顺反异构体：反式分子有荧光，而顺式分子没有荧光(位阻原因)。例如：1，2－二苯乙烯反式有强烈荧光，而顺式无荧光。①1-二甲胺基萘-7-磺酸盐②1-二甲胺基萘-8-磺酸盐f＝0.75f＝0.033.2基本原理>>

3.2.4影响物质发光的因素>>1593.2基本原理>>

3.2.4影响物质发光的因素>>1.内部因素取代基作用第一类取代基是给电子基团，能增加分子的电子共轭程度，使荧光效率提高，荧光波长长移。如：－NH2、－OH、－OCH3、－NHR、－CN等。第二类取代基是吸电子基团，会妨碍分子的电子共轭性，使荧光减弱甚至熄灭。如：－COOH、－NO2、－CO、－NO、－SH、－NHCOCH3、－X(卤素原子序数↑，荧光效率↓)等。第三类取代基对电子共轭体系作用较小，对荧光的影响不明显。如：－R、－SO3H、－NH3＋等。3.2基本原理>>

3.2.4影响物质发光的因素>>160表苯环上取代基对荧光的影响化合物分子式λF/nm相对荧光强度苯C6H6270-31010甲苯C6H5CH3270-32017丙基苯C6H5C3H7270-32017氟代苯C6H5F270-32010氯代苯C6H5Cl275-3457溴代苯C6H5Br290-3805碘代苯C6H5I-0苯酚C6H5OH285-36518苯酚阴离子C6H5O-310-40010甲氧基苯C6H5OCH3285-34520苯胺C6H5NH2310-40520苯胺正离子C6H5NH3+-0苯甲酸C6H5COOH310-3903腈基苯C6H5CN280-36020硝基苯C6H5NO2-0表苯环上取代基对荧光的影响化合物分子式λF/nm相对荧光强61外部因素：外界条件对荧光强度的影响⑴温度的影响：温度降低会使荧光强度增大；温度升高荧光强度减小。⑵溶剂的影响：溶剂极性增加有时会使荧光强度增加，荧光波长长移；溶剂的黏度减小，荧光强度减弱。⑶pH的影响：对于弱酸或弱碱性荧光物质，溶液的pH值改变，影响其解离平衡，使荧光强度发生变化。⑷荧光熄灭的影响：荧光物质与荧光熄灭剂相互作用，引起荧光强度降低。⑸散射光的干扰：瑞利光和拉曼光。3.2基本原理>>

3.2.4影响物质发光的因素>>2.外部因素外部因素：外界条件对荧光强度的影响3.2基本原理>>

3623.2基本原理>>

3.2.4影响物质发光的因素>>2.外部因素pH值影响荧光强度示例

pH值：<27～12>13存在形式：离子分子离子有无荧光：无蓝色荧光无3.2基本原理>>

3.2.4影响物质发光的因素>>2633.2基本原理>>

3.2.4影响物质发光的因素>>2.外部因素熄灭剂：卤素离子、重金属离子、溶解氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物。瑞利光(Reyleighscatteringlight)：光子与分子发生弹性碰撞时，仅改变光子运动方向，不发生能量交换，这种散射光称为瑞利光。特点：波长与入射光相同。拉曼光(Ramanscatteringlight)：光子与物质分子发生非弹性碰撞时，不仅改变光子运动方向，而且发生能量交换，这种散射光称为拉曼光。特点：当光子失去部分能量时，波长比入射光长，干扰最大；当光子多得到部分能量时，波长比入射光短。消除方法：选择适当的激发光波长可消除拉曼光干扰。3.2基本原理>>

3.2.4影响物质发光的因素>>2643.2基本原理>>

3.2.4影响物质发光的因素>>2.外部因素例如：硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光光谱和散射光谱3.2基本原理>>

3.2.4影响物质发光的因素>>265320448448360320350400350激发350nm硫酸奎宁激发320nm硫酸奎宁激发350nm0.1mol/LH2SO4激发320nm0.1mol/LH2SO4强度(a)强度(b)λ/nmλ/nmλ/nmλ/nm图11-6硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光光谱和散射光谱3.2基本原理>>

3.2.4影响物质发光的因素>>2.外部因素320448448360320350400350激发350n663.3定量分析方法3.3.1荧光强度与浓度的关系3.3.2定量分析方法3.3定量分析方法3.3.1荧光强度与浓度的关系67荧光是物质吸收光子之后发出的光，荧光强度(F)与荧光物质吸收光的程度以及发射荧光的能力有关。测试荧光的方向与激