生物技术常用技术技术及应用

关于生物技术常用技术技术及应用第一页，共一百零八页，2022年，8月28日一、PCR的用途体外扩增特异DNA片段的技术，能快速、特异地扩增目的DNA片段。能通过试管内的数小时反应将特定的DNA片段扩增数百万倍。迅速获取大量的单一核酸片段，为分子生物学研究提供了强大的工具。第二页，共一百零八页，2022年，8月28日1953年，Watson和Crick提出DNA双螺旋结构及半保留复制模型。1958年，Meselson和Stahl用实验证实DNA半保留复制模型。70年代以来，人们采用两种思路去尝试建立基因的无性繁殖体系，一是基因克隆技术，二是体外扩增技术。二、发展历程第三页，共一百零八页，2022年，8月28日1971年，Khorana（美国MIT教授，1968年诺贝尔医学奖得主）：“经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。”核酸体外扩增最早设想被遗忘原因:（1）很难进行测序和合成寡核苷酸引物；（2）1970年Smith等发现了II型限制性内切酶，体外克隆基因已成为可能。第四页，共一百零八页，2022年，8月28日1976年，台籍科学家钱嘉韵（AliceChien）从黄石国家公园的嗜热菌Thermusaquaticus中分离出热稳定的TaqDNA聚合酶。1985年，美国Cetus公司人类遗传研究室的Mullis发明聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction，PCR），Saiki等首次应用PCR法成功地扩增了人-珠蛋白的DNA，并应用于镰刀状红细胞贫血的产前诊断。第五页，共一百零八页，2022年，8月28日1988年Saiki开始将耐热性TaqDNA聚合酶应用于PCR，整个反应只加一次酶即可，扩增特异性和效率都明显改善，操作大为简化。1989年被誉为“分子年”，列PCR为十余项发明之首。1993年，Mullis荣获诺贝尔化学奖。

KaryMullis1993第六页，共一百零八页，2022年，8月28日三、PCR的基本原理试管中进行的DNA复制反应，依据DNA半保留复制的机理；体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性质；通过人为控制体外合成系统的温度，使双链DNA变成单链，单链DNA与人工合成的引物退火，DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。第七页，共一百零八页，2022年，8月28日待扩增片段第八页，共一百零八页，2022年，8月28日第九页，共一百零八页，2022年，8月28日高温变性第十页，共一百零八页，2022年，8月28日低温退火第十一页，共一百零八页，2022年，8月28日中温延伸第十二页，共一百零八页，2022年，8月28日第十三页，共一百零八页，2022年，8月28日第十四页，共一百零八页，2022年，8月28日第十五页，共一百零八页，2022年，8月28日第十六页，共一百零八页，2022年，8月28日第十七页，共一百零八页，2022年，8月28日第十八页，共一百零八页，2022年，8月28日第十九页，共一百零八页，2022年，8月28日第二十页，共一百零八页，2022年，8月28日第二十一页，共一百零八页，2022年，8月28日PCR每一步的转换通过温度的改变控制。DNA模板解链（变性）、引物与模板结合（退火）、DNA聚合酶催化新生DNA的合成（延伸）三个步骤构成PCR反应的一个循环。此循环反复进行，可使目的DNA得以迅速扩增。第二十二页，共一百零八页，2022年，8月28日理论扩增率：2n递增（n为循环次数），25～30循环，目标DNA可增加109倍。实际扩增率：(１＋Ｘ)n，X为PCR的实际扩增率，平均约为75%。由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，扩增产物的增加，逐渐由指数形式变为线性形式，所以实际上进行30个循环后，扩增倍数一般可达106～107。以上“变性、退火、延伸”三部曲为PCR一轮循环。第二十三页，共一百零八页，2022年，8月28日PCR扩增曲线第二十四页，共一百零八页，2022年，8月28日必须的仪器设备第二十五页，共一百零八页，2022年，8月28日四、PCR反应体系与流程反应体系模板（DNA或RNA）引物TaqDNA聚合酶10×PCR缓冲液1.5～4

mM

Mg2+0.2

mM

dNTP反应流程预变性变性退火延伸延伸完全终止25～35循环第二十六页，共一百零八页，2022年，8月28日（一）PCR的反应体系引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）dNTP模板（template）Mg2+（magnesium）第二十七页，共一百零八页，2022年，8月28日1、引物引物：决定PCR反应的特异性PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增第二十八页，共一百零八页，2022年，8月28日基本原则是最大限度地提高扩增效率和特异性，同时尽可能抑制非特异性扩增。引物设计的原则第二十九页，共一百零八页，2022年，8月28日①引物长度：15-30bp，常用20bp左右—引物的有效长度不能大于38bp，否则最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74℃），不能保证PCR扩增产物的特异性②引物扩增跨度：以500bp为宜—特定条件下可扩增长至10kb的片段第三十页，共一百零八页，2022年，8月28日③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜

—G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带

—ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列，尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因为这样会使引物在G+C富集区引发错误延伸④避免引物内部出现二级结构和引物间互补

—特别避免3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带第三十一页，共一百零八页，2022年，8月28日第三十二页，共一百零八页，2022年，8月28日⑤引物3’端的碱基要求严格配对（不能做任何修饰）—特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败⑥引物5′端可修饰

—引物5′端限定着PCR产物的长度，但对扩增特异性影响不大；引物5′端碱基可不与模板DNA

互补而呈游离状态；引物5′端最多可加10个碱基而对PCR反应无影响

第三十三页，共一百零八页，2022年，8月28日3’5’3’5’限制性内切酶的识别序列启动子序列定点突变探针标记第三十四页，共一百零八页，2022年，8月28日⑦引物的特异性：—引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性⑧引物量：—每条引物的浓度0.1~0.5μM，以最低引物量产生所需要的结果为好—引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会第三十五页，共一百零八页，2022年，8月28日2、酶及其浓度目前有两种TaqDNA聚合酶供应天然酶：从水生嗜热杆菌中提纯基因工程酶：大肠杆菌合成一个典型的PCR反应约需酶量1-2.5U/100ul体系浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少第三十六页，共一百零八页，2022年，8月28日DNA聚合酶

Klenow片段

T4DNA聚合酶

TaqDNA聚合酶（应用最广）其他DNA聚合酶：TthDNA聚合酶

VentDNA聚合酶

PfuDNA聚合酶等第三十七页，共一百零八页，2022年，8月28日Taq酶的保真性不高5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，无3’→5’外切活性;在PCR反应中如发生某些碱基的错配，该酶是没有校正功能的。保真性不如PfuDNA聚合酶等。第三十八页，共一百零八页，2022年，8月28日3、dNTP的质量与浓度在PCR反应中，dNTP应为50～200μM，浓度过低会降低PCR产物的产量注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制）,如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配高浓度的dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性

第三十九页，共一百零八页，2022年，8月28日4、模板DNA模板DNA的来源：

—微生物中提取DNA—从细胞中提取DNA：血细胞、绒毛、尿样、毛发、精斑、口腔上皮细胞

—固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K消化模板DNA的浓度：0.1～2ug/100ul体系

—PCR产量随模板DNA浓度的增加而显著升高

—模板DNA浓度过高导致非特异性产物增加

第四十页，共一百零八页，2022年，8月28日5、Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少第四十一页，共一百零八页，2022年，8月28日PCRAgarosegelelectrophoresis产物分析UV检测3-4hours（二）、PCR的反应流程第四十二页，共一百零八页，2022年，8月28日温度与时间的设置循环次数常见问题第四十三页，共一百零八页，2022年，8月28日1、温度与时间的设置设置变性-退火-延伸三个温度点标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃退火，然后快速升温至70～75℃延伸，对于较短靶基因（长度100～300bp）可采用二温度点法，将退火与延伸温度合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸。第四十四页，共一百零八页，2022年，8月28日①变性温度与时间：一般93℃～94℃，1min足以使模板变性若低于93℃则需延长时间但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。第四十五页，共一百零八页，2022年，8月28日②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的重要因素退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃作为选择最适退火温度的起点较为理想第四十六页，共一百零八页，2022年，8月28日引物的复性温度

通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm（解链温度）＝4(G+C)+2(A+T)复性温度=Tm值－（5～10℃）在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性复性时间一般为30～60s，足以使引物与模板之间完全结合第四十七页，共一百零八页，2022年，8月28日③延伸温度与时间：TaqDNA聚合酶的生物学活性：

70～80℃150核苷酸/S/酶分子

70℃60核苷酸/S/酶分子

55℃24核苷酸/S/酶分子

高于90℃时，DNA合成几乎不能进行第四十八页，共一百零八页，2022年，8月28日③延伸温度与时间：延伸温度：一般选择在70～75℃之间常用温度为72℃过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够）3～4kb的靶序列需3～4min扩增10kb需延伸至15min延伸时间过长会导致非特异性扩增对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些第四十九页，共一百零八页，2022年，8月28日2、循环次数循环次数决定PCR扩增程度循环次数主要取决于模板DNA的浓度循环次数：选在30～40次之间循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多第五十页，共一百零八页，2022年，8月28日如何提高PCR中的DNA聚合酶的保真性？在PCR反应体系中，除使用TaqDNA聚合酶，掺入少量的具有3′→5′外切酶活性的耐热DNA聚合酶，如Pfu，Vent，Pwo等，错配率可降为原来的1/10；Mg2+浓度尽可能低，但不影响DNA合成；减少高温反应时间，这样DNA热损伤将减少；减少循环数。第五十一页，共一百零八页，2022年，8月28日如何提高PCR扩增的特异性？升高退火温度可增加引物与模板结合的特异性；缩短退火和延伸时间，可减少错误引发及多余的DNA聚合酶分子参与酶促延伸的机会；降低引物和酶的浓度也可以减少错误引发，尤其是能减少引物二聚体的引发；改变Mg2+的浓度可进一步提高扩增的特异性。第五十二页，共一百零八页，2022年，8月28日引物设计的特异性；减少循环次数；热启动（HotStart）。即首先将模板变性，然后在较高温度时加入TaqDNA聚合酶、引物及MgCl2等一些重要成分，这样使得引物在较高温度下与模板退火，提高了反应的严谨性，使扩增更特异；采用二对引物即外引物和内引物进行扩增来提高扩增的特异性。第五十三页，共一百零八页，2022年，8月28日（三）、PCR扩增产物的检测方法

凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法PCR-限制性片段长度多态性分析法（PCR-RFLP）单链构型多态性分析法（PCR-SSCP）核酸探针杂交法PCR产物测序PCR-OLA（PCR-oligonucleotideligationassay)荧光PCR

第五十四页，共一百零八页，2022年，8月28日1.琼脂糖凝胶电泳

制胶加样电泳紫外光检测第五十五页，共一百零八页，2022年，8月28日特点：分辨力高，长度仅相差1bp的DNA分子即可分开；上样量远大于琼脂糖凝胶；回收的DNA纯度高；采用银染色DNA或RNA，灵敏度高，比琼脂糖凝胶电泳中EB染色法高2-5倍，而且避免EB易退色的弱点。用途：PCR扩增指纹图、多重PCR、PCR产物限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析。2.聚丙烯酰胺凝胶电泳第五十六页，共一百零八页，2022年，8月28日3.PCR-RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphism)

据目的基因序列可查出所包含的酶切位点，用相应的限制性核酸内切酶消化PCR扩增产物，然后进行电泳，观察消化片段的大小是否与序列资料相符。用途：传染病病原体基因分型人类基因的变异性研究。第五十七页，共一百零八页，2022年，8月28日4.单链构型多态性分析法

（PCR-SingleStrandConformationPolymorphism,PCR-SSCP）

将PCR产物双链DNA（dsDNA）变性为单链DNA（ssDNA），加样于变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，由于DNA分子在凝胶中的电泳迁移率与其分子量和空间结构有关，而空间结构又与ssDNA序列有关。因此，电泳结束后，ssDNA带位置的差异即可反映出PCR产物序列的差异。第五十八页，共一百零八页，2022年，8月28日

5.核酸探针杂交法

点杂交反向点杂交微孔板杂交Southern印迹杂交第五十九页，共一百零八页，2022年，8月28日

①点杂交（dotblot）原理：将扩增产物变性后直接点在尼龙膜或硝酸纤维素膜上，再用放射性或非放射性标记物标记的寡核苷酸探针与之杂交。探针：放射性同位素标记探针检测的敏感、特异，具有不稳定性和放射性危害。非放射性物质（如生物素、地高辛、荧光素等）标记的探针稳定性高、使用安全、检测速度快用途：主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。第六十页，共一百零八页，2022年，8月28日

②反向点杂交(reversedotblot)原理：使用带有标记物的引物进行PCR扩增，然后将扩增产物变性。将不同的寡核酸探针固定在尼龙膜上，用变性的PCR产物与之杂交。探针：严格设计，具有相同的杂交反应条件。用途：反向点杂交特别适用于遗传性疾病多个位点的点突变分析。结果分析：正常纯合子突变纯合子杂合子第六十一页，共一百零八页，2022年，8月28日

③微孔板杂交(microplatehybridization)

夹心杂交第六十二页，共一百零八页，2022年，8月28日

④荧光探针杂交法

目前临床上常用荧光探针法来检测PCR产物，主要的方法有TaqMan技术、分子信标技术、复合探针法等。（定量PCR详述）。第六十三页，共一百零八页，2022年，8月28日

⑤Southern印迹杂交(Southernblot)

第六十四页，共一百零八页，2022年，8月28日

6.PCR-ELISA引物双标记：生物素/地高辛、荧光素引物5’端标记生物素+RNA探针标记地高辛将一寡核酸探针固定于微孔板作为捕获探针，变性的PCR产物单链的某一区域与之杂交后，此单链间接地固定于微孔板上。再用一非放射性标记物标记（如生物素）的检测探针与固定于微孔板的PCR产物单链的另一区域杂交。第六十五页，共一百零八页，2022年，8月28日7.PCR产物测序

方法：双脱氧核苷酸链末端终止法化学裂解法用途：目前一般多用于科研第六十六页，共一百零八页，2022年，8月28日五、PCR常见问题无扩增产物非特异性扩增拖尾假阳性第六十七页，共一百零八页，2022年，8月28日PCR常见问题之一无扩增产物模板:含有抑制物，含量低Buffer对样品不合适引物设计不当或者发生降解反应条件：退火温度太高，延伸时间太短

原因对策纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量更换Buffer或调整浓度重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物降低退火温度、延长延伸时间现象：正对照(marker?)有条带，而样品则无；第六十八页，共一百零八页，2022年，8月28日PCR常见问题之二

非特异性扩增现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。第六十九页，共一百零八页，2022年，8月28日PCR常见问题之二引物特异性差模板或引物浓度过高酶量过多Mg2+浓度偏高退火温度偏低循环次数过多

原因对策重新设计引物或者使用巢式PCR适当降低模板或引物浓度适当减少酶量降低镁离子浓度适当提高退火温度或使用二阶段温度法减少循环次数

非特异性扩增第七十页，共一百零八页，2022年，8月28日PCR常见问题之三

拖尾(与非特异性扩增条带明显不同，非特异性扩增带有明显的条带分隔。)现象：产物在凝胶上呈Smear状态。

M12第七十一页，共一百零八页，2022年，8月28日PCR常见问题之三模板不纯Buffer不合适退火温度偏低酶量过多dNTP、Mg2+浓度偏高循环次数过多

原因对策纯化模板更换Buffer适当提高退火温度适量用酶适当降低dNTP和镁离子的浓度减少循环次数

拖尾第七十二页，共一百零八页，2022年，8月28日PCR常见问题之四

假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况)原因：靶序列或扩增产物的交叉污染打开标本管盖时样品飞溅，造成样品间相互污染。使用带有污染的试剂。公用试剂如液体石蜡等污染。操作时手套引起的交叉污染。加样器通道易形成气溶胶，气溶胶常带有PCR产物污染，可用有滤筛的吸头避免此类污染。实验室污染。

现象：空白对照出现目的扩增产物第七十三页，共一百零八页，2022年，8月28日

对策：PCR前后工序分室操作，试剂器材分室存放低温贮存。除酶及不能耐高温的物质外，凡耐高温的试剂器材均高压灭菌。Tip头、Eppendorf管等最好一次性使用。操作人员必须戴手套进行操作。试剂小量分装保存，用前先离心，操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外防止开盖时液体溅出。第七十四页，共一百零八页，2022年，8月28日引物二聚体

两个相同的或不同的引物分子之间有较多的碱基配对，特别是引物3’端有互补区。引物模板比例太高，可增加模板用量。退火温度过低。热循环次数过多。PCR常见问题之五第七十五页，共一百零八页，2022年，8月28日9.7PCR技术的发展

巢式PCR（nestedPCR）逆转录PCR（reversetranscription-PCR，RT-PCR）多重PCR(multiplexPCR)重组PCR(recombinantPCR)锚定PCR（anchoredPCR,A-PCR）不对称PCR（asymmetricPCR）反向PCR（inversePCR）扩增长片段PCR（longPCR，long-distancePCR）免疫PCR(immuno-PCR)定量PCR六、PCR技术的主要类型第七十六页，共一百零八页，2022年，8月28日（1）巢式PCR（nestedPCR）第七十七页，共一百零八页，2022年，8月28日（2）逆转录RT-PCR（reversetranscription-PCR）原理：先在逆转录酶的作用下、以mRNA为模板合成互补的cDNA（complementaryDNA），再以cDNA为模板进行PCR反应。是一种快速、简便、敏感性极高的检测mRNA表达的方法。第七十八页，共一百零八页，2022年，8月28日逆转录酶：AMV逆转录酶（最适温度为42℃）和MoMLV逆转录酶（最适温度为37℃）逆转录引物：①随机引物；②Oligo(dT)；③特异性引物。one-stepRT-PCR：在同一体系中加入逆转录酶、逆转录引物、TaqDNA聚合酶、PCR引物、dNTP和缓冲液，直接以mRNA

为模板进行逆转录和PCR扩增，称为一步法RT-PCR。第七十九页，共一百零八页，2022年，8月28日（3）多重PCR(multiplexPCR)

第八十页，共一百零八页，2022年，8月28日（4）重组PCR(recombinantPCR)第八十一页，共一百零八页，2022年，8月28日（5）锚定PCR（anchoredPCR,A-PCR）

基本原理：抽提细胞总RNA或mRNA，在逆转录酶作用下合成cDNA，通过DNA末端转移酶在cDNA3’端加上poly(dG)尾。据此设计锚定引物poly(dC)，为提高扩增特异性，poly(dC)在十二聚以上，锚定引物5’端可加上某些限制性内切酶识别序列或其它序列信息。根据已知的3’端序列设计基因特异性引物，与锚定引物一起进行PCR扩增。用途：检测T细胞受体和免疫球蛋白基因的多态性。第八十二页，共一百零八页，2022年，8月28日（6）不对称PCR（asymmetricPCR）

基本原理：采用两条不同浓度的引物，即非限制引物(高浓度引物)与限制性引物(低浓度引物)，二者之比为50-100：1。在PCR最初10-15个循环中，扩增产物主要是双链DNA(dsDNA)；第15个循环以后，限制性引物已被耗尽，非限制性引物介导的PCR就会产生大量的单链DNA(ssDNA)。关键：控制限制性引物的绝对量，需多次摸索优化两条引物的比例。也有人先用等浓度的引物PCR扩增，制备双链DNA；然后以双链DNA为模板，再以其中的一条引物进行第二次PCR，制备单链DNA。第八十三页，共一百零八页，2022年，8月28日（7）反向PCR（reversePCR）反向PCR用于快速扩增已知序列以外的未知DNA片段，从而对未知序进行分析研究。该法首先用已知序列和待扩增序列都没有切点的限制性核酸内切酶将模板DNA消化，再用连接酶使酶切产物环化，使已知的和待扩增的未知序列都包含在环中。在已知序列内设计一对反向的引物，即可扩增已知序列以外的区域。第八十四页，共一百零八页，2022年，8月28日反向PCR已知序列PCR用途：未知序列的研究限制酶切点（X）限制酶切点（X）限制酶X酶切连接未知序列第八十五页，共一百零八页，2022年，8月28日（8）扩增长片段PCR（longPCR）

模板完整性：应用琼脂糖包埋细胞抽提法模板DNA。引物：一般较长（22-35nt），Tm值较大。DNA聚合酶：长片段PCR应采用错配率低的耐热DNA聚合酶：如AmpliTaq、rTth、HotTube、Vent、DeenVent、Pfu、rTma等。Vent、DeenVent、Pfu、rTma等聚合酶有3’-5’外切酶活性。PCR缓冲液：增加Tris的浓度或改用Tricine缓冲液以增强缓冲能力，并使缓冲液pH适度升高，以补偿升温时pH值的降低。此外，加入适量的甘油、DMSO（二甲亚砜）、明胶、聚乙二醇、Tween20等物质，有助于模板变性和维持DNA聚合酶的稳定。热循环：增加延伸时间（一般1kb/min），提高退火温度，同时采用热启动。热循环后期，更应适当增加延伸时间，以保证产物充分延伸。第八十六页，共一百零八页，2022年，8月28日（9）免疫PCR(immuno-PCR)第八十七页，共一百零八页，2022年，8月28日（10）原位PCR（insituPCR）

直接法：使用标记（放射性同位素、生物素、地高辛、荧光素等）的引物或脱氧三磷酸核苷酸（如dUTP）进行PCR扩增，则标记物掺入到PCR产物中。最后用放射自显影、免疫组化或荧光法检测PCR产物及其在细胞内位置。间接法：先进行细胞内DNA的原位扩增，然后用标记的核酸探针进行原位杂交。原位逆转录PCR（insitureversetransciptionPCR）第八十八页，共一百零八页，2022年，8月28日第八十九页，共一百零八页，2022年，8月28日（11）定量RT-PCR（qRT-PCR）：利用RT-PCR对mRNA水平进行半定量或绝对定量分析。第九十页，共一百零八页，2022年，8月28日半定量RT-PCR选用在组织中普遍表达、表达量比较恒定的管家基因mRNA作为内源性基因模板标准。管家基因mRNA和目的mRNA混合物共同进行逆转录，在各自的引物引导下扩增。计算出扩增后目的基因扩增子/管家基因扩增子的比值，从而达到半定量的目的。第九十一页，共一百零八页，2022年，8月28日实时荧光定量PCR常规定量PCR技术：

—对PCR扩增反应的终产物进行定量

—重复性差

—半定量实时定量PCR技术：对PCR扩增反应中每一个循环的产物进行定量

第九十二页，共一百零八页，2022年，8月28日实时荧光定量PCR原理在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。第九十三页，共一百零八页，2022年，8月28日（1）Ct值是荧光定量PCR的一个重要的概念，C代表Cycle，t代表threshold域值。含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。第九十四页，共一百零八页，2022年，8月28日（2）荧光域值（threshold）的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号荧光域值是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold