生物材料的预处理和液固分离

关于生物材料的预处理和液固分离第一页，共四十一页，2022年，8月28日生物活性物质来源动物植物微生物组织、器官、细胞及代谢产物存在方式：胞内和胞外第一节生物材料的预处理第二页，共四十一页，2022年，8月28日一确定预处理方法的依据1生物活性物质存在方式与特点生物活性物质存在部位与它的生物活性密切相关生物活性物质来源、存在状态“胞内”、“胞外”、前体生物材料中的化学组成十分复杂生物活性物质在生物材料中含量较低，杂质含量高，而且生理活性愈高的成分，含量往往愈低如胰岛素在胰脏中的含量为0.02%，胆汁中胆红素含量为0.05~0.08%生物活性物质的存在方式与其生物功能密切相关，一般情况下，可以根据活性物质的生物功能推断其存在部位和分布方式第三页，共四十一页，2022年，8月28日可被材料中酶、微生物破坏，还可能受酸、碱、盐、重金属离子、机械搅拌、温度、甚至空气和光线作用改变活性2后续工艺要求3目的物稳定性经过预处理和固－液分离后，一般要求得到滤液澄清、pH适中、有一定浓度的目的生物活性物质如后续采用离子交换方法处理，则对滤液中无机离子、灰分含量、澄清度方面要求较高；如采用溶剂萃取，则要求蛋白质含量较低，以减轻乳化现象；如采用结晶方法，则还需要经过脱色处理第四页，共四十一页，2022年，8月28日绞肉机将事先切成小块的组织绞碎形成组织糜许多蛋白和酶可以从颗粒较粗的组织糜中提取出来一般情况下：先用粗孔径的绞，再用细孔径的绞，有时可能还需要多次进行用绞肉机，一般细胞并不破碎，一些胞内产物不能有效地提取，须通过特殊的匀浆才行实验室常用玻璃匀浆器和组织捣碎器，工业上可用高压匀浆器二动物材料的预处理第五页，共四十一页，2022年，8月28日（一）预处理的目的三发酵液（细胞培养液）的预处理2去除发酵液（培养液）中部分杂质以利于后续各步操作1改变发酵液（培养液）的物理性质，以利于固-液分离主要方法有：加热、凝聚与絮凝、使用助滤剂培养液中主要含有2类物质：可溶性胶状物质

无机盐类可溶性胶状物质：核酸、杂蛋白、不溶性多糖，这些杂质不仅使培养液粘度增加，液固分离速度受影响，而且还会影响后续的分离纯化操作无机盐类：不仅影响成品质量，而且在采用离子交换法提取时，由于树脂大量吸附无机离子而减少对目的物的交换第六页，共四十一页，2022年，8月28日加热是最简单和经济的预处理方法，即把发酵液（培养液）加热到所需温度并保温适当时间。加热能使杂蛋白变性凝固，从而降低发酵液（培养液）的粘度，使固液分离变得容易。但加热的方法只适合对热稳定的生物活性物质

（二）细胞及蛋白质的处理1变性沉淀蛋白变性的其它方法：大幅度改变pH，加有机溶剂（丙酮、乙醇等）、重金属盐（如Ag＋、Cu2＋、Pb2＋等）和表面活性剂天然蛋白质分子受到某些物理的或化学的因素影响时生物活性丧失、溶解度降低、不对称性增高以及其他的一些物理化学常数发生变化，这个过程就称为变性作用第七页，共四十一页，2022年，8月28日2凝聚和絮凝凝聚和絮凝预处理对象细小菌体或细胞（分泌胞外产物）、细胞的碎片以及蛋白质等胶体粒子的去除培养中的细胞、菌体或蛋白质等胶体颗粒的表面一般都带有电荷，带电原因很多，主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离胶粒能保持分散状态的原因是带有相同电荷，一旦布朗运动使离子间距离缩小到它们的扩散层而部分重叠时，即产生排斥作用，使两个离子分开，从而阻止了粒子的聚集胶体能稳定存在的另一个原因是其表面的水化作用，即形成了离子周围的水化层，阻碍胶粒间的直接聚集处理过程将一定的化学药剂预先投加到培养液，改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使它们聚集成可分离的絮凝体，再进行分离第八页，共四十一页，2022年，8月28日凝聚剂主要是一些无机类电解质，由于大部分被处理的物质带负电荷（如细胞或菌体一般带负电荷），因此工业上常用的凝聚剂大多为阳离子型，分为无机盐类、金属氧化物类凝聚凝聚是指在某些电解质作用下，破坏细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，使胶体粒子聚集的过程常用的无机盐类凝聚剂Al2（SO4）3·18H2O（明矾）AlCl3·6H2OFeCl3ZnSO4MgCO3常用的金属氧化物类凝聚剂Al(OH)3Fe3O4Ca(OH)2石灰等胶体是物质以一定分散程度而存在的一种状态。即将一物质分成许多小粒子，然后分散在一种介质中即可得到一种分散体系。在这种分散体系中，粒子叫分散质(或分散相)，介质叫分散剂(或分散介质)当分散质的直径在0.1μm～1nm之间，这个体系就叫胶体。胶体按分散质和分散剂聚态的不同可分为许多种第九页，共四十一页，2022年，8月28日

在发酵液中加入具有相反电性的电解质：①中和胶粒电性，降低双电层排斥力②离子的水化作用，破坏胶粒的水化层影响凝聚作用的主要因素

无机盐的种类、化合价以及无机盐的用量等阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序为：

Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+

无机盐促进胶粒颗粒凝聚的原因：第十页，共四十一页，2022年，8月28日

絮凝影响絮凝效果的因素絮凝剂的分子量絮凝剂用量溶液pH搅拌速度时间等絮凝剂具有长链线状的结构，易溶于水，其分子量可高达数万至一千万以上，在长的链上含有相当多的活性功能团当往胶体悬液中加入絮凝剂时，胶粒可强烈地吸附在絮凝剂表面的活性功能团上，而且一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的颗粒的表面上，产生架桥联接，形成粗大的絮凝团沉淀出来，有助于过滤，这一过程称为絮凝作用絮凝是指使用絮凝剂（通常是天然或合成的大分子量电解质），在悬浮粒子之间产生架桥作用而使胶粒形成粗大的絮凝团的过程第十一页，共四十一页，2022年，8月28日影响絮凝剂絮凝效果的因素絮凝剂分子量：分子量越大，链越长，吸附架桥效果就越明显；但是分子量过大，絮凝剂在水中的溶解度降低絮凝剂浓度：浓度较低时，增加用量有助于架桥，提高絮凝效果；但是浓度过高反而引起吸附饱和，在胶粒表面上形成覆盖层而失去与其他胶粒架桥的作用，降低了絮凝效果第十二页，共四十一页，2022年，8月28日溶液的pH：pH的变化会影响离子型絮凝剂功能团的电离度，提高电离度可使链分子上同种电荷间的电排斥作用增加，链从卷曲状态变为伸展状态，发挥最佳架桥能力搅拌速度：刚加入絮凝剂时，搅拌速度快能使絮凝剂迅速分散，发挥絮凝作用，但当絮凝团形成后，高的剪切力会打碎絮凝团第十三页，共四十一页，2022年，8月28日常用的絮凝剂壳聚糖、海藻酸钠、明胶和酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物及聚丙烯酸类等第十四页，共四十一页，2022年，8月28日3去除杂蛋白质的其它方法

等电点沉淀

蛋白质在等电点时溶解度最小，能沉淀而除去各种沉淀剂沉淀某些化学试剂能与蛋白质结合形成复合物沉淀在酸性溶液中加有机酸如三氯乙酸、水杨酸、苦味酸、鞣酸、过氯酸等形成沉淀；在碱性溶液中，能与一些阳离子如Ag+、Cu2+、Zn2+、Pb2+、Fe3+形成沉淀吸附在发酵液中，加入一些反应剂，它们互相反应生成的沉淀物对蛋白质具吸附作用而使其凝固加入吸附剂如活性碳，可以去除热原第十五页，共四十一页，2022年，8月28日（三）不溶性多糖的去除黏多糖的去除黏多糖可以和一些阳离子表面活性剂如十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）和十六烷基氯化吡啶（CPC）等形成季铵盐络合物而沉淀，因而可以通过向培养液中引入这些物质使多糖沉淀去除当发酵液中含有较多不溶性多糖时，粘度增大，液固分离困难，可用酶将它转化为单糖以提高过滤速度

例如在蛋白酶发酵液加α－淀粉酶，将培养基中多余的淀粉水解称单糖，就能降低发酵液粘度，提高滤速第十六页，共四十一页，2022年，8月28日（四）高价金属离子的去除对提取和成品质量影响较大的无机杂质主要是Ca2＋、Mg2＋、Fe3＋等高价金属离子，尤其在后期采用离子交换法时，这些离子会降低树脂的交换容量，预处理中应将它们除去钙离子：常采用草酸钠或草酸镁离子：去除也可用草酸，但草酸镁溶解度较大，故沉淀不完全，也可采

用磷酸盐，使生成磷酸钙盐和磷酸镁盐沉淀而除去铁离子：可采用黄血盐，形成普鲁士兰(亚铁氰化铁)沉淀离子交换法和沉淀法第十七页，共四十一页，2022年，8月28日破坏细胞壁和细胞膜，使胞内产物得到最大程度的释放目的影响细胞破碎的因素：1细胞壁的结构2破碎方法第二节细胞破碎第十八页，共四十一页，2022年，8月28日一细胞壁的结构革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖层（约20－80nm）组成革兰氏阴性菌肽聚糖层较薄，仅2－3nm，在肽聚糖层外还有两层外壁层。外壁层约8－10nm可见革兰氏阳性菌细胞壁较厚，较难破碎！第十九页，共四十一页，2022年，8月28日霉菌的细胞壁较厚，约100－250nm酵母的细胞壁比革兰氏阳性菌的细胞壁厚，更难破碎第二十页，共四十一页，2022年，8月28日机械法匀浆法珠磨法超声波化学法

化学试剂处理

酶解法制成丙酮粉物理法干燥冻融渗透压冲击二破碎方法第二十一页，共四十一页，2022年，8月28日机械法高压匀浆法：适用于酵母菌、大肠杆菌、巨大芽孢杆菌和黑曲霉等。不适用于高度分枝的微生物高速珠磨法：利用玻璃小珠与细胞悬液一起快速搅拌，由于研磨作用，使细胞破碎超声波破碎法：实验室常用影响因素：频率、液体温度和粘度、处理时间等第二十二页，共四十一页，2022年，8月28日FrenchPress压榨

压榨是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在1000×105Pa～2000×105Pa的高压下使几十毫升的细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。这是一种较理想的破碎细胞的方法，但仪器费用较高第二十三页，共四十一页，2022年，8月28日超声波振荡器第二十四页，共四十一页，2022年，8月28日`^非机械法化学法：采用化学试剂处理细胞，溶解细胞或抽提细胞组分酶解法：利用酶（溶菌酶、蛋白酶、脂肪酶、核酸酶、透明质酸酶等）反应分解破坏细胞壁上特殊的键，以达破壁的目的需与其它方法配合使用（辐射、渗透压冲击、反复冻融法等）

途径：在细胞悬液中加酶或采用自溶作用;

自溶作用：利用微生物自身产生的酶来溶菌，而不需外加其它的酶

自溶的方法：加热法、干燥法渗透压冲击法：先把细胞放在高渗溶液中，由于渗透压作用，细胞内水分向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压发生突然变化，胞外的水分迅速渗入胞内，使细胞快速膨胀而破裂冻融法：将细胞放在低温（-15℃），然后在室温中融化，反复多次，细胞壁破裂干燥法：经干燥后的菌体，其细胞膜的渗透性发生变化，同时部分菌体会产生自溶，然后用丙酮、丁醇或缓冲液等溶剂处理时，胞内物质就会被抽提出来

方法：空气干燥、真空干燥、喷雾干燥和冷冻干燥化学法1用碱处理2用脂溶性有机溶剂3表面活性剂4制成丙酮粉碱处理：可以溶解除去细胞壁以外的大部分组分，酸碱还可以调节溶液的pH，改变细胞所处的环境，从而改变蛋白质的电荷性质，使蛋白质之间或蛋白与其他物质之间的作用力降低而易于溶解到液相中去，便于后面的提取脂溶性有机溶剂：如丁醇、丙酮等，它们能溶解细胞膜上的脂类化合物，使细胞结构破坏，而将胞内产物抽提出来表面活性剂：常能引起细胞溶解或使某些组分从细胞内渗漏出来制成丙酮粉：组织经丙酮脱水干燥制成丙酮粉，不仅可以减少酶的变性，同时因细胞结构成分的破碎使蛋白质与脂质结合的某些化学键打开，促使某些结合酶释放到溶液中第二十五页，共四十一页，2022年，8月28日细胞破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数，即：

Y(%)=[(N0-N)/N0]×100

N0－原始细胞数量

N－经t时间操作后保留下来的未损害完整细胞数量三破碎率的评价目前N0和N主要通过下面的方法获得：直接计数法

在血球计数板用显微镜观察，直接对适当稀释后的样品进行计数间接计数法

间接计数法是在细胞破碎后，测定悬浮液中细胞释放出来的化合物的量（例如可溶性蛋白、酶等）具体操作：将破碎后的细胞悬浮液离心分离掉固体（完整细胞和碎片），然后用Lowry法测量上清中的蛋白质含量第二十六页，共四十一页，2022年，8月28日高压均浆和高速珠磨两种机械破碎方法，处理量大，速度非常快，目前在工业生长上应用最广泛。但在机械法破碎过程中，容易产生大量的热量，使料液温度升高，而易造成生化物质的破坏，特别是在超声波处理时，因此，超声波振荡法主要适用于实验室或小规模的细胞破碎

非机械法一般仅适用于小规模应用渗透压冲击和冻结－融解法都属于较温和的方法，但破碎作用较弱它们常与酶解法结合起来使用，提高破碎效果干燥法属于较激烈的一种破碎方法，容易引起蛋白质或其它组分变性四各种破碎方法的评述第二十七页，共四十一页，2022年，8月28日细胞破碎方法综合比较第二十八页，共四十一页，2022年，8月28日第二十九页，共四十一页，2022年，8月28日处理量规模及成本高压匀浆和珠磨机处理量大，速度快，适用于工业生产产物对破碎条件（温度、化学试剂、酶等）的敏感性以及产物在细胞中的位置生化物质的稳定性细胞的数量和细胞壁的强度破碎效果和产物释放率提取分离的难易

五破碎方法的选择依据总之，适宜的细胞破碎条件应该从高的产物释放率、低的能耗和便于后续提取这三方面进行权衡第三十页，共四十一页，2022年，8月28日固液分离将发酵液（或培养液）中的悬浮固体，如细胞、菌体、细胞碎片以及蛋白质等的沉淀物分离除去第三节液—固分离第三十一页，共四十一页，2022年，8月28日料液流向平行于过滤介质（过滤介质通常为微孔膜或超滤膜）（一）

常规过滤料液流动方向与过滤介质（能使固液混合料液得以分离的某一介面）垂直（二）错流过滤一过滤第三十二页，共四十一页，2022年，8月28日错流过滤的优点过滤收率高由于过滤过程中，洗涤充分、合理，少量多次，故滤液稀释量不大的情况下，获得高达97～98％的收率滤液质量好凡体积大于膜孔的固体，包括菌体、培养基、杂蛋白等均不能通过膜进入滤液，大部分杂质被排除掉，给后续分离及最终产品质量均带来好处减少处理步骤鼓式真空过滤器一般需预涂助滤剂，板框过滤则需清洗、拆装，都费时费力，而错流过滤只需在18～20小时连续操作之后，用清水沿原管流洗4～6小时对染菌罐易于批处理，也容易扩大生产第三十三页，共四十一页，2022年，8月28日（三）过滤设备：板框过滤机特点：板框压滤机的过滤面积大，能耐受较高压力差，对不同过滤特性的料液适应性强，同时还具有结构简单，造价较低，动力消耗少等优点。但这种设备不能连续操作，设备笨重，占地面积大，非生产的辅助时间长（包括解框、卸饼、洗滤布、重新压紧板框等）适用对象：广泛应用与培养基制备的过滤及霉菌、放线菌和酵母菌和细菌等多种发酵液的过滤第三十四页，共四十一页，2022年，8月28日（四）过滤介质和助滤剂1过滤介质：是指能使固－液混合料液得以分离的某一介面，通常指滤布或膜过滤中所用的膜。如：滤布或膜过滤介质要求能耐酸碱、耐高温、耐化学试剂、抗拉性能好，有一定的机械强度和孔隙度2助滤剂：

要求为惰性物质、无毒、有一定细毒及硬度，成本低廉常用有助滤剂：硅藻土、纸浆、石棉、纤维素等工业生产中有时需加入某些固体物质，以加速过滤速度，提高滤液质量，这种能提高过滤速度的物质称为助滤剂第三十五页，共四十一页，2022年，8月28日

使用惰性助滤剂助滤剂的作用主要是增加滤渣结构的疏松性，对杂质的机械截留助滤剂的使