产前诊断实验室技术课件

1产前诊断实验室技术1产前诊断实验室技术2主要内容一、产前诊断基本知识介绍二、产前诊断的取材三、产前诊断主要实验室技术羊水细胞染体核型分析羊水细胞荧光原位杂交2主要内容一、产前诊断基本知识介绍3为什么要进行产前诊断围生儿期常见疾病的发生率大大降低遗传性疾病的发生率逐年提高遗传病不能根治，不少遗传病病情严重，甚至导致患儿死亡或终生残疾产前诊断可及时诊断遗传性疾病，有利于积极采取预防措施，减少遗传病患儿的出生，降低遗传性疾病的发生率3为什么要进行产前诊断围生儿期常见疾病的发生率大大降低4产前诊断概念产前诊断又称宫内诊断，是在胎儿出生前即对其是否患有某种遗传性疾病或先天畸形做出准确判断产前诊断无创性产前诊断技术有创性产前诊断技术4产前诊断概念产前诊断又称宫内诊断，是在胎儿出生前即对其是否5产前诊断概念无创性产前诊断技术影像学检查（X线、超声、胎儿镜等），了解胎儿大体形态的发育情况母体外周血富集胎儿细胞技术母体外周血胎儿游离DNA检测有创性产前诊断技术（介入性产前诊断技术）绒毛膜穿刺、羊膜腔穿刺、脐带穿刺术等有创性操作获得胎儿细胞进行遗传学分析，判断胎儿是否患有遗传性疾病5产前诊断概念无创性产前诊断技术6可进行产前诊断的疾病有哪些单基因遗传病:PCR，基因测序等遗传病染色体病：染色体核型分析——金标准！荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization,FISH）多基因遗传病：疾病易感基因研究基因组病：SNP-array,array-CGH6可进行产前诊断的疾病有哪些单基因遗传病:PCR，基因测序等67染色体异常的发生机率活产婴儿0.6%先天性智力障碍（MR）患者23%先天性心脏病13%死胎和围产期死亡胎儿6.0%自然流产(前三个月)60%7染色体异常的发生机率活产婴儿8染色体异常的发生机率21-三体综合征新生儿发病率高达1/80018-三体发病率约为1/800013-三体发病率约为1/20000其它各种性染色体异常发病率约为1/10008染色体异常的发生机率21-三体综合征新生儿发病率高达1/89哪些人需要进行产前诊断唐筛高风险孕妇35岁以上高龄孕妇夫妇任一方为染色体病或染色体平衡易位携带者曾生育过染色体异常患儿的夫妇再次妊娠曾有不明原因自然流产、畸胎、死胎、死产或新生儿死亡史的孕妇再次妊娠采用辅助生殖技术妊娠者夫妇一方有明显致畸因素接触史者9哪些人需要进行产前诊断唐筛高风险孕妇10孕期胎儿染色体筛查方案10孕期胎儿染色体筛查方案11唐氏筛查报告的解读例如：21-三体风险率1/100假阳性和假阴性结合母亲年龄的三联筛查，唐氏综合症检出率:≈65%，假阳性率：4.5-5.0%增加抑制素A，可以将检出率增加到75%结合母亲年龄的NT测量，21三体检出率：77%，假阳性率：5%结合生化分析和颈透明度的唐氏综合症的检测检出率可以达到89%，假阳性率：5%仅仅是筛查实验，不是确诊实验！11唐氏筛查报告的解读例如：21-三体风险率1/10012先天愚型的发生率与母亲年龄关系母亲生育年龄（岁）出生先天愚型患儿风险率曾生育过先天愚型患儿孕妇再发风险＜201/1850增加5倍即1/37020-251/1600增加5倍即1/32025-301/1350增加5倍即1/27030-351/800增加5倍即1/16035-401/260无明显增加40-451/100无明显增加＞451/50无明显增加12先天愚型的发生率与母亲年龄关系母亲生育年龄（岁）出生先天13产前诊断取材绒毛膜穿刺术羊膜腔穿刺脐静脉穿刺术13产前诊断取材绒毛膜穿刺术14绒毛膜穿刺术在妊娠9-11周之间进行一次绒毛活检获取20mg左右的绒毛组织可满足任何产前诊断的需要操作相关的流产率约为1%14绒毛膜穿刺术在妊娠9-11周之间进行15羊膜腔穿刺术孕18-24周B超引导下取羊水25-30ml15羊膜腔穿刺术孕18-24周16脐静脉穿刺术操作时间窗为18周至分娩，妊娠20-24周为最佳穿刺时期其危险性高于羊膜腔穿刺术和CVS16脐静脉穿刺术操作时间窗为18周至分娩，妊娠20-24周为17产前诊断主要实验室技术羊水细胞培养及染色体核型分析羊水细胞荧光原位杂交检测（Fluorescenceinsituhybridization，FISH）17产前诊断主要实验室技术羊水细胞培养及染色体核型分析18羊水细胞培养及染色体核型分析18羊水细胞培养及染色体核型分析19羊水细胞培养实验原理标本采集：一般为孕18～24周，此时羊水中所含成纤维细胞和上皮样细胞多，较易生长羊水细胞是胎儿皮肤等的脱落细胞，大部分是固缩的，死亡的，只有一小部分是活细胞人的羊水细胞能长成单层贴壁细胞克隆并可连续进行传代培养19羊水细胞培养实验原理标本采集：一般为孕18～24周，此20羊水细胞培养实验原理培养条件：37℃,5%CO2开放式培养经过7天左右的培养，羊水细胞可生长为较成熟的细胞克隆，此时需更换培养液换液后细胞进入指数增长期，此时细胞生长旺盛，在换液后d1天及d2天在倒置显微镜下观察克隆生长情况，适时加入秋水仙素终止培养20羊水细胞培养实验原理培养条件：37℃,5%CO2开放式21羊水细胞培养实验步骤25ml羊水于1500rpm离心10min小心弃上清后，用1ml羊水重悬沉淀加入5ml完全羊水培养基，混匀转入培养瓶中，拧松瓶盖，置于37℃,5%CO2培养箱中培养5~7天一般7天后镜下观察，可见成纤维样或上皮细胞生长，当细胞生长旺盛，在贴壁细胞层的背景上出现圆形细胞时，视情况（有较好的梭形细胞克隆）可换上完全培养基，继续培养24-48小时如细胞生长状况好，即可加入秋水仙素作用4-6小时左右行细胞学处理。21羊水细胞培养实验步骤25ml羊水于1500rpm离心1022细胞收获及染色体制备实验步骤倒出倒出瓶中细胞上清液入15ml离心管中0.25%EDTA-trypsin消化3-5分钟，待细胞面出现肉眼可见皱形改变时即用吸管吹打细胞，加入上清液终止消化收集细胞悬液：1500rpm离心10min，去上清低渗：加入0.075MKCl6ml，吸管吹打，37℃水浴30min预固定：加入1ml固定液（甲醇/冰醋酸=3/1），轻混匀，1500rpm离心10min固定：去上清，加入固定液8ml，轻混匀，1500rpm离心10min重复固定一次，1500rpm离心10min，去上清根据管底细胞量适当加入几滴新鲜固定液，滴片显带、染色，显微镜下分析22细胞收获及染色体制备实验步骤倒出倒出瓶中细胞上清液入1523正常男性染色体核型正常女性染色体核型23正常男性染色体核型正常女性染色体核型2421-三体男性染色体核型21-三体女性染色体核型2421-三体男性染色体核型21-三体女性染色体核25羊水细胞荧光原位杂交（FISH）检测原理：经过荧光素标记的DNA探针，可特异性的与染色体上与之互补的序列相结合，从而使染色体对应位置上发出荧光信号在细胞学水平和分子水平之间架起了一道桥梁25羊水细胞荧光原位杂交（FISH）检测原理：26荧光原位杂交（FISH）技术用已知的荧光标记单链核苷酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位26荧光原位杂交（FISH）技术用已知的荧光标记单链核苷酸为2627羊水细胞荧光原位杂交（FISH）检测荧光标记的DNA探针27羊水细胞荧光原位杂交（FISH）检测荧光标记的DNA探针28FISH技术可检测哪些染色体病羊水FISH检测技术可快速检测羊水细胞中13、18、21、X、Y染色体数目异常以上五种染色体非整倍体异常发生率占所有染色体非整倍体发生率65%以上，占染色体异常活婴的95%以上28FISH技术可检测哪些染色体病羊水FISH检测技术可快速29FISH试验流程羊水细胞处理：低渗、固定、滴片玻片预处理玻片变性，打开DNA双链荧光探针配置探针变性，打开DNA双链玻片置于湿盒中42℃恒温孵育箱中杂交过夜（14~18小时）洗片，DAPI复染细胞核，荧光显微镜下观察荧光信号29FISH试验流程羊水细胞处理：低渗、固定、滴片玻片预处理30图1A：正常男性核型图；

B：13/21组荧光信号图，绿色示13号、红色示21号；

C：18/X/Y组荧光信号图，蓝色示18号、绿色示X、红色示Y核型分析与FISH结果

图1A1B1C30图1A：正常男性核型图；核型分析与FISH结果31核型分析与FISH结果图2A：正常女性核型图；

B：13/21组荧光信号图，绿色示13号、红色示21号；

C：18/X/Y组荧光信号图，蓝色示18号、绿色示X

图2A2B2C31核型分析与FISH结果图2A：正常女性核型图；32核型分析与FISH结果

图3A3B3C图3A：21-三体男性核型图（箭头示三条21号染色体）

B：13/21组荧光信号图，绿色示13号、红色示21号（3个）

C：18/X/Y组荧光信号图，蓝色示18号、绿色示X、红色示Y32核型分析与FISH结果图3A33核型分析与FISH技术对比核型分析——优点可检出全部46条染色体不仅能检出染色体数目异常，还能检出染色体结构异常目前仍是诊断染色体病的金标准核型分析——缺点孕周要求较为严格，一般为18-24周需要经过细胞培养，诊断周期长，核型分析报告时间为15-20天可能发生污染或培养失败等情况

33核型分析与FISH技术对比核型分析——优点34FISH技术——优点不经过细胞培养，缩短了诊断时间，提高了诊断效率，报告时间为2-3天对孕周无严格要求操作简便、敏感、特异性强FISH技术——缺点仅能检出部分染色体数目异常不能检出染色体结构重排及变异核型分析与FISH技术对比34FISH技术——优点核型分析与FISH技术对比侵入性产前诊断技术的利与弊3547,XY,+21利：目前的金标准弊：

一定的流产风险：0.5%报告周期长，存在培养风险孕妇和家属承受较大思想压力侵入性产前诊断技术的利与弊3547,XY,+21利：目前无创性产前检测技术36无创性产前检测技术36无创性产前检测技术37无创性产前检测技术3738无创性产前诊断技术38无创性产前诊断技术39无创性产前检测技术的利与弊39无创性产前检测技术的利与弊产前诊断新技术高通量基因测序染色体微阵列（CMA，SNP-array）分辨率高，是普通核型分析的20倍可检出重复或缺失序列的来源不能检出染色体平衡性结构改变不能检出重复或缺失序列在染色体组中的位置产前诊断新技术高通量基因测序4041产前诊断的重要性41产前诊断的重要性42本节知识回顾产前诊断的概念产前诊断的主要实验室技术羊水细胞培养及染色体核型分析羊水细胞荧光原位杂交42本节知识回顾产前诊断的概念43谢谢!!43谢谢!!44产前诊断实验室技术1产前诊断实验室技术45主要内容一、产前诊断基本知识介绍二、产前诊断的取材三、产前诊断主要实验室技术羊水细胞染体核型分析羊水细胞荧光原位杂交2主要内容一、产前诊断基本知识介绍46为什么要进行产前诊断围生儿期常见疾病的发生率大大降低遗传性疾病的发生率逐年提高遗传病不能根治，不少遗传病病情严重，甚至导致患儿死亡或终生残疾产前诊断可及时诊断遗传性疾病，有利于积极采取预防措施，减少遗传病患儿的出生，降低遗传性疾病的发生率3为什么要进行产前诊断围生儿期常见疾病的发生率大大降低47产前诊断概念产前诊断又称宫内诊断，是在胎儿出生前即对其是否患有某种遗传性疾病或先天畸形做出准确判断产前诊断无创性产前诊断技术有创性产前诊断技术4产前诊断概念产前诊断又称宫内诊断，是在胎儿出生前即对其是否48产前诊断概念无创性产前诊断技术影像学检查（X线、超声、胎儿镜等），了解胎儿大体形态的发育情况母体外周血富集胎儿细胞技术母体外周血胎儿游离DNA检测有创性产前诊断技术（介入性产前诊断技术）绒毛膜穿刺、羊膜腔穿刺、脐带穿刺术等有创性操作获得胎儿细胞进行遗传学分析，判断胎儿是否患有遗传性疾病5产前诊断概念无创性产前诊断技术49可进行产前诊断的疾病有哪些单基因遗传病:PCR，基因测序等遗传病染色体病：染色体核型分析——金标准！荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization,FISH）多基因遗传病：疾病易感基因研究基因组病：SNP-array,array-CGH6可进行产前诊断的疾病有哪些单基因遗传病:PCR，基因测序等4950染色体异常的发生机率活产婴儿0.6%先天性智力障碍（MR）患者23%先天性心脏病13%死胎和围产期死亡胎儿6.0%自然流产(前三个月)60%7染色体异常的发生机率活产婴儿51染色体异常的发生机率21-三体综合征新生儿发病率高达1/80018-三体发病率约为1/800013-三体发病率约为1/20000其它各种性染色体异常发病率约为1/10008染色体异常的发生机率21-三体综合征新生儿发病率高达1/852哪些人需要进行产前诊断唐筛高风险孕妇35岁以上高龄孕妇夫妇任一方为染色体病或染色体平衡易位携带者曾生育过染色体异常患儿的夫妇再次妊娠曾有不明原因自然流产、畸胎、死胎、死产或新生儿死亡史的孕妇再次妊娠采用辅助生殖技术妊娠者夫妇一方有明显致畸因素接触史者9哪些人需要进行产前诊断唐筛高风险孕妇53孕期胎儿染色体筛查方案10孕期胎儿染色体筛查方案54唐氏筛查报告的解读例如：21-三体风险率1/100假阳性和假阴性结合母亲年龄的三联筛查，唐氏综合症检出率:≈65%，假阳性率：4.5-5.0%增加抑制素A，可以将检出率增加到75%结合母亲年龄的NT测量，21三体检出率：77%，假阳性率：5%结合生化分析和颈透明度的唐氏综合症的检测检出率可以达到89%，假阳性率：5%仅仅是筛查实验，不是确诊实验！11唐氏筛查报告的解读例如：21-三体风险率1/10055先天愚型的发生率与母亲年龄关系母亲生育年龄（岁）出生先天愚型患儿风险率曾生育过先天愚型患儿孕妇再发风险＜201/1850增加5倍即1/37020-251/1600增加5倍即1/32025-301/1350增加5倍即1/27030-351/800增加5倍即1/16035-401/260无明显增加40-451/100无明显增加＞451/50无明显增加12先天愚型的发生率与母亲年龄关系母亲生育年龄（岁）出生先天56产前诊断取材绒毛膜穿刺术羊膜腔穿刺脐静脉穿刺术13产前诊断取材绒毛膜穿刺术57绒毛膜穿刺术在妊娠9-11周之间进行一次绒毛活检获取20mg左右的绒毛组织可满足任何产前诊断的需要操作相关的流产率约为1%14绒毛膜穿刺术在妊娠9-11周之间进行58羊膜腔穿刺术孕18-24周B超引导下取羊水25-30ml15羊膜腔穿刺术孕18-24周59脐静脉穿刺术操作时间窗为18周至分娩，妊娠20-24周为最佳穿刺时期其危险性高于羊膜腔穿刺术和CVS16脐静脉穿刺术操作时间窗为18周至分娩，妊娠20-24周为60产前诊断主要实验室技术羊水细胞培养及染色体核型分析羊水细胞荧光原位杂交检测（Fluorescenceinsituhybridization，FISH）17产前诊断主要实验室技术羊水细胞培养及染色体核型分析61羊水细胞培养及染色体核型分析18羊水细胞培养及染色体核型分析62羊水细胞培养实验原理标本采集：一般为孕18～24周，此时羊水中所含成纤维细胞和上皮样细胞多，较易生长羊水细胞是胎儿皮肤等的脱落细胞，大部分是固缩的，死亡的，只有一小部分是活细胞人的羊水细胞能长成单层贴壁细胞克隆并可连续进行传代培养19羊水细胞培养实验原理标本采集：一般为孕18～24周，此63羊水细胞培养实验原理培养条件：37℃,5%CO2开放式培养经过7天左右的培养，羊水细胞可生长为较成熟的细胞克隆，此时需更换培养液换液后细胞进入指数增长期，此时细胞生长旺盛，在换液后d1天及d2天在倒置显微镜下观察克隆生长情况，适时加入秋水仙素终止培养20羊水细胞培养实验原理培养条件：37℃,5%CO2开放式64羊水细胞培养实验步骤25ml羊水于1500rpm离心10min小心弃上清后，用1ml羊水重悬沉淀加入5ml完全羊水培养基，混匀转入培养瓶中，拧松瓶盖，置于37℃,5%CO2培养箱中培养5~7天一般7天后镜下观察，可见成纤维样或上皮细胞生长，当细胞生长旺盛，在贴壁细胞层的背景上出现圆形细胞时，视情况（有较好的梭形细胞克隆）可换上完全培养基，继续培养24-48小时如细胞生长状况好，即可加入秋水仙素作用4-6小时左右行细胞学处理。21羊水细胞培养实验步骤25ml羊水于1500rpm离心1065细胞收获及染色体制备实验步骤倒出倒出瓶中细胞上清液入15ml离心管中0.25%EDTA-trypsin消化3-5分钟，待细胞面出现肉眼可见皱形改变时即用吸管吹打细胞，加入上清液终止消化收集细胞悬液：1500rpm离心10min，去上清低渗：加入0.075MKCl6ml，吸管吹打，37℃水浴30min预固定：加入1ml固定液（甲醇/冰醋酸=3/1），轻混匀，1500rpm离心10min固定：去上清，加入固定液8ml，轻混匀，1500rpm离心10min重复固定一次，1500rpm离心10min，去上清根据管底细胞量适当加入几滴新鲜固定液，滴片显带、染色，显微镜下分析22细胞收获及染色体制备实验步骤倒出倒出瓶中细胞上清液入1566正常男性染色体核型正常女性染色体核型23正常男性染色体核型正常女性染色体核型6721-三体男性染色体核型21-三体女性染色体核型2421-三体男性染色体核型21-三体女性染色体核68羊水细胞荧光原位杂交（FISH）检测原理：经过荧光素标记的DNA探针，可特异性的与染色体上与之互补的序列相结合，从而使染色体对应位置上发出荧光信号在细胞学水平和分子水平之间架起了一道桥梁25羊水细胞荧光原位杂交（FISH）检测原理：69荧光原位杂交（FISH）技术用已知的荧光标记单链核苷酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位26荧光原位杂交（FISH）技术用已知的荧光标记单链核苷酸为6970羊水细胞荧光原位杂交（FISH）检测荧光标记的DNA探针27羊水细胞荧光原位杂交（FISH）检测荧光标记的DNA探针71FISH技术可检测哪些染色体病羊水FISH检测技术可快速检测羊水细胞中13、18、21、X、Y染色体数目异常以上五种染色体非整倍体异常发生率占所有染色体非整倍体发生率65%以上，占染色体异常活婴的95%以上28FISH技术可检测哪些染色体病羊水FISH检测技术可快速72FISH试验流程羊水细胞处理：低渗、固定、滴片玻片预处理玻片变性，打开DNA双链荧光探针配置探针变性，打开DNA双链玻片置于湿盒中42℃恒温孵育箱中杂交过夜（14~18小时）洗片，DAPI复染细胞核，荧光显微镜下观察荧光信号29FISH试验流程羊水细胞处理：低渗、固定、滴片玻片预处理73图1A：正常男性核型图；

B：13/21组荧光信号图，绿色示13号、红色示21号；

C：18/X/Y组荧光信号图，蓝色示18号、绿色示X、红色示Y核型分析与FISH结果

图1A1B1C30图1A：正常男性核型图；核型分析与FISH结果74核型分析与FISH结果图2A：正常女性核型图；

B：13/21组荧光信号图，绿色示13号、红色示21号；

C：18/X/Y组荧光信号图，蓝色示18号、绿色示X

图2A2B