环境DNA采样操作手册图1113

环境DNA采样操作手册水利部中国科学院水工程生态研究所2015年11月

目录1采样准备 22水样采集 33水样抽滤 44快递滤膜 85联系信息 8

1采样准备1.1确认采样点天气，尽量避免在降雨后48小时内进行采样。1.2准备采样用具全新2L广口密封采样瓶一次性乳胶手套油性记号笔、中性笔环境DNA样本信息记录表1.3在采样时间前到达采样地点，核对采样点坐标。1.4测量采样点水温、pH值、溶解氧等参数并记录在环境DNA样本信息记录表上。

2水样采集2.1采样前带上新的一次性乳胶手套。2.2于预定采样时间在预定采样坐标河岸位置打开采样瓶盖，将瓶口边沿浸入水面取表层水，瓶口不超过水面以下5cm，瓶口朝向上游来水方向。采样瓶装满水后盖上瓶盖密封。2.3用油性记号笔在瓶身写好水样名称，格式为：采样日期-采样点-采样时间-样本编号，例：20151130-宜昌-9:30am-1。2.4重复2.2、2.3，一个采样点共采集3个2L水样。2.5在环境DNA样本信息记录表上填写水样采集信息。2.6将采集的3个水样尽快带回进行抽滤，常温存放不超过8h，4℃存放不超过24h。图1水样采集示范

3水样抽滤3.1抽滤准备清洁工作台面。带上新的一次性乳胶手套。连接真空泵和玻璃抽滤组。台面上铺上干净的台纸（可用干净的抽纸或打印纸），放上2支卷滤膜的镊子（中号）和1支取新滤膜的镊子（小号）。先不放滤膜，直接在漏斗中倒满新打开的蒸馏水，打开真空泵抽滤，水滤完后取下漏斗，倒置放在台纸上。图2镊子、漏斗和滤膜

3.2抽滤空白对照每个采样点每次采集的3个样本在抽滤前都须设置空白对照。用干净滤膜专用的小号镊子取滤膜，揭开蓝色间隔纸，取白色滤膜一张，放在玻璃滤膜台中央，盖上漏斗。倒入300ml蒸馏水进行抽滤，抽滤完后再重复倒入多次，直至抽滤完2L蒸馏水，水滤完后继续抽滤一段时间直至滤膜基本干燥。取下漏斗，倒置放在台纸上，用2支中号镊子分别夹住滤膜左右边缘，向上卷曲，滤膜上表面（含过滤物质）在内，放入50ml离心管中密封。用记号笔在离心管上写好空白对照的滤膜名称，格式为：采样日期-采样点-B，B表示空白对照，例：20151130-宜昌-B。图3抽滤图4滤膜卷曲

3.3抽滤长江水样用干净滤膜专用的小号镊子取滤膜，揭开蓝色间隔纸，取白色滤膜一张，放在玻璃滤膜台中央，盖上漏斗。将密封采样瓶外表面在自来水龙头下冲洗干净，再用干净的抽纸擦干。将水样摇匀，倒入300ml长江水样，抽滤完后再重复倒入多次，抽滤速度过慢时（抽滤300ml耗时大于30分钟）可停止倒入水样，漏斗中的水滤完后继续抽滤一段时间直至滤膜基本干燥。取下漏斗，倒置放在台纸上，用2支中号镊子分别夹住滤膜左右边缘，向上卷曲，滤膜上表面（含过滤物质）在内，放入50ml离心管中密封。用记号笔在离心管上写好长江水样的滤膜名称，格式为：采样日期-采样点-样本编号-滤膜过滤体积，例：20151130-宜昌-1-900ml。更换滤膜继续过滤剩余水样，重复步骤1)~4)直至抽滤完一瓶2L水样。在环境DNA样本信息记录表上填写样本抽滤信息。将同一瓶水样过滤所用的多个装有滤膜的离心管以及该批样本的样本信息记录表放在同一个封口袋中，在封口袋表面贴上标签纸，写好采样日期、采样地点，例：20151130-宜昌。将滤膜置于-20℃存放，无冰箱时用速冷冰袋保冷存放。图5滤膜放入封口袋

3.4抽滤设备消毒清洗同一采样点同一日期采集的3个样本之间不需要进行抽滤设备消毒，不同采样点或不同采样日期的样本在抽滤前需要对抽滤设备进行消毒清洗。配置10%浓度的消毒液（任意品牌的84消毒液），取1体积的消毒液原液加上9体积的水混合。将玻璃抽滤组中的滤膜台和漏斗、卷曲滤膜的2个中号镊子完全浸泡于10%的消毒液溶液中30分钟。取出玻璃抽滤组和镊子，于自来水龙头下冲洗，直至完全去除残留的消毒液，无残留气味。消毒液必须完全冲洗去除，否则下次抽滤时将破坏样本中的DNA，影响后续实验。将冲洗干净的玻璃抽滤组和镊子放于干净的台纸上晾干，滤膜台横放，漏斗倒置，完全干燥后将抽滤组和镊子分别放置于干净的封口袋中备用。

4快递滤膜抽滤完成后将样本和空白对照所用的所有滤膜和冰袋一起打包，放于泡沫箱中，尽快寄回实验室（收件地址见5联系信息），没有泡沫箱时可用毛巾织物等包裹保温。图6滤膜打包快递

5联系信息单位：水利部中国科学院水工程生态研究所地址：湖北省武汉市雄楚大街578号联系人：1.徐念