苹果炭疽菌与苹果互作综述

苹果与炭疽菌的相互作用及病害机制研究综述(杜友伟，西北农林科技大学，陕西，咸阳，712100)摘要炭疽病是世界范围内普遍存在的一种真菌植物病害，尤其在热带、亚热带地区，寄主范围广泛，可危害各种农作物、林木、经济作物、瓜果蔬菜等，造成严重的经济损失。果实采后腐烂是一个全球性问题,已引起世界范围的极大关注。苹果炭疽病 (Colletotrichumgloeosporioides)是苹果上的主要病害引致苹果采后腐烂严重。木文从从保护生态环境和农业可持续发展的角度出发，以苹果采后炭疽病为研究对象，利用物理的、化学的、生物的和农业的无污染防除技术及分子鉴定诊断技术，逐步组建苹果采后炭疽病可持续控制的病害防御体系。关键字：刺盘孢属；苹果；炭疽病；机制；综述ThereviewofthediseasemechanismandtheinteractionbetweenappleandColletotrichumgloeosporioides(YouweiDu,North-westA&FUniversity,Yangling,Shaanxi,712100,China)

AbstractAnthracnoseisanimportantpathogenicfunguswithawiderangeofhosts,especially,whichhappenedintropicalandsubtropicalregions,andcandamageavarietyofcrops,trees,cashcropsandvegetablestomodernagriculturalproductioncausedseriouseconomiclosses.Postharvestfruitsrotisaglobalproblem.Appleisanimportantfruitworldwide.Applepostharvestauthrancnose(bitterrot)causedbyColletotrichumgloeosporioidesisadestructivediseaseofapplefruitinproductionareas;itcancauseseriousyieldloss.Currently,itisimportantthatthetechniquesofphysical,chemical,biological,culturalcontrolandmoleculardiagnosisforappleauthrancnosewereusedtoassemblyasustainableapplebitterrotcontrolsystem,withaimatecologicalenvironmentprotectionandsustainableagriculturedevelopment.Keywords:Colletotrichum,Apple,Applebitterrot,Mechanism,Review果实采后腐烂是一个全球性问题，已引起世界范围的极大关注。在国内相当长时间内没有得到相应的重视,但随着人民生活水平的提高，我国果业的发展及采后腐烂损失的加剧，对果实采后的病害问题已日益受到重视，果实采后腐烂原因主要是果实在采后、加工、运输、贮存、销售过程中，病原菌侵染所致(张维一和毕阳1995)。苹果是我省主要水果之一，苹果炭疽病是苹果上的主要病害，又名苦腐病，是导致苹果果实腐烂的重要病害，引起炭疽病的病原菌主要是Colletotrichumgloeosporioides(束怀瑞1999)。苹果炭疽病具有潜伏侵染的特性，果实在幼果期就可被感染，但在近成熟时才开始发病，采收后在贮藏期继续发生，致使采前大量落果和贮藏期中的果实腐烂(董金皋2001)。苹果炭疽病发生的范围极广，中国则以华北以西北、黄淮、西南等地区为主。1856年，苹果炭疽病首次被英国学者Berkeley报道，并对其进行了描述(Southworth1891)。到1992年以后，苹果炭疽病相继在各国苹果产区(热带，亚热带以及温带)大范围发生，包括韩国、加拿大、日本、北欧等，目前已成为影响世界苹果产量的重要病害之一(Alvarez2005;Leeetal.2006;Martin1999)。苹果炭疽病研究进展病原菌分类苹果炭疽病菌的无性阶段为胶抱炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)，属半知菌亚门，黑盘抱目，炭疽菌属有性阶段为围小丛壳[Glomerllacingulata(Stonem.)Schr.etSpauld.],属子囊菌亚门，球壳目，自然情况下少见(王晓鸣1987)。苹果炭疽病的病原菌在1974年首次由Mordue报道(Sutton1990)，认为是Glomerellacingulata(Stonem.)Spauld.&H.Schrenk.,无性态为胶抱炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides(Penz.)Sacc。1990年，Sutton进一步发现，引起苹果炭疽病的另外一种病原菌为尖抱炭疽菌 C.acutatum，同时对C.gloeosporioides(Penz.)Penz.&Sacc.，G.cingulata(Stoneman)Spauld.&H.Schrenk.和C.acutatumJ.H.Simmonds三种病原菌的形态特征进行了详细的比较描述(Guerber2003)。目前已证实在许多国家苹果炭疽病是由C.gloeosporioides和C.acutatum两种病原菌引起的，如美国、日本、挪威(ChungWHetal.2006)。我国一直以来对苹果炭疽病的病原尚未开展系统研究，一些研究和教科书多直接引用国外早期文献，认为我国苹果炭疽病只是由胶抱炭疽菌C.gloeosporioides一种病原菌引起的(王晓鸣和李建义1987)。直到2009年张荣等研究证实，引起中国苹果炭疽病的病原菌除以往报道的C.gloeosporioides外，尖抱炭疽菌(C.acutatum)同样可作为苹果炭疽病病原(张荣等2009)。病原菌形态学特征尖抱炭疽菌C.acutatum(Simmonds)和胶抱炭疽菌C.gloeosporides(Penz.)的菌落特征：前者为白色，灰白色或粉红，橘红色，气生菌丝白色，绒状；后者灰白色至深灰色，气生菌丝平坦，毡状或者絮状，分生抱子产生于菌丝层中，菌落随菌龄增长背面呈不均匀的白色至灰色或黑色。分生抱子的形状及大小：前者，分生抱子无色单胞，梭形或纺锤形，两端尖,8〜16x2.5〜4ym；后者，分生抱子为单胞、无色、椭圆形或圆柱形、两端钝圆，有油球，大小9~24x3~6gmo附着抱的形态:前者，褐色，近圆形或不规则形，大小在6.5〜11x4.5〜7.5ym之间，后者，褐色，近圆形或椭圆形，大小在6〜10x5〜7ym之间(Mordue1979)。有性态为围小丛壳G.cingulata(Stoneman)o形态特征为：子囊壳生长于黑色的瘤状子座内，每个子座含有1到几个子囊壳。子囊壳深褐色，呈烧瓶形，外部附有毛状的菌丝，子囊壳的直径在85〜300ym之间。子囊为长棍棒状，平行排列在子囊壳中，大小为55〜70x9ym，里面含有8个子囊抱子。子囊抱子为单抱，无色，卵圆形或长椭圆形，稍弯曲，大小为12〜2x3.5〜5.0ym(Gunnell1992;Thompson1971)。苹果炭疽病的症状苹果在座果后即可被苹果炭疽病病原菌感染，在果实近成熟时开始发病，采收后在贮藏期还可能继续发展，造成采前大量落果和采后贮藏中果腐，也被称为苹果苦腐病(Bitterrotofapple)o该病在一些地区还可引起叶斑症状，也被称为苹果炭疽叶枯病(Glomerellaleafspot，GLS)，导致果树早期大量落叶，树势减弱、果实不能正常成熟、花芽形成受阻和翌年花数量减少，严重影响苹果产量和品质，给苹果产业造成重大经济损失(Gonzalezetal2004)。苹果炭疽病主要危害果实，一般发生于果实接近成熟时。初发病时，果面上出现浅褐色，有清晰边沿的针头大的圆形小斑，以后逐渐扩大后，病部色泽随之加深，并向下凹陷。当病斑扩大至5cm时，果实表面产生黑色突起的小粒点，这就是病菌的分生抱子盘。分生抱子盘有时呈有规律的同心圆轮纹排列，有时则不是(图1A,B)o当条件适宜时，如环境潮湿温和，黑色粒点逐渐扩展，突破表皮，分生抱子盘就会长出粉红或橙红色粘液，即病菌的分生抱子团。随着病斑的逐渐扩大，病部成圆锥状烂入果肉以致果心，由淡褐渐变暗褐色，有时会长出菌丝。发病的果肉和健康的果肉界限分明，色泽清晰，用刀切开就可看清。发病组织往往稍带苦味，因此此病也叫苦腐病。

图1A,B苹果炭疽病Fig.1A,BApplebitterrot炭疽叶枯病潜育期短、发病急，一般从侵染到发病落叶仅为3天或更短，根本来不及防治，抱子能通过气流传播，不同的苹果品种之间抗病性差异很大，嘎啦、秦冠、金冠等品种是易感染品种（李保华等2013）,所以苹果炭疽病仍是苹果产区一种重要的果实病害。幼叶感病，叶面初为红至黄褐或红褐色小点，针尖大小，略凹陷，不规则，病健交界不清晰（图2）。老叶感病，初为淡褐色或黑色小点，随着病斑的扩展，病斑呈黄褐、红褐或深褐色，有时由内向外颜色深浅不一，略呈轮纹状，病斑周围常有不规则红褐、深褐色晕环，呈放射状，幼叶上晕圈的幅宽远超过病斑的大小。后期病斑颜色逐渐变成灰白，条件合适时病斑上以原侵染点为中心产生似轮纹状的黑色分生抱子盘、灰青色的瘤状物（子囊壳）或黄白至桔红色胶状分生抱子液。病斑在叶背面均为褐色。病斑多呈椭圆形、圆形、长条形或连片成不规则形，多斑连片时常常造成叶片扭曲，大半个叶片变褐，严重者叶片迅速失水变褐、焦枯至脱落。图2炭疽叶枯病

Fig.2Glomerellaleafspot苹果炭疽病致病机理炭疽菌侵入结构及其过程苹果炭疽菌分生抱子单细胞，在湿润环境下产生单一芽管，它与寄主硬的表面接触后顶端膨胀，产生具有厚壁的附着胞，穿透菌丝从附着胞的下方产生，穿透角质层和寄主细胞壁。在细胞腔内侧，侵染菌丝发育成球形的感染泡，从感染泡产生初生菌丝（Hunsley1970;Suzuki1983)。炭疽病菌具有潜伏侵染特性，由于未成熟苹果中绿原酸含量高，存在一些抑菌物质，钝化病原菌分泌的水解酶，附着胞通过皮孔侵入苹果果实后，埋藏在表皮或角质层内，静止休眠生活可达数月。果实成熟采收后生理状况发生改变，如细胞膜透性变化、释放出可溶性养料或抑菌物质浓度降低、呼吸作用增强等，苹果由抗病变为感病，附着胞结束休眠，生出侵入菌丝，穿透寄主角质层和细胞壁，进而侵入果实扩展致病。苹果幼果期感染后，病菌常以侵染丝在果皮中滞育，不发病，待果实近成熟时或贮运期间才陆续发病。果实发病一般从果点即皮孔开始发病。苹果果实的皮孔大多是随果实增大、表皮扩展而由气孔演变而成(陈策1999)。炭疽病菌能经气孔、皮孔侵入苹果，前人已通过组织病理学研究证实。同时也可直接穿透角质层侵入果实，在适宜条件下经一小时即可完成侵染过程。从苹果幼果期直至八九月间，病菌均可能侵染，分生抱子与果实接触，遇适宜温、湿度条件，即可萌发产生芽管，产生芽管后一，长度达一林时，顶部膨大形成无色薄壁附着胞或深色厚壁附着胞，无色薄壁附着胞随即萌发侵入，侵入寄主角质层后引起过敏反应，以后不再生长，深色厚壁的附着胞粘附于果实表面休眠。厚壁附着胞能抵抗干燥、光照和药剂等不良条件，甚至半埋于果皮蜡质层中受到保护。炭疽病菌抱子萌发后，形成厚壁附着胞休眠，是潜伏侵染的一种方式，直至果实生理状况发生改变，结束休眠生出侵入锥，侵入果实扩展致病。炭疽菌潜育期因品种、果龄、温度等条件而异。一般认为，激活附着胞结束休眠转入活动状态的机制是，果实进入成熟期，生理状况发生变化，如细胞膜透性发生改变，释放出可溶性养料，或抑菌物质浓度降低等，苹果由抗病转变为感病。苹果果实由抗病转为感病发生在果实呼吸跃变期，随着呼吸作用的骤然增强，果实发生一系列生物化学变化，寄主和病原菌互作，导致果实发病腐烂(SitterlyI960;Schiffmann-Nadel1985)。病原真菌致病机制研究植物病原菌能够在体内合成并向外分泌多种能够降解植物细胞壁的酶(CWDE),包括果胶酶、纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶、磷酸脂酶等类型。这些胞壁降解酶协同作用可引起寄主组织浸解(Wood1967)，参与病害的扩展，影响寄主超微结构(李宝聚2001)。另外，新鲜果蔬组织致密，原果胶不溶性是由于分子量高，它的半乳醛酸羧基高甲基化，这种不溶性状态的中胶层，可抵抗病原微生物分泌的果胶酶降解作用。这种交连的果细胞壁是未成熟苹果抗病性的重要原因。随着果蔬成熟、不溶性果胶和蛋白质减少，可溶性增加，果胶朊甲基化，组织变软，对病原果胶酶的浸解作用变得敏感。苹果成熟后，组织中果胶甲酯酶活化，使果胶脱去甲基，在病原的多聚半乳糖醛酸酶作用下，组织崩溃加速。成熟的苹果容易受到病原菌侵染，原因就在于此(薛莲2005)。苹果炭疽病的发病规律苹果炭疽菌主要在前一年的病果、僵果和其它寄主植物上越冬。翌春通过飞散的分生孢子进行传播。通常炭疽菌在寄主的组织上形成的分生孢子层主要是靠雨水飞溅和昆虫传播的。侵入果实的主要方式是皮孔、伤口或直接侵入(Clements1985)。在条件适宜的情况下，5~10h分生抱子即可完成侵染过程。苹果炭疽病菌有世代重叠现象，在不同的寄主上会产生不同的病害循环(Peresetal.2005)。另外，高温高湿则容易引起果实腐烂(戴志宏2006;焦文英2008)。苹果炭疽菌的侵染特性炭疽菌具有潜伏侵染的特性，透过皮孔侵入进果实的附着孢，埋藏在表皮或角质层中，可进行长达数月的休眠。果实成熟后的各项生理指标，如细胞膜透性、可溶性养料的释放、抑菌物质浓度降低、呼吸作用增强等都发生较大的变化(陈策1999;SitterlyandShay1980)。此时，苹果的抗病能力下降，变得易感病，附着胞停止休眠，伸出可穿透寄主角质层和细胞壁的侵染菌丝，而后侵入果实并迅速扩展使果实发病(Schiffmannetal.1985)。炭疽菌在侵染寄主过程中形成如芽管、附着孢、侵染钉、侵染泡囊、初生菌丝和次生菌丝等专门的侵染结构，在病原菌—寄主互作中，为了防止寄主的防卫反应可以使用多种侵染方式(张敬泽和徐同2005)。首先是分生孢子在寄主表面粘附后萌发，形成附着孢。附着孢只能在硬质表面和有限营养存在的条件下才能分化。亲水的软表面或疏水的软石蜡上能为C.gloeosporioides萌发提供条件，但不能促使芽管在这些软表面上分化并形成附着孢(FIaishmanandKolattukudy1995)。在穿透寄主的过程中附着孢的分化起着至关重要的作用，附着孢大小因病原菌的种而异，如C.lindemuthianum附着抱的长度在5-7ym之间，而C.gloeosporioides的则要大，在10〜12gm之间。粘性基质随着附着抱形成而产生，附着抱被其外部分泌的基质包围着。随后，在接近原生质膜的细胞壁内层或者整个细胞壁和细胞内的基质中就会沉积黑色素(KuboandFurusawa1986)。有研究表明，缺乏黑色素的附着抱不能对寄主造成侵染，由此表明，黑色素在附着抱穿透寄主过程中起着关键性的作用。当附着抱成熟后在其中央形成一个圆形的穿透孔，此处即为穿透钉生长的位置(KuboandFurusawa1991)。炭疽菌属真菌能够侵染并定殖在寄主组织中，主要是穿透钉起着穿透的作用。虽然菌丝在细胞各个部位扩展，如细胞内、细胞壁和细胞空间中，对寄主细胞组织起到破坏的作用，最终造成细胞的死亡，然而，病原菌独特的初侵染策略决定了病菌能够成功侵染寄主组织并在内部定殖(鲁仲新2010。苹果炭疽菌的分泌物质引致苹果发病的原因是滤液中的苹果炭疽菌分生抱子，而不是其它的致病毒素，所以可推断苹果炭疽病菌没有分泌致病毒素(檀根甲2009。寄主抗病机制寄主主要防御酶植物对病原物侵入的生理生化反应是以酶的催化活动而实现的。POD和PPO属于氧化酶系统，主要参与木质素的聚合和酚类的氧化，POD和PPO活性增加可大大增加酚氧化物的含量。POD除了是细胞内重要的活性氧清除剂外，它还可以催化许多化合物如脂肪酯、芳香胺和酚类物质的氧化，参与乙烯的生物合成，催化木质素前体如松柏醇的形成以及细胞壁碳水化合物与蛋白质之间形成共价键等。在无数不亲合的寄主一寄生物组合中，POD活性常较亲合组合中高数倍。将酚类氧化成棕褐色的醌，酚类化合物中有许多具有抗菌素的性质，可杀死入侵的病原物，而酚的氧化产物醌对病原菌的毒杀作用比酚还要强，醌可以聚合、封闭感染组织，还可以对亲核氨基酸进行共价修饰。PAL是苯丙烷类代谢途径的关键酶和限速酶，参与木质素及酚类化合物的合成。木质素的形成，可以增加细胞壁的厚度，增加组织木质化程度，形成病原菌入侵的机械屏障。植物诱导生化抗病性诱导的生化抗性可分为如下几个类型：1、 过敏反应HR发生时，伴随细胞质膜完全性的丧失，细胞呼吸增强，酚类化合物氧化并积累以及植保素的合成(Hammerschimidt1982;Hammerschimidt1983)。2、 植物细胞内存在的抑制剂酚类化合物在病原菌侵染后，其合成和积累加速。如绿原酸，咖啡酸等，这类化合物称为普通酚类化合物。3、 大多数植物含有无毒性的配糖体物质，它由葡萄糖和酚类或其它分子构成。当病原菌侵染植物后，寄主的糖苷酶被激活。糖苷酶分解配糖体，从而释放出酚类化合物(董汉松1996)。4、 病原菌侵染植物后，抗病性品种的酚类氧化酶活性高于感性品种。多酚氧化酶和过氧化物酶都能氧化酚类化合物和促进类似木质素物质的聚合作用，这种聚合物在细胞中沉积，抑制病原菌的生存和扩展(Goy1992;Hammerschimidt1982)。5、 病原菌的攻击引起植物体内苯丙氨酸解氨酶PAL合成的变化，寄主感染时大量合成新的PAL,而且PAL的活性也增强。PAL是植保素和木质素合成的关键酶(董汉松1996)。6、在植物体内被诱发的萎蔫酸和Pyrieularin也在抗病反应中起重要作用。这些物质通过特别的代谢过程使病原菌的毒素变为无毒化合物(Koiwa1994;Koiwa1997)。讨论为了减少对苹果储藏过程中所造成的损失,我国广泛采用化学熏蒸药剂和化学保护,忽视了有害生物、贮藏环境、防治技术的有机体系,致使某些重要的病菌分化,出现再度猖撅,抗药性和农药残留问题日益突出。如苹果炭疽病菌对多菌灵和苯莱特的抗药性等(陈功夫等1993)但随着人们环境意识和健康意识不断增强,广大消费者对农产品多样、优质和安全的要求越来越高,单纯追求农产品数量己成为过去,在确保一定数量的前提下,向高品质、无害化发展则成为人们追求的目标。致谢在论文完成之际,我要特别感谢我的指导老师孙老师的热情关怀和悉心指导。在我撰写论文的过程中,孙老师倾注了大量的心血和汗水,无论是在论文的选题、构思和资料的收集方面,还是在论文的研究方法以及成文定稿方面,我都得到了孙老师悉心细致的教诲和无私的帮助,特别是他广博的学识、深厚的学术素养、严谨的治学精神和一丝不苟的工作作风使我终生受益,在此表示真诚地感谢和深深的谢意。在论文的写作过程中,也得到了许多同学的宝贵建议,同时还到许多在工作过程中许多同事的支持和帮助,在此一并致以诚挚的谢意。感谢所有关心、支持、帮助过我的良师益友。最后,向在百忙中抽出时间对本文进行评审并提出宝贵意见的各位专家表示衷心地感谢！参考文献陈策.1999.苹果轮纹病的研究进展.植物病理学报.29(3):193-198.陈功夫,张传伟,吴金成,史济华.1993.苹果炭疽病菌对多菌灵抗药性研究.果树科学.10(3):150-153.戴志宏.2006.苹果贮藏概.河北北方学院学报(自然科学版).22(6):33~35.董金皋.2001.农业植物病理学(北方版).北京:中国农业出版社.258~259.董汉松.1996.植物抗病防卫基因表达调控与诱导抗性遗传的机制.植物病理学报.26(4):289-293.焦文英.2008.苹果冷藏和自发气调相结合的贮藏技术.中国果菜.11(2):51~52.李保华,王彩霞,董向丽.2013.我国苹果主要病害研究进展与病害防治中的问题.植物保护.39(5):46~54.李宝聚，周长力，赵奎华，等.2001.黄瓜黑星病菌致病机理的研究III细胞壁降解酶和毒素对寄主超微结构的影响及其协同作用.植物病理学报.31(1):63-69.鲁仲新.2010.苹果炭疽病的侵染来源研究及防治药剂的筛选(硕士论文).陕西杨凌:西北农林科技大学.束怀瑞.1999.苹果学.北京：中国农业出版社.檀根甲.2009.采后苹果与炭疽菌的相互作用及病害控制机理研究(博士论文).安徽合肥:安徽农业大学.王晓鸣，李建义.1987.陕西省炭疽菌的研究.真菌学报.6(4):211~218.张敬泽，徐同.2005.柿树炭疽菌侵染不同柿树种、品种和部位的细胞学特征.菌物学报.24(1):116~122.薛莲.2005.采后苹果与炭疽菌互作的生理生化机制的研究(硕士论文).安徽合肥:安徽农业大学.张荣，王素芳，崔静秋，孙广宇.2009.陕、豫两省苹果炭疽病病原鉴定.中国农业科学.42(9):3224~3229.张维一,毕阳.1995.果蔬采后病害与控制.中国农业出版社.Alvarez,E.,Mejia,J.F.,andLlano,G.2005.CharacterizationofColletotrichumgloeosporioides,CausalAgentofAnthracnoseinSoursop(Annonamuricata)inValledelCauca,Colombia.PostpresentedatHighValueCropsMeeting:InternationalCenterforTropicalAgriculture(CIAT).156(10):421~422.Chung,W.H.,Ishii,H.,Nishimura,K.,Fukaya,M.,Yano,K.,andKajitani,Y.2006.FungicidesensitivityandphylogeneticrelationshipofanthracnosefungiisolatedfromvariousfruitcropsinJapan.PlantDisease.90(4):506~512.Clements,H.F.1985.MorphologyandphysiologyofthepomelenticelsofPyrusmalus.BotanicalGazette.97(3):101~117.Flaishman,M.A.,Kolattukudy,P.E.1994.Timingoffungalinvasionusinghost'sripeninghormoneasasignal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91:6579~6583.Gonzalez,E.,Sutton,T.B.,Correll,J.C.2006.ClarificationoftheetiologyofGlomerellaleafspotandbitterrotofapplecausedbyColletotrichumspp.basedonmorphologyandgenetic,molecular,andpathogenicitytests.Phytopathology.96(9):982~992.Goy,A.H.L.1992.ResistancetodiseaseinthehybridN.glutinosaisassociatedwithhighconstitutivelevelsof卩-l,3-glucanase,chitinase,PeroxidaseandPPO.Physiol.MolPlantPathol.41:11~21.Guerber,J.C.,Liu,B.,andCorrell,J.C.2003.CharacterizationofdiversityinColletotrichumacutatumsensulatobysequenceanalysisoftwogeneintrons,mtDNAandintronRFLPs,andmatingcompatibility.Mycologia.95(5):872~895.Gunnell,P.S.,Gubler,W.D.1992.TaxonomyandmorphologyofColletotrichumspeciespathogenictostrawberry.Mycologia.84(2):157~165.Hammerschimidt,R.1982.LiginificationasamechanismforinducedSARincucumber.Physiol.PlantPathol.60:61-71.Hammerschimidt,R.1982b.AssociationofenhancedperoxidaseactivitywithinducedsystemicresistanceofcucumbertoColletotrichumlagenarium.Physiol.PlantPathol.20:73-82.HammerschimidtR.1983.CellularLignificationasafactorinthehypersensitiveresistanceofwheattostemrust.Physiol.PlantPathol.22:209-220.Hunsley,D.1970.Theultrastructuralarchitectureofthewallsofsamehyphalfungi.JGeneralMicrobial.62:203-218.Koiwa,H.1994.CharacterizationofaccumulationoftobaccoPR-5ProteinsbyIEF-immunoblotanalysis.PlantCellPhysiol.35(5):821-827.Koiwa,H.1997.PurificationandcharacterizationoftobaccoPathogenesis-relatedProteinPR-5d,anantifungalthaumatine-likeProtein.PlantCellPhysiol.38(7):783-791.Kubo,Y.,Furusawa,I.1986.LoealizationofmelanininappressoriaofCoelltotrichumlagnarium.Can.J.Microbial.32:280~282.Kubo,Y.,Furusawa.1991.MelaninBiosynthesis:PrerequisiteforsuccessfulinvasionofthePlanthostbyappressoriaofChefungalsporeanddiseaseinitiationinplantandanimals.G.T.ColeandH.C.Hoch,eds.PlenumPreeNewyork.205~218.Lee,D.H.,Lee,S.W.,Choi,K.H.2006.SurveyontheoccurrenceofapplediseasesinKoreafrom1992to2000.PlantPathology.22(4):375~380.Martin,M.P.,Garcia-Figueres,F.1999.Col