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文档简介

实验五

宫颈癌HeLa细胞株培养二、培养基的配制一、实验目的熟练掌握RPMI1640培养基的配制方法。二、实验原理组织培养使用的培养基一般是由合成培养基和小牛血清配制而成。合成培养基有商品出售，它是根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状物质。其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其他辅助物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相似。小牛血清含有一定的营养成分，更重要的是它含有细胞生长所必需的生长因子、激素、贴附因子等，是合成培养基所无法替代的。此外它还能中和有毒物质的毒性。三、仪器、材料和试剂超净工作台微孔过滤器（0.22um）高压灭菌锅蒸馏水器磁力搅拌器天平超低温冰箱二氧化碳培养箱（一）仪器（二）用具、材料细胞培养瓶微量加样器250ml和125ml试剂瓶、量筒、离心管pH试纸培养细胞（三）试剂HCl、

NaOH、酚红RPMI1640干粉小牛血清、青霉素、链霉素、L-谷氨酰胺NaHCO3、胰酶三蒸水四、实验步骤（一）准备(清洗与灭菌）（二）合成培养基（RPMI1640）的配制

配制100mlRPMI1640母液：1、每4小组合称RPMI1640干粉1.04g，溶于100ml的3DW。2、置于搅拌器上搅拌40分钟，直到液体变为澄清为止。3、通入CO2，使液体变为金黄色，说明培养基完全溶好。4、溶好以后置于超净台中进行0.22um滤过除菌，分装至试剂瓶中。5、瓶口封好，-20℃或4℃贮存。（三）小牛血清的处理新买的新生小牛血清一定要灭活；将新生小牛血清不开封置于56℃水浴锅中30min,期间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。已灭活的血清贮存于4℃。（四）生长培养基的配制1．双抗：（100000u/ml）160万单位青霉素/瓶+8ml3DW=20万单位/ml1g链霉素+5ml3DW=200000ug/ml各取以上的液体5ml混合，使其浓度为10万单位/ml，0.22um过滤至1.5ml离心管，-20℃贮存。2．谷氨酰胺储备液（200mM）：

1.5g的谷氨酰胺溶于50ml3DW中（30mg/ml=200mM),0.22um过滤至1.5ml离心管中。-20℃贮存。注：200mM=200mmol/L（毫摩尔每升)3.饱和NaHCO3的配制每组称取10g的NaHCO3溶于200ml3DW中，过滤除菌后分装于50ml试剂瓶。4℃保存4.RPMI1640生长培养基的配制50毫升储备液浓度终浓度RPMI1640培养液

44——谷氨酰胺0.530mg/ml0.3mg/ml双抗0.05100000u/ml100u/ml小牛血清5—10%NaHCO3调pH至7.0六、实验报告写出各自配制试剂的步骤。叙述配制过程中所观察到的现象。

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