子宫颈鳞状上皮病变中HPV感染课件

病理新技术在子宫颈CIN的应用河南省人民医院病理科孔令非病理新技术在子宫颈CIN的应用河南省人民医院病理科1病理学新技术FISH原位杂交免疫组织化学生物传感器病理学新技术FISH2荧光原位杂交Fluorescenceinsituhybridization原理利用DNA碱基对的互补性，将直接标记了荧光的单链DNA(探针)和与其互补的目标样本的DNA(玻片上的标本)杂交,通过观察荧光信号在染色体上的位置反映相应染色体的情况FISH荧光原位杂交FISH3FISH操作样本预处理

脱蜡，脱水及水化，消化，探针、样本变性78℃探针＋样本杂交45-50℃杂交后洗涤结果观察FISH操作样本预处理4FISH探针种类CSP着丝粒探针GLP特异性位点探针染色体整臂探针FISH探针种类CSP着丝粒探针GLP特异性位点探针染色5FISH探针的类型

全染色体涂抹探针（WCP）染色体计数（着丝粒）探针（CSP）位点特异性探针（GLP）单色特异性探针双色分离重排探针双色双融合易位探针

FISH探针的类型全染色体涂抹探针（WCP）6IgHBcl2IGH/BCL2探针14（灰）号和18号（黑）染色体IgH基因Bcl-2基因杂交正常

异常融合基因扩增双色双融合易位探针(IGH/BCL2）IgHBcl2IGH/BCL2探针14（灰）号和18号（黑）7

FISH的特点操作简单检测快速结果易观察灵敏性和特异性高可检测样本种类多空间定位精确FISH的特点操作简单检测快速结果易观察8FISH检测在临床中的应用产前诊断血液病检测实体瘤检测FISH检测在临床中的应用产前诊断9端粒，端粒酶及作用端粒是真核细胞染色体末端的特殊NDA-蛋白结构，其DNA含大量TTAGGG重复序列，在进化中高度保守DNA酶不能复制线性DNA（端粒是线性DNA）大多数体细胞的端粒会随周期性复制而缩短，最终达到一个使染色体完整性丧失的临界点，细胞增殖停止；许多肿瘤细胞端粒酶活性增高，是肿瘤细胞增殖的关键步骤作用：保护染色体基因组免受降解或重组为染色体末端提供一种可消耗的非编码序列，以缓解或取消末端复制所带来的染色体DNA进行性缩短生殖细胞具有端粒酶活性，其端粒不随年龄增加而缩短，故成为永生细胞端粒，端粒酶及作用端粒是真核细胞染色体末端的特殊NDA-蛋白10端粒酶由RNA，DNA及蛋白质组成，本质是一种逆转录酶端粒酶活性决定于端粒酶RNA（humantelomeraseRNA,hTERC)和端粒酶催化亚单位(humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)hTERC是端粒长度稳定的直接因素保持端粒稳定、基因组完整、细胞长期有活性和潜在的继续增殖能力人端粒酶基因位于3q26.3，该基因的扩增可阻止细胞凋亡，导致肿瘤产生端粒酶由RNA，DNA及蛋白质组成，本质是一种逆转录酶11宫颈脱落细胞及组织学FISH探针CSP3TERChTERC基因定位于3q26.3

3号染色体着丝粒信号宫颈脱落细胞及组织学FISH探针CSP3TERChTERC基12AllthethreecentersobtainedsimilarlyincreasingtrendofhTERCpositiveratesaccordingtotheseverityofcervicallesions,forbothcytologicalresultsandpathologicaldiagnosis.Allthethreecentersobtained13中国8350例子宫颈病变TERC扩增TBS分级正常/炎症ASCUSASC-HLSILHSILTERC基因扩增发生率（%）4.613.528.625.287.7病理分级正常/炎症CIN1CIN2CIN3浸润癌TERC基因扩增发生率（%）4.2-10.626.865.483.193.5中国8350例子宫颈病变TERC扩增TBS分级正常/炎症AS14hTERC检测临床意义伴有hTERC基因扩增的癌前病变的病人有52%－96%的恶变可能。可预测CIN1/CIN2向CIN3发展的风险因素，其灵敏度是100%，特异性是70%.

FISH是早期诊断和风险预测的有效手段(AJPApril2005,Vol.166,No.4)hTERC检测临床意义伴有hTERC基因扩增的癌前病变的病人15hTERC基因检测在宫颈癌和宫颈癌前病变诊断中有重要价值魏丽惠，李亚里，吴瑞芳，陈忠，屠铮，江静，李静然北京大学人民医院妇科，北京，中国中国解放军总医院妇科，北京，中国北京大学深圳医院妇产科，深圳，中国犹他大学医学遗传学科，盐湖城，美国该研究显示，采用FISH技术检测hTERC基因扩增可在宫颈细胞学玻片上进行，具有无创性和客观性的特点，敏感度和特异度高，在宫颈癌和宫颈癌前病变的诊断中有重要价值。hTERC基因的异常扩增可能成为宫颈病变恶性进展的早期标记物。北京协和医院郎景和教授点评：在液基细胞学检查和检测人乳头状瘤病毒筛查宫颈癌的同时，检测hTERC基因，有望成为协助宫颈癌和宫颈癌前病变诊断及预测癌前病变是否向子宫颈癌发展的重要指标，而造福广大妇女。hTERC基因检测在宫颈癌和宫颈癌前病变诊断中有重要价值北京16细胞非典型性发育异常细胞癌变阻止细胞正常凋亡高危型HPV持续性感染人类染色体端粒酶基因(hTERC)扩增致癌基因E6/E7编码的原癌蛋白表达TERC基因的扩增可阻止细胞凋亡，导致肿瘤产生

P16表达E7结合RBE6结合p53细胞非典型性发育异常细胞癌变阻止细胞正常凋亡高危型HPV持续17随着宫颈病变级别增加，hTERC的阳性率增加hTERC阳性率正常或炎症组4.2-10.6%CIN1组26.8%

CIN2组69.23%CIN3组83.58%宫颈癌组95.65%正常及CIN1的hTERC基因阳性率明显低于CIN2及以上者，P<0.01

hTERC诊断CIN2或CIN2以上病变敏感度81.40%特异度95.04%阳性预测值70.00%阴性预测值97.29%

随着宫颈病变级别增加，hTERC的阳性率增加18子宫颈鳞状上皮病变中HPV感染课件19HumanPapillomaVirus(HPV)环状双链DNA病毒超过120种亚型其中的72种亚型可引起肛门及生殖器疾病Lowrisk(LR-HPV):6,11,40,42,44,54,61,70,72,81Highrisk(HR-HPV):16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,63,78,82HumanPapillomaVirus(HPV)环状双链20

HPV的生物学状态:游离或整合在HPV感染的早期或瞬间感染，HPV基因组以游离的环状DNA形式存在于宿主细胞核中。(CondylomaandCIN-1)持续的HPV感染，使其DNA整合进宿主DNA，标志着恶性转化。(CIN2＋lesions)HPV的生物学状态:游离或整合在HPV感染的早期或瞬间感21持续性的HPV感染几乎总是发生在两种上皮的交界处（宫颈移行带、肛门和口咽）HPV通过宫颈鳞腺交界处感染基底细胞或HPV通过微创伤直接感染基底细胞临床治疗需要破坏移行带，而不仅仅是病变本身持续性的HPV感染几乎总是发生在两种上皮的交界处（宫颈移行带22HPV检测及预后预测价值阴性预测价值(NPV)约~99%womennotinfectedwithHR-HPVhave<1%chancetohaveHSILlesion阳性预测价值(PPV)根据患者的年龄:<30:PPVisonly20%evenpersistentHPV>30:PPVgraduallyincreasedwithageandpersistentHPVinfectionHPV检测及预后预测价值阴性预测价值(NPV)约~99%23原为杂交法用标记的HPV探针在组织上或细胞上进行原位的杂交，并进行显色特异性最强敏感性高直观可结合组织学或细胞学形态探针有：6/11,16/18,31/33原为杂交法用标记的HPV探针在组织上或细胞上进行原位的杂交，24导流杂交法扩增所取样本的DNA放在固定好基因探针的基因芯片上（21种亚型包括13种高危亚型16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68及5种低危亚型6,11,42,43,44和3种中国人群常见的亚型53,66,CP8304型进行杂交探针标记Biotin及碱磷酶用NBT/BCIP进行显色结果呈蓝紫色导流杂交法扩增所取样本的DNA25判定标准－RLU/Cutoff

的比值≥1=阳性,50以内的数值对病情的严重程度并没有指示性，但>50的数值对病情的严重程度的估计有指导意义。＜1=阴性，表示未检出13种高危型HPVDNA序列或标本中不含有高危型HPVDNA序列，又或者其浓度水平在测定方法的检测限度以下，不能除外潜伏感染；如果接近但小于1.0且被怀疑有高危型HPV感染，应该重新采集标本。判定标准－RLU/Cutoff

的比值26HC-II的应用条件HPVtest不适用的情况：细胞学显示异型增生时年龄<30岁，除非细胞学显示ASC-US男性外生殖器HPVtest应用条件：ASC-US>30岁的女性,细胞学检查结合HPVtestHC-II的应用条件HPVtest不适用的情况：27HPV检测方法的比较原位杂交导流杂交基因捕获HC-II原理在原位进行HPVDNA的杂交提取DNA进行PCR，进行膜杂交DNA分解，DNA-RNA杂交，抗体捕获，特点组织学及细胞学涂片上原位显示分型HPV具体分型显示HPV,无病毒负荷的提示只显示高危病毒感染，不具体分型，可提示病毒的负荷敏感性及特异性敏感性+特异性+++敏感性+++特异性+敏感性+特异性++取材组织或细胞涂片阴道分泌物阴道分泌物HPV检测方法的比较原位杂交导流杂交基因捕获HC-II原理在28生物传感器技术24种HPV亚型，其中低危8种（6,11,40,42,43,44,54,70），高危16种（16,18,31,33,35,39,45,51,52,53,56,58,59,66,68,81）可检测HPV的载量子宫颈细胞中HPV的情况

单独感染混合感染（2、3，～6种HPV型）生物传感器技术24种HPV亚型，其中低危8种（6,11,29子宫颈鳞状上皮病变中HPV感染HPV检出率1(导流杂交）病毒种类1HR-HPV检出率2（HC-II)尖锐湿疣92%6,11,31,52低级别CIN89%16,31,18,52,33,6,1174.93%高级别CIN100%16,33,52,1891.72%鳞状上皮增生33%6,11,16,1843.29%1.北京军区总医院病理科2.解放军总医院妇产科子宫颈鳞状上皮病变中HPV感染HPV检出率1(导流杂交）病30CIN中需注意的问题CIN病变也可表现为鳞状上皮的表面上皮显著的不典型增生，而非基底层细胞，是CINI的病理基础CIN病变累及腺体一般：鳞状上皮CINIII，进一步向下发展延伸至腺体，但未突破基底膜少数：鳞状上皮CINII，腺体鳞化也呈CINII，这时为表达腺体的改变，诊断为CINII累及腺体个别：在腺体鳞化的基础上出现不典型增生，甚至出现的不典型增生的程度超过表面鳞状上皮CIN中需注意的问题CIN病变也可表现为鳞状上皮的表面上皮显31绝大多数的HPV感染可回退SpontaneousregressionSpontaneousregressionCancerHigh-grade

dysplasiaLow-gradedysplasiaSubclinicalHPVinfectionUSCases300,00011,0001,400,00030,000,000

HPVinfectionCervicalCancerSpontaneousregression绝大多数的HPV感染可回退SpontaneousSponta32持续性HPV感染导致CIN2-3

LSIL一般由瞬间HPV感染引起HSIL发生在那些持续性HR-HPV感染2年以上的患者大多数年轻的女性(<30yrs)的HPV感染为暂时性的，将被自体免疫系统清除HPV持续性感染一般发生在老年女性持续性HPV感染导致CIN2-3LSIL一般由瞬间HPV33HPV感染与机体免疫反应阴道分泌物的粘液抗微生物多肽，抗体，酸性环境及锌离子等组成第一道防线子宫颈鳞状上皮（复层上皮）形成天然屏障，组成第二道防线内在的非特异性免疫防御系统即炎症反应，构成第三道防线局部的细胞免疫监视，可启动接触性级连反应，放大传递信号，形成针对壳蛋白L1的特异性细胞免疫反应大多数的HPV感染细胞将成为HPVL1抗原递呈细胞；细胞毒T淋巴细胞和辅助T淋巴细胞可识别此细胞，并通过免疫监视和免疫清除杀灭细胞HPV感染与机体免疫反应阴道分泌物的粘液抗微生物多肽，抗体，34

CytoReact

用敏感的非同位素核酸杂交和免疫组织化学及免疫细胞化学的方法检测子宫颈细胞中HPVL1蛋白的存在，可用于细胞学涂片，组织学切片的检测。广谱的HPVL1抗体可识别大多数的HPVL1蛋白（6,11,16,18,31,33,42,51,52,56，58）。

CytoReact

用敏感的非同位素核酸杂交和免疫组织化学35基本原理特点多聚物微球结合非同位素标记HPVL1DNA探针与多聚酶混合物（固态杂交液）解链及杂交过程与抗原修复过程合并标记物为碱性磷酸酶，底物为AEC原为杂交与免疫组化反应颜色重叠，提高敏感性20-30倍可检测出0.01pgHPVL1蛋白细胞核阳性表达（核膜及核）基本原理特点多聚物微球结合非同位素标记HPVL1DNA探针与36HPVL1的存在表明HPV病毒感染处于游离状态或瞬时感染期HPVL1阳性与异常细胞学的回退密切相关在HPV(+)的病人中，HPVL1的缺失，提示存在HPV的持续感染，并有向高级别CIN发展的趋势特别有意义的是，在HR-HPV(+)的病人中，HPVL1阳性提示HPV以游离状态存在，发生高级别CIN的机率极低HPVL1检测的临床意义

HPVL1的存在表明HPV病毒感染处于游离状态或瞬时感染期37p16检测的意义p16是cyclin依赖性激酶抑制剂，抑癌基因，可抑制CDK4、CDK6活性，降低RB的磷酸化，增强RB的功能，抑制E2F-1的释放，从而抑制细胞周期E7结合RB，释放E2F-1，促使细胞周期E2F-1的聚集（RB的磷酸化的结果）导致p16的增加p16的高表达提示HPVE7的存在p16检测的意义p16是cyclin依赖性激酶抑制剂，抑癌基38小结CIN的发生及发展与HPV的感染直接相关HPV≠CINCIN=HPVCIN分为：CINI、II、III；TBS：Ascus,LSIL，HSIL临床常用的HPV检测方法（HC-II，导流杂交）阴道小环境的HPV感染状况间接代表子宫颈HPV感染状况不知HPV的生物学存在状况生物传感仪检测子宫颈组织和细胞中的HPV类型TERC基因扩增表明细胞的增殖活性增强，提示病变向恶性发展的原动力存在p16的检测可提示HR-HPV感染，并整合宿主DNA子宫颈组织和细胞中HPVL1检测阳性，提示机体免疫可清除HPV病毒感染细胞，使CIN病变向良性发展小结CIN的发生及发展与HPV的感染直接相关39液基薄层细胞制片技术真空负压吸引，膜式采集技术重力沉降技术离心沉降技术其他特点：标本保存时间长，更完整，结构更清晰细胞数量更多细胞平铺，不重叠更利于观察，不易漏观察可重复制片液基薄层细胞制片技术40应用范围：子宫颈细胞学检查体液细胞学检查（胸腔积液、腹腔积液、尿液、脑脊液及灌洗液等）分泌物细胞学检查（痰液）优势：明显提高阳性细胞检出率前提：具备丰富诊断经验的病理医师是关键国外细胞学医师需要获得医师资格证、病理医师资格证以后，再经过2-3年的专科培训才能从事细胞学诊断，并担负相应法律责任国内正在规范，从事细胞学诊断必须有医师资格证并注册到病理诊断应用范围：411988年，美国国家癌症研究所在马利兰州的Bethesda召开了病理细胞学会议，提出子宫颈细胞学报告的新分类，即Bethesda报告系统（TheBethesdaSystem,TBS）1988年，美国国家癌症研究所在马利兰州的Bethesda召42TheBethesdasystemforReportingCervicalCytology(TBS)根据2001年第三届国际Bethesda工作会议要求由著名细胞病理学家Solomon和Nayar编著是目前有关子宫颈细胞学分类和诊断标准中最新，最权威的该系统的3个基本原则：在不同病理学家及病理科必须是统一的，可重复的，并富有灵活性能反映对子宫颈肿瘤的最新认识能将病理的有关临床信息传递给患者TheBethesdasystemforReport43TBS的改变是基于临床的进展和对宫颈癌生物学行为研究的进展废弃“诊断(diagnosis)”，而使用“判读(interpretation)”或“结果(result)”一词病人的最终诊断及处理方案不仅依靠细胞学结果，还需整合病史、临床发现及其他实验室结果（ASCUS,HSIL)细胞学结果只是代表形成最终诊断的一个重要因素TBS的改变是基于临床的进展和对宫颈癌生物学行为研究的进展44子宫颈细胞学诊断标准的变迁20世纪40年代初，巴氏创建了子宫颈细胞学检查方法并提出巴氏分级报告系统(以癌为中心)20世纪50-70年代，认识了原位癌和不典型增生，并分为轻、中、重20世纪70年代，Richart提出子宫颈上皮内瘤变(CIN)，认为不典型增生的细胞在本质上与原位癌的细胞无差异，是同一疾病过程在上皮内连续的、不同程度的病变，两者有共同的病因、生物学特征和自然病程，具有演变为癌的潜能，为浸润癌的前期病变。子宫颈细胞学诊断标准的变迁20世纪40年代初，巴氏创建了子宫45子宫颈鳞状上皮病变中HPV感染课件46子宫颈鳞状上皮病变中HPV感染课件47TBS的问题TBS与TCT的关系？AUS-US的发现率？HPV，滴虫及霉菌检出阳性率低？TBS的问题TBS与TCT的关系？48HPVL1HPVCytologyTestHPVPrecancerCancer

子宫颈癌的预防策略Currently:Future??HPVDNATest

VaccineCytologyTestHPVL1HPVCytologyTestHPVPrec49谢谢！谢谢！50病理新技术在子宫颈CIN的应用河南省人民医院病理科孔令非病理新技术在子宫颈CIN的应用河南省人民医院病理科51病理学新技术FISH原位杂交免疫组织化学生物传感器病理学新技术FISH52荧光原位杂交Fluorescenceinsituhybridization原理利用DNA碱基对的互补性，将直接标记了荧光的单链DNA(探针)和与其互补的目标样本的DNA(玻片上的标本)杂交,通过观察荧光信号在染色体上的位置反映相应染色体的情况FISH荧光原位杂交FISH53FISH操作样本预处理

脱蜡，脱水及水化，消化，探针、样本变性78℃探针＋样本杂交45-50℃杂交后洗涤结果观察FISH操作样本预处理54FISH探针种类CSP着丝粒探针GLP特异性位点探针染色体整臂探针FISH探针种类CSP着丝粒探针GLP特异性位点探针染色55FISH探针的类型

全染色体涂抹探针（WCP）染色体计数（着丝粒）探针（CSP）位点特异性探针（GLP）单色特异性探针双色分离重排探针双色双融合易位探针

FISH探针的类型全染色体涂抹探针（WCP）56IgHBcl2IGH/BCL2探针14（灰）号和18号（黑）染色体IgH基因Bcl-2基因杂交正常

异常融合基因扩增双色双融合易位探针(IGH/BCL2）IgHBcl2IGH/BCL2探针14（灰）号和18号（黑）57

FISH的特点操作简单检测快速结果易观察灵敏性和特异性高可检测样本种类多空间定位精确FISH的特点操作简单检测快速结果易观察58FISH检测在临床中的应用产前诊断血液病检测实体瘤检测FISH检测在临床中的应用产前诊断59端粒，端粒酶及作用端粒是真核细胞染色体末端的特殊NDA-蛋白结构，其DNA含大量TTAGGG重复序列，在进化中高度保守DNA酶不能复制线性DNA（端粒是线性DNA）大多数体细胞的端粒会随周期性复制而缩短，最终达到一个使染色体完整性丧失的临界点，细胞增殖停止；许多肿瘤细胞端粒酶活性增高，是肿瘤细胞增殖的关键步骤作用：保护染色体基因组免受降解或重组为染色体末端提供一种可消耗的非编码序列，以缓解或取消末端复制所带来的染色体DNA进行性缩短生殖细胞具有端粒酶活性，其端粒不随年龄增加而缩短，故成为永生细胞端粒，端粒酶及作用端粒是真核细胞染色体末端的特殊NDA-蛋白60端粒酶由RNA，DNA及蛋白质组成，本质是一种逆转录酶端粒酶活性决定于端粒酶RNA（humantelomeraseRNA,hTERC)和端粒酶催化亚单位(humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)hTERC是端粒长度稳定的直接因素保持端粒稳定、基因组完整、细胞长期有活性和潜在的继续增殖能力人端粒酶基因位于3q26.3，该基因的扩增可阻止细胞凋亡，导致肿瘤产生端粒酶由RNA，DNA及蛋白质组成，本质是一种逆转录酶61宫颈脱落细胞及组织学FISH探针CSP3TERChTERC基因定位于3q26.3

3号染色体着丝粒信号宫颈脱落细胞及组织学FISH探针CSP3TERChTERC基62AllthethreecentersobtainedsimilarlyincreasingtrendofhTERCpositiveratesaccordingtotheseverityofcervicallesions,forbothcytologicalresultsandpathologicaldiagnosis.Allthethreecentersobtained63中国8350例子宫颈病变TERC扩增TBS分级正常/炎症ASCUSASC-HLSILHSILTERC基因扩增发生率（%）4.613.528.625.287.7病理分级正常/炎症CIN1CIN2CIN3浸润癌TERC基因扩增发生率（%）4.2-10.626.865.483.193.5中国8350例子宫颈病变TERC扩增TBS分级正常/炎症AS64hTERC检测临床意义伴有hTERC基因扩增的癌前病变的病人有52%－96%的恶变可能。可预测CIN1/CIN2向CIN3发展的风险因素，其灵敏度是100%，特异性是70%.

FISH是早期诊断和风险预测的有效手段(AJPApril2005,Vol.166,No.4)hTERC检测临床意义伴有hTERC基因扩增的癌前病变的病人65hTERC基因检测在宫颈癌和宫颈癌前病变诊断中有重要价值魏丽惠，李亚里，吴瑞芳，陈忠，屠铮，江静，李静然北京大学人民医院妇科，北京，中国中国解放军总医院妇科，北京，中国北京大学深圳医院妇产科，深圳，中国犹他大学医学遗传学科，盐湖城，美国该研究显示，采用FISH技术检测hTERC基因扩增可在宫颈细胞学玻片上进行，具有无创性和客观性的特点，敏感度和特异度高，在宫颈癌和宫颈癌前病变的诊断中有重要价值。hTERC基因的异常扩增可能成为宫颈病变恶性进展的早期标记物。北京协和医院郎景和教授点评：在液基细胞学检查和检测人乳头状瘤病毒筛查宫颈癌的同时，检测hTERC基因，有望成为协助宫颈癌和宫颈癌前病变诊断及预测癌前病变是否向子宫颈癌发展的重要指标，而造福广大妇女。hTERC基因检测在宫颈癌和宫颈癌前病变诊断中有重要价值北京66细胞非典型性发育异常细胞癌变阻止细胞正常凋亡高危型HPV持续性感染人类染色体端粒酶基因(hTERC)扩增致癌基因E6/E7编码的原癌蛋白表达TERC基因的扩增可阻止细胞凋亡，导致肿瘤产生

P16表达E7结合RBE6结合p53细胞非典型性发育异常细胞癌变阻止细胞正常凋亡高危型HPV持续67随着宫颈病变级别增加，hTERC的阳性率增加hTERC阳性率正常或炎症组4.2-10.6%CIN1组26.8%

CIN2组69.23%CIN3组83.58%宫颈癌组95.65%正常及CIN1的hTERC基因阳性率明显低于CIN2及以上者，P<0.01

hTERC诊断CIN2或CIN2以上病变敏感度81.40%特异度95.04%阳性预测值70.00%阴性预测值97.29%

随着宫颈病变级别增加，hTERC的阳性率增加68子宫颈鳞状上皮病变中HPV感染课件69HumanPapillomaVirus(HPV)环状双链DNA病毒超过120种亚型其中的72种亚型可引起肛门及生殖器疾病Lowrisk(LR-HPV):6,11,40,42,44,54,61,70,72,81Highrisk(HR-HPV):16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,63,78,82HumanPapillomaVirus(HPV)环状双链70

HPV的生物学状态:游离或整合在HPV感染的早期或瞬间感染，HPV基因组以游离的环状DNA形式存在于宿主细胞核中。(CondylomaandCIN-1)持续的HPV感染，使其DNA整合进宿主DNA，标志着恶性转化。(CIN2＋lesions)HPV的生物学状态:游离或整合在HPV感染的早期或瞬间感71持续性的HPV感染几乎总是发生在两种上皮的交界处（宫颈移行带、肛门和口咽）HPV通过宫颈鳞腺交界处感染基底细胞或HPV通过微创伤直接感染基底细胞临床治疗需要破坏移行带，而不仅仅是病变本身持续性的HPV感染几乎总是发生在两种上皮的交界处（宫颈移行带72HPV检测及预后预测价值阴性预测价值(NPV)约~99%womennotinfectedwithHR-HPVhave<1%chancetohaveHSILlesion阳性预测价值(PPV)根据患者的年龄:<30:PPVisonly20%evenpersistentHPV>30:PPVgraduallyincreasedwithageandpersistentHPVinfectionHPV检测及预后预测价值阴性预测价值(NPV)约~99%73原为杂交法用标记的HPV探针在组织上或细胞上进行原位的杂交，并进行显色特异性最强敏感性高直观可结合组织学或细胞学形态探针有：6/11,16/18,31/33原为杂交法用标记的HPV探针在组织上或细胞上进行原位的杂交，74导流杂交法扩增所取样本的DNA放在固定好基因探针的基因芯片上（21种亚型包括13种高危亚型16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68及5种低危亚型6,11,42,43,44和3种中国人群常见的亚型53,66,CP8304型进行杂交探针标记Biotin及碱磷酶用NBT/BCIP进行显色结果呈蓝紫色导流杂交法扩增所取样本的DNA75判定标准－RLU/Cutoff

的比值≥1=阳性,50以内的数值对病情的严重程度并没有指示性，但>50的数值对病情的严重程度的估计有指导意义。＜1=阴性，表示未检出13种高危型HPVDNA序列或标本中不含有高危型HPVDNA序列，又或者其浓度水平在测定方法的检测限度以下，不能除外潜伏感染；如果接近但小于1.0且被怀疑有高危型HPV感染，应该重新采集标本。判定标准－RLU/Cutoff

的比值76HC-II的应用条件HPVtest不适用的情况：细胞学显示异型增生时年龄<30岁，除非细胞学显示ASC-US男性外生殖器HPVtest应用条件：ASC-US>30岁的女性,细胞学检查结合HPVtestHC-II的应用条件HPVtest不适用的情况：77HPV检测方法的比较原位杂交导流杂交基因捕获HC-II原理在原位进行HPVDNA的杂交提取DNA进行PCR，进行膜杂交DNA分解，DNA-RNA杂交，抗体捕获，特点组织学及细胞学涂片上原位显示分型HPV具体分型显示HPV,无病毒负荷的提示只显示高危病毒感染，不具体分型，可提示病毒的负荷敏感性及特异性敏感性+特异性+++敏感性+++特异性+敏感性+特异性++取材组织或细胞涂片阴道分泌物阴道分泌物HPV检测方法的比较原位杂交导流杂交基因捕获HC-II原理在78生物传感器技术24种HPV亚型，其中低危8种（6,11,40,42,43,44,54,70），高危16种（16,18,31,33,35,39,45,51,52,53,56,58,59,66,68,81）可检测HPV的载量子宫颈细胞中HPV的情况

单独感染混合感染（2、3，～6种HPV型）生物传感器技术24种HPV亚型，其中低危8种（6,11,79子宫颈鳞状上皮病变中HPV感染HPV检出率1(导流杂交）病毒种类1HR-HPV检出率2（HC-II)尖锐湿疣92%6,11,31,52低级别CIN89%16,31,18,52,33,6,1174.93%高级别CIN100%16,33,52,1891.72%鳞状上皮增生33%6,11,16,1843.29%1.北京军区总医院病理科2.解放军总医院妇产科子宫颈鳞状上皮病变中HPV感染HPV检出率1(导流杂交）病80CIN中需注意的问题CIN病变也可表现为鳞状上皮的表面上皮显著的不典型增生，而非基底层细胞，是CINI的病理基础CIN病变累及腺体一般：鳞状上皮CINIII，进一步向下发展延伸至腺体，但未突破基底膜少数：鳞状上皮CINII，腺体鳞化也呈CINII，这时为表达腺体的改变，诊断为CINII累及腺体个别：在腺体鳞化的基础上出现不典型增生，甚至出现的不典型增生的程度超过表面鳞状上皮CIN中需注意的问题CIN病变也可表现为鳞状上皮的表面上皮显81绝大多数的HPV感染可回退SpontaneousregressionSpontaneousregressionCancerHigh-grade

dysplasiaLow-gradedysplasiaSubclinicalHPVinfectionUSCases300,00011,0001,400,00030,000,000

HPVinfectionCervicalCancerSpontaneousregression绝大多数的HPV感染可回退SpontaneousSponta82持续性HPV感染导致CIN2-3

LSIL一般由瞬间HPV感染引起HSIL发生在那些持续性HR-HPV感染2年以上的患者大多数年轻的女性(<30yrs)的HPV感染为暂时性的，将被自体免疫系统清除HPV持续性感染一般发生在老年女性持续性HPV感染导致CIN2-3LSIL一般由瞬间HPV83HPV感染与机体免疫反应阴道分泌物的粘液抗微生物多肽，抗体，酸性环境及锌离子等组成第一道防线子宫颈鳞状上皮（复层上皮）形成天然屏障，组成第二道防线内在的非特异性免疫防御系统即炎症反应，构成第三道防线局部的细胞免疫监视，可启动接触性级连反应，放大传递信号，形成针对壳蛋白L1的特异性细胞免疫反应大多数的HPV感染细胞将成为HPVL1抗原递呈细胞；细胞毒T淋巴细胞和辅助T淋巴细胞可识别此细胞，并通过免疫监视和免疫清除杀灭细胞HPV感染与机体免疫反应阴道分泌物的粘液抗微生物多肽，抗体，84

CytoReact

用敏感的非同位素核酸杂交和免疫组织化学及免疫细胞化学的方法检测子宫颈细胞中HPVL1蛋白的存在，可用于细胞学涂片，组织学切片的检测。广谱的HPVL1抗体可识别大多数的HPVL1蛋白（6,11,16,18,31,33,42,51,52,56，58）。

CytoReact

用敏感的非同位素核酸杂交和免疫组织化学85基本原理特点多聚物微球结合非同位素标记HPVL1DNA探针与多聚酶混合物（固态杂交液）解链及杂交过程与抗原修复过程合并标记物为碱性磷酸酶，底物为AEC原为杂交与免疫组化反应颜色重叠，提高敏感性20-30倍可检测出0.01pgHPVL1蛋白细胞核阳性表达（核膜及核）基本原理特点多聚物微球结合非同位素标记HPVL1DNA探针与86HPVL1的存在表明HPV病毒感染处于游离状态或瞬时感染期HPVL1阳性与异常细胞学的回退密切相关在HPV(+)的病人中，HPVL1的缺失，提示存在HPV的持续感染，并有向高级别CIN发展的趋势特别有意义的是，在HR-HPV(+)的病人中，HPVL1阳性提示HPV以游离状态存在，发生高级别CIN的机率极低HPVL1检测的临床意义

HPVL1的存在表明HPV病毒感染处于游离状态或瞬时感染期87p16检测的意义p16是cyclin依赖性激酶抑制剂，抑癌基因，可抑制CDK4、CDK6活性，降低RB的磷酸化，增强RB的功能，抑制E2F-1的释放，从而抑制细胞周期E7结合RB，释放E2F-1，促使细胞周期E2F-1的聚集（RB的磷酸化的结果）导致p16的增加p1