免疫原与抗血清制备技术

免疫原和抗血清制备技术第一节免疫原的制备第二节免疫血清的制备第三节抗体的纯化和鉴定第一节免疫原的制备一、细胞性抗原的制备二、可溶性抗原制备及鉴定三、半抗原免疫原的制备四、佐剂

绵羊红细胞的制备流程图摇动15-20min

4℃可保存3周取适量NS洗涤3次2000r/min10minNS稀释至2～5%

细菌细胞抗原的制备流程图液体培养或斜面培养37℃24h100℃水浴2～2.5h杀菌无菌试验NS稀释成8～10亿/mlO菌体抗原返回来源:组织和细胞，其成分比较复杂。1.组织和细胞成分混合抗原制备2.蛋白质抗原制备3.核酸抗原制备4.类脂多糖抗原制备5.免疫球蛋白片段制备6.纯化抗原的鉴定

二、可溶性抗原制备及鉴定可溶性抗原:蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、补体、脂多糖、细菌外毒素和核酸二、可溶性抗原制备及鉴定返回

组织和细胞成分混合抗原制备程序上清液澄清所用材料必须是新鲜或低温保存的去除包膜或结缔组织脏器进行灌洗洗去血迹及污物NS内含0.5g／LNaN2冷浴中组织剪碎装入捣碎机简内高速粉碎制成组织匀浆液3000r／min×10min取上清液去除细胞碎片及微小组织离心

细胞破碎技术及评价1.酶处理法2.冻融法3.超声破碎法4.表面活性剂处理细胞破碎技术及评价

常用酶类：溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等

1.酶处理法1.酶处理法方法：在一定的条件下，能消化细菌和组织细胞。

特点：①此法适用多种微生物；②具有作用条件温和；③内含物成分不易受到破坏；④细胞壁损坏的程度可以控制。

2.冻融法原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及胞内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。2.冻融法完方法：将待破碎的细胞置冰箱内冻结，然后缓慢融化，如此反复两次，大部分组织细胞及细胞内的颗粒可被融破。特点：此法适用于组织细胞，对微生物细胞作用较差。

3.超声破碎法原理：利用超声波的机械振动而使细胞破碎。由于超声波发生空化作用（cavitation）使得液体形成局部减压引起液体内部发生流动，漩涡生成与消失时，产生很大的压力，使细胞破碎。超声波使用的频率从1kHz～20kHz不等，间歇进行，避免长期超声产热，导致抗原破坏。3.超声破碎法特点：①操作简单，重复性较好，节省时间；②多用于微生物和组织细胞的破碎。4.表表面活活性剂剂处理理原理：：在适当当的温温度、、pH及低低离子子强度度的条条件下，，表面面活性性剂能能与脂脂蛋白白形成成微泡泡，使膜的的渗透透性改改变或或使之之溶解解。4.表表面活活性剂剂处理理常用的的有：：十二烷烷基硫硫酸钠钠(SDS,阴阴离子子型)、二乙胺胺十六六烷基基溴（（阳离离子型型）、、聚山山梨酯酯（非离离子型型）、、新洁洁尔灭灭等。。应用：：①破碎碎细菌菌，且且作用用比较较温和和；②提取取核酸酸时，，常用用此法法破碎碎细胞胞。蛋白质质抗原原制备备蛋白质质是良良好的的抗原原，要要制备备特异异性高高的抗血血清通通常需需要纯纯化。。可采采用：：1.超超速离离心法法2.选选择性性沉淀淀法3.凝凝胶层层析法法4.离离子交交换层层析法法5.亲亲合层层析法法蛋白质质抗原原制备备1．超超速离离心法法原理:利用各各颗粒粒在梯梯度液液中沉沉降速速度不不同，，使具有有不同同沉降降速度度的颗颗粒,处于于不同同密度度的梯度度层内内，达达到彼彼此分分离的的目的的。1．超超速离离心法法特点：：用超速速离心心或梯梯度密密度离离心法法纯化化抗原，极极难将将某一一抗原原成分分分离离出来来。应用：：用于少少部分分大分分子抗抗原和和一些些比较较轻的抗原原物质质的分分离，，如IgM、C1q、甲甲状腺腺球蛋白、、载脂脂蛋白白A、、B等等。2、选选择性性沉淀淀法原理：：根据各各蛋白白质理理化特特性的的差异异，采采用各种沉沉淀剂剂或改改变某某些条条件促促使蛋蛋白质质抗原原成分沉沉淀，，从而而达到到纯化化的目目的。。2、选选择性性沉淀淀法常用方方法：：盐析沉沉淀法法（不不同盐盐浓度度则溶溶解度不同同）；；常用用33～50％％饱和和度的的硫酸酸胺。。特点：：简单方方便，，纯度度不高高，粗粗提球球蛋白白。应用：：在大量量制备备中先先用此此法粗粗提，，再纯纯化。。3．凝凝胶层层析法法（凝凝胶过过滤法法）原理：：凝胶具具有三三维空空间多多孔网网状结结构的的物质质，经适当当溶液液平衡衡后，，装入入层析析柱。。当含含有各各种分子大大小不不一的的混合合物加加在凝凝胶床床面时时，大大分子物质质不能能进入入凝胶胶颗粒粒的网网孔结结构内内，在在凝胶颗粒粒之间间的空空隙中中很快快地通通过凝凝胶床床，短短时间内被被洗脱脱出来来；而而分子子较小小的物物质则则进入入凝胶网孔孔结构构内，，反复复受到到阻滞滞，洗洗脱较较慢。。分成大、、中、、小三三种类类型。。3．凝凝胶层层析法法（凝凝胶过过滤法法）4．离离子交交换层层析法法原理：：利用带带离子子基团团的纤纤维素素或凝凝胶，，吸附附交换换带相相反电电荷的的蛋白白质抗抗原。。各种种蛋白白质的的等电电点不不同，，所带带电荷荷不同同，与与纤维维素结结合的的能力力有差差别。。当梯梯度洗洗脱时时，逐逐步增增加流流动相相的离离子强强度，，使加加入的的离子子与蛋蛋白质质竞争争纤维维素上上的电电荷位位置置，从从而使使血清清中的的蛋白白质分分成γγ球蛋蛋白、、α球球蛋白白、ββ球蛋蛋白和和清蛋蛋白等等几个个部分分而被被洗脱脱下来来，达达到分分离纯纯化的的目的的。4．离离子交交换层层析法法5．亲亲和层层析法法（亲亲和色色谱））原理：：依据抗抗原抗抗体的的生物物学活活性进进行分分离和和提纯纯的技技术。。将纯纯化的的抗IgG附着于于惰性性的固固相基基质上上，制制成免免疫吸吸附层层析柱柱。当当样品品流过过此柱柱时，，待分分离的的IgG可选择择性地地与免免疫吸吸附剂剂上的的特异异性配配体(抗IgG)结合；；当改改变洗洗脱条条件可可重新新解离离，将将待分分离的的Ig洗脱下下来，，达到到纯化化的目目的。。优点：：提取纯纯度高高、抗抗原抗抗体不不失活活性。。5．亲亲和层层析法法（亲亲和色色谱））正常细细胞＋标记细细胞洗滴标记细细胞被酶裂裂解加入特特异性抗体体其它蛋蛋白洗涤流流失SDS分离蛋蛋白亲和层层析法法示意意图核酸抗抗原制制备大分子子的核核酸具具有免免疫原原性。。提取核核酸的的主要要步骤骤：核酸酸抗抗原原制制备备破碎碎细细胞胞核酸酸从从细细胞胞中中游游离离出出来来酸沉沉淀淀核核除去去蛋蛋白白质质乙醇醇酚和和氯氯仿仿类脂脂多多糖糖抗抗原原制制备备苯酚酚法法提提取取LPS：：干燥燥菌菌体体或或湿湿菌菌体体水中中混匀匀激烈烈搅搅匀匀加热热5min冰水水急冷冷降至至10℃℃以以下下离心心上层层的的水水层层(含含LPS)下层层的的酚酚层层菌体体残残渣渣于于底底部部吸取取水层层透析析除酚酚加热热超速速离离心心浓缩缩LPS在在上上层层沉沉淀淀的的透透明明胶胶状状部部内内绞出出悬于于水水中中离心心得纯纯化化LPS类脂脂多多糖糖抗抗原原制制备备同温温的的苯苯酚酚免疫疫球球蛋蛋白白片片段段制制备备1．．酶酶裂裂解解法法酶对对免免疫疫球球蛋蛋白白的的水水解解有有极极好好的专专一一性性，，不不同同的的酶酶可可将将免免疫疫球球蛋蛋白白裂裂解解为不不同同的的片片段段。。免疫疫球球蛋蛋白白片片段段制制备备2．．氧氧化化法法和和还还原原法法是将将免免疫疫球球蛋蛋白白轻轻、、重重链分分开开的的两两种种常常用用方方法法。。3.还可可用用强变变性性剂剂或利利用用改变变pH将免免疫疫球球蛋蛋白亚亚单单位位分分开开。。酶水水解解免免疫疫球球蛋蛋白白示示意意图图Fc段段，，用用以以制制备备抗抗重重链链血血清清F(ab’’)2，常常作作为为抗抗体体试试剂剂用用于于试试验验木瓜瓜蛋蛋白白酶酶（papain)胰蛋蛋白白酶酶(pepsin)胃蛋蛋白白酶酶(pepsin)1.氧氧化化法法：：优点点是是切切开开后后，，肽肽链链不不能能重重新新形成成二二硫硫键键、、便便于于肽肽链链纯纯化化；；缺点点是是色色氨氨酸酸侧侧链链容容易易被被破破坏坏。。氧化化法法和和还原原法法评评价价返回回2.还还原原法法：：将二二硫硫键键还还原原成成琉琉基基。。但但极极不不稳定定，，易易重重新新形形成成二二硫硫键键，，必必须须及及时时用用碘乙乙酸酸或或碘碘化化酰酰胺胺进进行行羧羧甲甲基基化化。。纯化化抗抗原原的的鉴鉴定定1.含含量量鉴鉴定定2.理理化化性性质质鉴鉴定定①凝凝胶胶层层析析技技术术测测定定②聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳③凝凝胶胶管管状状电电泳泳④超超速速离离心心3.纯纯度度鉴鉴定定常用用醋醋酸酸纤纤维维膜膜电电泳泳4.免免疫疫活活性性鉴鉴定定常用用双双向向琼琼脂脂扩扩散散试试验验纯化化抗抗原原的的鉴鉴定定蓝色色1．．含含量量鉴鉴定定在一一定定范范围围内内，，颜颜色色深深浅浅与与蛋蛋白白质质浓浓度度呈呈直直线线相相关关。。方法法：：酚酚试试剂剂法法鉴鉴定定主要要试试剂剂：：磷磷钼钼酸酸-钨钨酸酸的的混混合合酸酸原理理：：蛋白白质质中中的的酪酪氨氨酸酸、、半半胱胱氨氨酸酸、、色色氨氨酸酸等等能能钨酸酸、、钼钼酸酸还原原3H2OP205·13WO3·5MoO3·10H20和3H2P205·14WO3·4MoO3·10H20络合合物物的的双双缩缩脲脲法法蛋白白质质＋＋Ca2+碱性性加深深含量量鉴鉴定定蓝色色理化化性性质质鉴鉴定定已知知分分子子量量的的标标准准品品测未未知知分分子子量量：：将样样品品在在同同一一凝凝胶胶柱柱上上，，同同一一条条件下下层层析析、、洗洗脱脱、、测测保保留留体体积积，，并并查查出出分分子子量量。。此法法简简便便、、样样品品用用量量少少，，有有一一定定的的实实用用价价值值。。凝胶胶柱柱保留留体体积积分子子量量的的对对数数2.理理化化性性质质鉴鉴定定绘制制标标准准曲曲线线①凝凝胶胶层层析析技技术术进进行行测测定定垂直直电电泳泳聚合合成成大大分分子子凝凝胶胶②聚丙烯酰酰胺凝胶胶电泳（（PAGE）有分子筛筛效应、、电荷效效应及浓浓缩效应应，能精精确地分离离和鉴定定高分子子物质。。PAG的的分子筛筛效应测测定蛋白白质抗原原的分子子量。原理：双丙烯酰酰胺N,N-methylenebisacrylamide,Bis丙烯酰胺胺(acrylamide,Acr)催化剂3.纯纯度鉴定定方法：醋酸纤维维膜电泳泳进行鉴鉴定。返回纯度鉴定定原理：蛋白质在在一定pH下都都带有电电荷，由由于各种蛋白白质等电电点不同同、分子子量也异异，因此此所带电量量也各不不相同，，在外加加直流电电场的作作用下，它它们泳动动的速度度不同，，经一段段时间后后即可彼此此分开，，形成电电泳谱；；从而判判断蛋白白质抗原的的纯度。。特点：快速简便便。三、半抗抗原免疫疫原的制制备1.半抗抗原：低分子量量的化学学物质。。例如多多糖、多肽、甾甾族激素素、脂肪肪胺、类类脂质、、核苷、、某些药物物(包括括抗生素素）及其其他化学学物品等等。三、半抗抗原免疫疫原制备备2.载体体：蛋白质类类多肽聚合合物大分子聚聚合物3.半抗抗原-载载体连接接方法:载体类型型1.蛋白白质：人血清白白蛋白、、牛血清白白蛋白、兔血清白蛋蛋白、牛牛甲状腺腺球蛋白白等。载体类型型2.多肽肽聚合物物：人工合成成的，常常见的有有多聚赖赖氨酸，其其分子量量大（可可达十几几万到几几十万)，这种多聚聚物和半半抗原结结合后，，可刺激激免疫动动物产生高高效价、、高亲和和力的抗抗体。3.大聚聚合物：：羧甲基纤纤维素、、聚乙烯烯吡咯烷烷酮等，可与与半抗原原结合，，加入弗弗氏完全全佐剂亦亦可诱发动动物产生生抗体。。半抗原-载体连连接方法法1碳化二亚亚胺法：：R-NH=CH-R’’半抗原＋＋载体蛋蛋白质搅拌1～～2h室温24h透吸除去去未反应应的半抗抗原人工免疫疫原半抗原载载体连接接方法1混合混合半抗原-载体连连接方法法2戊二醛法法:半抗原-NH2载体蛋白白-NH2半抗原-N=CH-(CH2)3-CH=NH-载载体蛋白白OHC-(CH2)3-CHO*戊二醛醛是常用用的带有有两个活活性基团团的双功能联接接剂半抗原载载体连接接方法2半抗原-载体连连接方法法3氯甲酸异异丁脂法法：半抗原-COOH载体蛋白白-NH2Cl-COO-CH2CH(CH3)2半抗原-COO-COO-CH2CH(CH3)2半抗原-CO-NH-载体蛋白白半抗原载载体连接接方法3简便，用用于类固固醇抗原原制备HO-CH2CH(CH3)2＋半抗原-载体连连接方法法4琥珀酸酐酐法：用于不含含羧基衍衍生物半半抗原制制备半抗原原-CH2OHCH2-COCH2-CO带羧基基的半半抗原原琥珀珀酸衍衍生物物半抗原原-CH2-OOC-CH2-CH2-COOH返回吡啶再经氯氯甲酸酸异丁丁脂法法或碳碳化二亚胺胺法制制备载载体半半抗原原半抗原原载体体连接接方法法4四、佐佐剂*概概念：：与抗原原同时时或预预先注注射于于机体体，能能增加机体体免疫疫应答答或改改变免免疫应应答类类型的的物质质。四、佐佐剂条件：：①增加加抗原原的表表面积积；②改变变抗原原的活活性基基团构构型；；③佐剂剂与抗抗原混混合能能延长长抗原原在局局部组织的的存留留时间间；④可直直接或或间接接激活活免疫疫活性性细胞胞；⑤无毒毒性或或无副副作用用。（二））常用用佐剂剂的种种类和和制备备1.氢氢氧化化铝佐佐剂：：5%硫硫酸铝铝5%氢氢氧化化钠氢氧化化铝沉沉淀制成悬悬液即为佐佐剂强烈搅搅拌NS洗洗二次NS等体积积抗原原免疫接接种（二））常用用佐剂剂的种种类和和制备备2.明明矾佐佐剂10%硫酸酸钾铝铝氢氧化化钠校校正pH值值至6.5沉淀乳状悬悬液*明矾佐佐剂抗抗原常常用用用于肌肌肉注注射，，皮下下注射射易引起起肉芽芽种和和脓肿肿。NS搅搅拌NS洗洗二次离心抗原备用防腐剂剂作用大大于不不完全全佐剂剂局部形形成肉肉芽种种和溃溃疡不能用用于人人体弗氏完完全佐佐剂3.弗弗氏佐佐剂(Freundadjuvant)液体石石蜡完全乳乳化备用＋高压灭菌加热抗原弗氏不不完全全佐剂剂卡介苗苗羊毛脂脂鉴定一滴乳剂乳剂不不散浮浮于液液面水中混合4.佐佐剂应应用原原则和和评价价目的:①增强强抗原原对机机体的的免疫疫原性性；②增强强抗体体的产产生能能力；；③为制制备出出高效效价的的免疫疫血清清；④增强强可溶溶性抗抗原的的免疫疫原性性；⑤在某某种情情况下下，改改变Ag免免疫应应答类类型；；⑥延长长抗原原在免免疫动动物的的时间间；⑦改变变抗原原的分分布；；⑧增强强局部部对变变应原原的超超敏反反情况况；4.佐佐剂应应用原原则和和评价价应用佐佐剂的的缺点点①佐剂常常混有有微量量其它它物质质，这这些物物质进进入体内内后也也可引引起抗抗体的的产主主，影影响抗抗血清的的特异异性；；应用佐佐剂的的缺点点②注射佐佐剂可可引起起局部部形成成肉芽芽肿和和无菌菌性脓肿肿；③反复注注射，，易发发生超超敏反反应，，使局局部组组织坏死死，甚甚至引引起动动物死死亡。。第二节节免免疫疫血清清的制制备1.免免疫动动物选选择2.免免疫方方法3.动动物采采血法法4.免免疫血血清的的分离离及保保存一、免免疫动动物选选择能作免免疫接接种用用的动动物主主要是是哺乳乳类和和禽类类。兔、绵绵羊、、豚鼠鼠、鸡鸡、山山羊和和马。。一、免免疫动动物选选择1.抗抗原与与免疫疫动物物种属属差异异越远远越好好；2.动动物必必须适适龄、、健壮壮、无无感染染的正正常动动物、、体重合合乎要要求；；3.不不同动动物种种类对对同一一免疫疫原有有不同同的免免疫应答；；4.按按需要要量选选择大大小不不同的的动物物。二、免免疫方方法3.免免疫方方案①全量量免疫疫法：：弗氏氏佐剂剂抗原原多次次注射射②微量量免疫疫法：：卡介介苗7天弗氏佐佐剂1月抗原③混合合免疫疫法：：综合合皮下下、淋淋巴结结和静静脉二、免免疫方方法1.免免疫原原的注注射剂剂量2.免免疫途途径：：免疫疫反应应产生生速度度依次次为静静脉＞＞腹腔＞＞肌肉肉＞皮皮下＞＞皮内内＞淋淋巴结结＞足足掌三、动动物采采血法法1.颈颈动脉脉放血血法：：最常常用的的方法法2.心心脏采采血法法：要要求操操作熟熟练3.静静脉采采血法法：1.4℃保保存：：可保保存3～6个月月2.低低温保保存：：-20～～-40℃℃，可可保存存2～～3年年3.冰冰冻干干燥保保存：：可保保存3～5年三、动动物采采血法法四、免免疫血血清的的分离离和保保存第三节节抗抗体体的纯纯化和和鉴定定1.抗抗体特特异性性的纯纯化2.特特异性性IgG类类抗体体的纯纯化3.特特异性性抗体体的鉴鉴定一、抗抗体特特异性性的纯纯化1.亲亲合层层析法法：将交叉叉抗原原交联联到Sepharose4B上上，装装柱后后，将将预吸吸收的的抗体体通过过亲合合层析柱，，杂抗抗体吸吸附在在柱上上，流流出液液则是是特异异性抗体体。一、抗抗体特特异性性的纯纯化2.吸吸附法法：利用不不含特特异性性抗原原的抗抗原液液，直直接加到到免疫疫血清清中，，抗原原则与与抗体体结合合，上上清液则则为无无杂抗抗体的的单价价特异异性抗抗体。。二、特特异性性IgG类类抗体体的纯纯化1.盐盐吸沉沉淀法法：经硫酸酸铵盐盐吸提提取γγ球蛋蛋白3次，，基本本为IgG类抗抗体，，但不不纯。。二、特特异性性IgG类类抗体体的纯纯化2.A蛋白白亲和和层析析：SPA与IgG的Fc段段有很很强的的特异性性的亲亲和力力，细细菌表表面不不同位位点独独立地地与抗体体结合合，一一个A蛋白白至少少可以以结合合二个个IgG分子子。适适合纯纯化细细胞培培养上上清中中的McAb。。3.其其它：：凝胶过过滤、、离子子交换换层析析等三、特特异性性抗体体的鉴鉴定1.抗抗体效效价的的鉴定定：即为抗抗体活活性滴滴定三、特特异性性抗体体的鉴鉴定2.抗抗体特特异性性鉴定定：①细菌菌类抗抗原的的抗体体用凝凝集试试验②可溶溶性抗抗原的的抗体体用双双向琼琼脂扩扩散试试验3.抗抗体的的纯度度鉴定定：免疫电电泳分分析法法4.抗抗体亲亲和力力鉴定定：亲和力力高则则灵敏敏度好好第四节节单单克克隆抗抗体技技术单克隆隆抗体体：由B细细胞杂杂交瘤瘤产生生的只只识别别抗原原分子上上一种种抗原原决定定簇的的抗体体分子子。多克隆隆抗体体：识别抗抗原分分子上上各种种抗原原决定定簇的多种种抗体体的混混合制制剂。。一、杂杂交瘤瘤技术术的原原理及及流程程二、单单克隆隆抗体体的应应用返回一、杂交瘤瘤技术术的原原理及及流程程二、单单克隆隆抗体体的应应用1.医医学检检验试试剂：：①传染染病的的快速速诊断断②寻找找TSA及及检测测TAA③免疫疫细胞胞抗原原检测测④激素素测定定⑤血中中药物物浓度度监测测⑥HLA分分型监监测二、单单克隆隆抗体体的应应用2.导导向治治疗作作用3.抗抗原物物质的的分离离和提提纯9、静夜四无无邻，荒居居旧业贫。。。12月-2212月-22Thursday,December29,202210、雨雨中中黄黄叶叶树树，，灯灯下下白白头头人人。。。。03:52:3503:52:3503:5212/29/20223:52:35AM11、以我独沈沈久，愧君君相见频。。。12月-2203:52:3503:52Dec-2229-Dec-2212、故人人江海海别，，几度度隔山山川。。。03:52:3503:52:3503:52Thursday,December29,202213、乍见翻翻疑梦，，相悲各各问年。。。12月-2212月-2203:52:3503:52:35December29,202214、他乡生白白发，旧国国见青山。。。29十二二月20223:52:35上上午03:52:3512月-2215、比不不了得得就不不比，，得不不到的的就不不要。。。。十二月月223:52上上午午12月月-2203:52December29,202216、行行动动出出成成果果，，工工作作出出财财富富。。。。2022/12/293:52:3503:52:3529December202217、做前前，能能够环环视四四周；；做时时，你你只能能或者者最好好沿着着以脚脚为起起点的的射线线向前前。。。3:52:35上上午3:52上上午午03:52:3512月月-229、没有有失败败，只只有暂暂时停停止成成功！！。12月月-2212月月-22Thursday,December29,202210、很多事事情努力力了未必必有结果果，但是是不努力力却什么么改变也也没有。。。03:52:3503:52:3503:5212/29/20223:52:35AM11、成功就是是日复一日日那一点点点小小努力力的积累。。。12月-2203:52:3503:52Dec-2229-Dec-2212、世世间间成成事事，，不不求求其其绝绝对对圆圆满满，，留