流式细胞仪培训-课件

流式细胞术原理和应用张国平生物医学研究院心血管研究中心2009-6-4流式细胞术原理和应用张国平生物医学研究院心血管研究中心21主要内容流式细胞仪概述流式细胞仪的工作原理流式细胞仪的应用检测的一般步骤主要内容流式细胞仪概述2一、流式细胞仪概述一、流式细胞仪概述3流式细胞仪种类BDFACSVantageBD-CaliburEpicsAltra流式细胞仪种类BDFACSVantageBD-Calibu4EpicsAltraBeckmanCoulterEpicsAltraBeckmanCoult5流式细胞仪的定义流式细胞仪是指，使细胞（或其他粒子）以单个方式依次高速通过激发光束，采集细胞被光照时产生的各种信号，对信号进行处理，并对各参数进行关联分析的一种仪器。流式细胞仪的定义流式细胞仪是指，使细胞（或其他粒6利用流式细胞仪通过检测荧光信号来检测细胞或其它颗粒性物质（表面或胞浆或胞核）的物理、化学特性并通过这些特性对细胞或颗粒进行定量。

检测表面标记物检测胞浆标记物检测胞核内标记物检测可溶性蛋白流式细胞术（FLOWCYTOMETRY）利用流式细胞仪通过检测荧光信号来检测细胞或其它颗粒性7流式细胞仪的基本结构前向散射侧向散射流式细胞仪的基本结构前向散射侧向散射8流式细胞仪显微镜流动的细胞静止的细胞样本数量大数量少高速分选样本难以再利用细胞群体特征量分布可以揭示细胞内部结构信息特殊的显微镜流式细胞仪显微镜流动的细胞静止的细胞样本数量大数量少高速分选9高速测定细胞，大样本计数检测稀有细胞多参数分析自动化细胞分选流式细胞仪的主要特点高速测定细胞，大样本计数流式细胞仪的主要特点10二、流式细胞仪工作原理二、流式细胞仪工作原理11流式细胞仪工作原理流式细胞仪通常以激光作为激发光源，经过聚焦整形后的光束垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下产生散射光和激发荧光。这两种信号被光电二极管和光电倍增管接收，之后转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号，最后由计算机进行计算处理。流式细胞仪工作原理流式细胞仪通常以激光作为激发光源，经过聚焦12仪器基本组成流路流动室 鞘液SHEATH样本流SAMPLE单细胞悬液5105-1106个/ml光路光源滤片光电倍增管PMTHV电路放大电路HV及GAIN增益A/D转换统计

计算机仪器基本组成流路13流路InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid流动室流路InjectorFluorescencesignals14流式细胞仪光路图Air-cooledArgonIonLaserBeamShapingLensesHighSensitivityQuartzFlowCellForwardScatterDetectorSideScatterDetector525BPFL1(FITC)575BPFL2(PE)620BP

FL3(ECD)675BPFL4(PC5)488DL488BK550DL600DL645DL流动室流式细胞仪光路图Air-cooledArgonIonL15激光配置488nm氩离子激光器633nm氦氖激光器大功率水冷紫外激光器激光配置488nm氩离子激光器16光路-滤片特性长通滤片–允许长于设定波长的光通过短通滤片–允许短于设定波长的光通过带通滤片–允许一定带宽的波长通过当以

45o

角放置滤片时,该滤片可以通过一定波长的光,同时也可以阻断并折射该波长以下的光，这种方式的滤片称为二向色性滤片(dichroicfilter)630nmBandPassFilterWhiteLightSource光路-滤片特性长通滤片–允许长于设定波长的光通过617光信号收集光信号分离，导向，各探测通道PMT接收并转化为电信号。二色镜

123带通滤波片光电倍增管激光束细胞收集透镜前向散射光侧向散射光，荧光光信号收集光信号分离，导向，各探测通道PMT18数据处理FSCSSC

FL1FL2FL3对数

线性线性

线性

对数脉冲处理，模数转换光信号电信号记录数据，显示结果（面积，峰高，宽度）数据处理FSCSSCFL119颗粒度细胞大小流式细胞仪产生的信号非荧光信号颗粒度细胞大小流式细胞仪产生的信号非荧光信号20FL1–FITC,GFP…(PMT2)FL2–PE(PMT3)FL3–ECD,PI…(PMT4)FL4–PC5,APC…(PMT5)荧光信号FL1–FITC,GFP…(PMT2)荧光信号21细胞表面的抗原(或细胞膜受体)与相关的荧光抗体结合，形成带有荧光的抗原抗体复合物。通过流式细胞仪测定其荧光量，即可得到细胞群的不同抗原位点表达情况。原理细胞表面的抗原(或细胞膜受体)与相关的荧光抗体结合，形成带有22488nm空冷激光：FITC、PE、ECD、PC5、PI、7AAD、PerCP、EGFP、EYFP、AO、TO、Fluo3633nm空冷激光：APC、APC-CY7、CY590-4水冷激光：UV（333-364nm）HOECHST33342、DAPI…488nm空冷激光：633nm空冷激光：90-4水冷激光：23三、流式细胞仪应用三、流式细胞仪应用24流式细胞仪应用淋巴细胞免疫功能测定干细胞研究细胞增殖与凋亡检测细胞周期及倍体分析细胞活性分析细胞分选……流式细胞仪应用淋巴细胞免疫功能测定25淋巴细胞亚群活化的T淋巴细胞抗原特异性免疫细胞调控性T细胞树突状细胞先天免疫细胞细胞免疫功能测定淋巴细胞亚群细胞免疫功能测定26细胞群CD抗原

T细胞CD2CD3CD4CD5CD7CD8CD28CD38B细胞CD10CD19CD20-CD24CD37CD72-CD75髓系细胞CD13CD14CD15-CD17CD33CD34CD35NK细胞CD16CD56CD57CD94血小板CD31CD41CD42aCD42bCD61CD62pCD63激活抗原CD26CD30CD69CD95-CD97粘附分子CD11a-cCD18CD29CD44CD49a-f内皮细胞CD105CD106CD109细胞因子受体CD25CD115CD117CD122CD126CD抗原及其相关细胞群细胞群CD抗原27淋巴细胞亚群数量检查项目和意义疾病CD3CD4CD8CD4/CD8NK自身免疫病降低增高降低降低AIDS降低严重降低增高降低SARS降低降低降低降低降低慢性活动性肝炎、肝硬化降低正常或增高降低降低肿瘤降低降低增高降低降低淋巴细胞亚群数量检查项目和意义疾病CD3CD4CD8CD4/28用荧光标记抗体抗体特异性地结合细胞上对应的抗原表达该抗原的细胞被标记上荧光；抗原表达多的细胞荧光强度强阳性细胞百分比或浓度靶蛋白浓度用荧光标记抗体抗体特异性地结合细胞上对应的抗原表达该抗原的细29淋巴细胞CD抗原的流式细胞检测淋巴细胞CD抗原的流式细胞检测30造血系统干细胞肿瘤干细胞间充质干细胞神经干细胞脂肪干细胞…………干细胞研究造血系统干细胞干细胞研究31热门研究－(肿瘤)干细胞肿瘤组织无限制的增殖在于肿瘤干细胞的存在目前研究的肿瘤干细胞来源于前列腺、乳腺等肿瘤肿瘤干细胞数量稀少，常规方法很难检测目前研究发现，肿瘤干细胞和正常细胞在HOECHEST33342染料摄取方面有重大差别故流式细胞仪是分析和检测肿瘤干细胞的重要工具热门研究－(肿瘤)干细胞肿瘤组织无限制的增殖在于肿瘤干细胞的32干细胞能表达ABCG2泵蛋白，在HOECHST33342染色时能将该染料泵出，因此分析不能被该染料染色的细胞群时可以发现一群不能染色的细胞既是干细胞，因此能够在众多肿瘤细胞中区分出肿瘤干细胞。肿瘤干细胞中的研究应用

-Hoechst33342sidepopulation干细胞能表达ABCG2泵蛋白，在HOECHST333433HoechstHoechst+Vera.SidePopulationCellsHoechstHoechst+Vera.SidePopul34细胞凋亡研究1.鉴别凋亡与坏死:AnnexinⅤ/PI2.测定凋亡率:AnnexinⅤ、Apo2·7、TUNEL3.研究凋亡触发机制：Caspase、Fas及FasLbcl-2/bax4.多参数分析凋亡是趋势细胞凋亡研究1.鉴别凋亡与坏死:AnnexinⅤ/PI35流式细胞仪培训-课件36G1SphaseG2MG1121DNA含量

DNA含量细胞周期时相G0/1G2/MS细胞数细胞周期分析G1SphaseG2MG1121DNA37PIEthidiumBromideAcridineOrangeDAPI(UVexcitable)Hoechst33342(viable,UVexcitable)不能主动进入细胞，需要固定打孔488nm激发为脂溶性，主动进入细胞UV激发常用的DNA染料PI不能主动进入细胞，需要固定打孔为脂溶性，主动进入细胞常用38DNA含量及细胞周期分析细胞周期分析:在细胞周期(G0，G1，S，G2，M)的各个时期，DNA的含量随各时相呈现出周期性的变化。通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%，S%及G2/M%。了解细胞的周期分布及细胞的增殖活性。也可利用细胞周期蛋白（CYCLIN）、Ki67、核增殖抗原（PCNA）等，对细胞周期进行精确的分期：G0、G1、S、G2、M.DNA含量及细胞周期分析细胞周期分析:在细胞周期(G039G0/G1SG2/MG0/G1SG2/M40流式细胞仪分选电荷式分选是当前的主流分选模式高速分选是保证结果的基本条件高纯度和高活性是分选的基本要求可选的激光要多样化（空冷、水冷、固体；不同的波长；真正的紫外）提供多种分选流动室光路稳定，紫外激光功率大流式分选和磁珠分选的差别和联系流式细胞仪分选电荷式分选是当前的主流分选模式41488nmlaser+-ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector电荷式细胞分选488nmlaser+-ChargedPlatesSi42细胞分选的主要技术指标分选速度：≧25000个细胞/秒分选纯度：﹥98%分选后细胞存活率：97%细胞分选的主要技术指标分选速度：≧25000个细胞/秒43BeforeSortingAfterSortingBeforeSortingAfterSorting44三、流式细胞仪检测的一般步骤三、流式细胞仪检测的一般步骤45设置检测方案（PROTOCOL)染色标本（同型对照，补偿管，检测抗体）同型对照管调电压电压不变，补偿管调补偿电压不变，补偿不变，上检测管检测后直接阅读结果检测的一般步骤设置检测方案（PROTOCOL)检测的一般步骤46电压调节－利用同型对照：设置背景电压volts增益Gain设定阴性和阳性信号强度的临界点电压调节－利用同型对照：设置背景电压volts设定阴性和阳47荧光补偿Needtodowhenwemeasuresignalsfrommorethan1fluorescence.FITC520BPPE575BP荧光补偿Needtodowhenwemea484ColorSingleLaser(488nm)

FITC/PE/ECD/PC54ColorSingleLaser(488nm)

F49补偿PEFITCPE+cellsFITC+cellsTodocolourcompensation:ForPureFITC+cells,=PEsignal-%FITCsignalForPurePE+cells,=FITCsignal-%PEsignalAftercompensationPEFITCPE+cellsFITC+cellsGOODcompensation:Y-meanoftheFITCcell=theY-meanof-/-cellsX-meanofthePEcell=theX-meanof-/-cellsPEFITCPE+cellsFITC+cellsOVERcompensation补偿PEFITCPE+cellsFITC+cell50流式细胞仪培训-课件51淋巴细胞单核细胞中性粒细胞如何看流式图淋巴细胞单核细胞中性粒细胞如何看流式图52流式细胞仪培训-课件53流式细胞仪培训-课件54PI＋Annexin－V细胞凋亡检测PIAnnexin-VPI＋Annexin－V细胞凋亡检测PIAnnexin-V55G0/G1SG2/MG0/G1SG2/M56ThankyouThankyou57流式细胞术原理和应用张国平生物医学研究院心血管研究中心2009-6-4流式细胞术原理和应用张国平生物医学研究院心血管研究中心258主要内容流式细胞仪概述流式细胞仪的工作原理流式细胞仪的应用检测的一般步骤主要内容流式细胞仪概述59一、流式细胞仪概述一、流式细胞仪概述60流式细胞仪种类BDFACSVantageBD-CaliburEpicsAltra流式细胞仪种类BDFACSVantageBD-Calibu61EpicsAltraBeckmanCoulterEpicsAltraBeckmanCoult62流式细胞仪的定义流式细胞仪是指，使细胞（或其他粒子）以单个方式依次高速通过激发光束，采集细胞被光照时产生的各种信号，对信号进行处理，并对各参数进行关联分析的一种仪器。流式细胞仪的定义流式细胞仪是指，使细胞（或其他粒63利用流式细胞仪通过检测荧光信号来检测细胞或其它颗粒性物质（表面或胞浆或胞核）的物理、化学特性并通过这些特性对细胞或颗粒进行定量。

检测表面标记物检测胞浆标记物检测胞核内标记物检测可溶性蛋白流式细胞术（FLOWCYTOMETRY）利用流式细胞仪通过检测荧光信号来检测细胞或其它颗粒性64流式细胞仪的基本结构前向散射侧向散射流式细胞仪的基本结构前向散射侧向散射65流式细胞仪显微镜流动的细胞静止的细胞样本数量大数量少高速分选样本难以再利用细胞群体特征量分布可以揭示细胞内部结构信息特殊的显微镜流式细胞仪显微镜流动的细胞静止的细胞样本数量大数量少高速分选66高速测定细胞，大样本计数检测稀有细胞多参数分析自动化细胞分选流式细胞仪的主要特点高速测定细胞，大样本计数流式细胞仪的主要特点67二、流式细胞仪工作原理二、流式细胞仪工作原理68流式细胞仪工作原理流式细胞仪通常以激光作为激发光源，经过聚焦整形后的光束垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下产生散射光和激发荧光。这两种信号被光电二极管和光电倍增管接收，之后转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号，最后由计算机进行计算处理。流式细胞仪工作原理流式细胞仪通常以激光作为激发光源，经过聚焦69仪器基本组成流路流动室 鞘液SHEATH样本流SAMPLE单细胞悬液5105-1106个/ml光路光源滤片光电倍增管PMTHV电路放大电路HV及GAIN增益A/D转换统计

计算机仪器基本组成流路70流路InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid流动室流路InjectorFluorescencesignals71流式细胞仪光路图Air-cooledArgonIonLaserBeamShapingLensesHighSensitivityQuartzFlowCellForwardScatterDetectorSideScatterDetector525BPFL1(FITC)575BPFL2(PE)620BP

FL3(ECD)675BPFL4(PC5)488DL488BK550DL600DL645DL流动室流式细胞仪光路图Air-cooledArgonIonL72激光配置488nm氩离子激光器633nm氦氖激光器大功率水冷紫外激光器激光配置488nm氩离子激光器73光路-滤片特性长通滤片–允许长于设定波长的光通过短通滤片–允许短于设定波长的光通过带通滤片–允许一定带宽的波长通过当以

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角放置滤片时,该滤片可以通过一定波长的光,同时也可以阻断并折射该波长以下的光，这种方式的滤片称为二向色性滤片(dichroicfilter)630nmBandPassFilterWhiteLightSource光路-滤片特性长通滤片–允许长于设定波长的光通过674光信号收集光信号分离，导向，各探测通道PMT接收并转化为电信号。二色镜

123带通滤波片光电倍增管激光束细胞收集透镜前向散射光侧向散射光，荧光光信号收集光信号分离，导向，各探测通道PMT75数据处理FSCSSC

FL1FL2FL3对数

线性线性

线性

对数脉冲处理，模数转换光信号电信号记录数据，显示结果（面积，峰高，宽度）数据处理FSCSSCFL176颗粒度细胞大小流式细胞仪产生的信号非荧光信号颗粒度细胞大小流式细胞仪产生的信号非荧光信号77FL1–FITC,GFP…(PMT2)FL2–PE(PMT3)FL3–ECD,PI…(PMT4)FL4–PC5,APC…(PMT5)荧光信号FL1–FITC,GFP…(PMT2)荧光信号78细胞表面的抗原(或细胞膜受体)与相关的荧光抗体结合，形成带有荧光的抗原抗体复合物。通过流式细胞仪测定其荧光量，即可得到细胞群的不同抗原位点表达情况。原理细胞表面的抗原(或细胞膜受体)与相关的荧光抗体结合，形成带有79488nm空冷激光：FITC、PE、ECD、PC5、PI、7AAD、PerCP、EGFP、EYFP、AO、TO、Fluo3633nm空冷激光：APC、APC-CY7、CY590-4水冷激光：UV（333-364nm）HOECHST33342、DAPI…488nm空冷激光：633nm空冷激光：90-4水冷激光：80三、流式细胞仪应用三、流式细胞仪应用81流式细胞仪应用淋巴细胞免疫功能测定干细胞研究细胞增殖与凋亡检测细胞周期及倍体分析细胞活性分析细胞分选……流式细胞仪应用淋巴细胞免疫功能测定82淋巴细胞亚群活化的T淋巴细胞抗原特异性免疫细胞调控性T细胞树突状细胞先天免疫细胞细胞免疫功能测定淋巴细胞亚群细胞免疫功能测定83细胞群CD抗原

T细胞CD2CD3CD4CD5CD7CD8CD28CD38B细胞CD10CD19CD20-CD24CD37CD72-CD75髓系细胞CD13CD14CD15-CD17CD33CD34CD35NK细胞CD16CD56CD57CD94血小板CD31CD41CD42aCD42bCD61CD62pCD63激活抗原CD26CD30CD69CD95-CD97粘附分子CD11a-cCD18CD29CD44CD49a-f内皮细胞CD105CD106CD109细胞因子受体CD25CD115CD117CD122CD126CD抗原及其相关细胞群细胞群CD抗原84淋巴细胞亚群数量检查项目和意义疾病CD3CD4CD8CD4/CD8NK自身免疫病降低增高降低降低AIDS降低严重降低增高降低SARS降低降低降低降低降低慢性活动性肝炎、肝硬化降低正常或增高降低降低肿瘤降低降低增高降低降低淋巴细胞亚群数量检查项目和意义疾病CD3CD4CD8CD4/85用荧光标记抗体抗体特异性地结合细胞上对应的抗原表达该抗原的细胞被标记上荧光；抗原表达多的细胞荧光强度强阳性细胞百分比或浓度靶蛋白浓度用荧光标记抗体抗体特异性地结合细胞上对应的抗原表达该抗原的细86淋巴细胞CD抗原的流式细胞检测淋巴细胞CD抗原的流式细胞检测87造血系统干细胞肿瘤干细胞间充质干细胞神经干细胞脂肪干细胞…………干细胞研究造血系统干细胞干细胞研究88热门研究－(肿瘤)干细胞肿瘤组织无限制的增殖在于肿瘤干细胞的存在目前研究的肿瘤干细胞来源于前列腺、乳腺等肿瘤肿瘤干细胞数量稀少，常规方法很难检测目前研究发现，肿瘤干细胞和正常细胞在HOECHEST33342染料摄取方面有重大差别故流式细胞仪是分析和检测肿瘤干细胞的重要工具热门研究－(肿瘤)干细胞肿瘤组织无限制的增殖在于肿瘤干细胞的89干细胞能表达ABCG2泵蛋白，在HOECHST33342染色时能将该染料泵出，因此分析不能被该染料染色的细胞群时可以发现一群不能染色的细胞既是干细胞，因此能够在众多肿瘤细胞中区分出肿瘤干细胞。肿瘤干细胞中的研究应用

-Hoechst33342sidepopulation干细胞能表达ABCG2泵蛋白，在HOECHST333490HoechstHoechst+Vera.SidePopulationCellsHoechstHoechst+Vera.SidePopul91细胞凋亡研究1.鉴别凋亡与坏死:AnnexinⅤ/PI2.测定凋亡率:AnnexinⅤ、Apo2·7、TUNEL3.研究凋亡触发机制：Caspase、Fas及FasLbcl-2/bax4.多参数分析凋亡是趋势细胞凋亡研究1.鉴别凋亡与坏死:AnnexinⅤ/PI92流式细胞仪培训-课件93G1SphaseG2MG1121DNA含量

DNA含量细胞周期时相G0/1G2/MS细胞数细胞周期分析G1SphaseG2MG1121DNA94PIEthidiumBromideAcridineOrangeDAPI(UVexcitable)Hoechst33342(viable,UVexcitable)不能主动进入细胞，需要固定打孔488nm激发为脂溶性，主动进入细胞UV激发常用的DNA染料PI不能主动进入细胞，需要固定打孔为脂溶性，主动进入细胞常用95DNA含量及细胞周期分析细胞周期分析:在细胞周期(G0，G1，S，G2，M)的各个时期，DNA的含量随各时相呈现出周期性的变化。通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%，S%及G2/M%。了解细胞的周期分布及细胞的增殖活性。也可利用细胞周期蛋白（CYCLIN）、Ki67、核增殖抗原（PCNA）等，对细胞周期进行精确的分期：G0、G1、S、G2、M.DNA含量及细胞周期分析细胞周期分析:在细胞周期(G096G0/G1SG2/MG0/G1SG2/M97流式细胞仪分选电荷式分选是当前的主流分选模式高速分选是保证结果的基本条件高纯度和高活性是分选的基本要求可选的激光要多样化（空冷、水冷、固体；不同的波长；真正的紫外）提供多种分选流动室光路稳定，紫外激光功率大流式分选和磁珠分选的差别和联系流式细胞仪分选电荷式分选是当前的主流分选模式98488nmlaser+-ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector电荷式细胞分选4