HLA分型技术-课件

HLA分型技术HLA分型技术1Variation>1%atasinglegeneticlocusinapopulationofindividualsEachpolymorphicvariantiscalledanalleleInthehumanpopulation,over1,695MHCalleleshavebeenidentifiedababab3559231263481DRDPDQClassII851506276ABCNoofpolymorphismsClassIDatafrom

http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla

July2007PolymorphismintheMHCVariation>1%atasinglegene2Polymorphicresiduesarelocatedintheantigen-bindinggroove—VariationinaminoacidsequenceschangestheshapeofthegroovePolymorphicresiduesarelocat3HLA分型概述方法比较

血清学分型细胞学分型基因分型PCR-RFLPPCR-SSCPPCR-SSOPCR-SSP

应用移植配型疾病相关性研究法医学HLA分型概述方法比较应用4PCR-SSP检测HLA-B27

一、实验目的

掌握HLA基因分型的原理，学习PCR-SSP基因分型方法。二、实验原理

编码HLA的基因具有高度的多态性，每一个基因座位上有众多的复等位基因，而每一个等位基因都有其各自的DNA序列，因此可用相应的序列特异性引物（sequencespecificprimers，SSP）进行扩增。通过控制PCR反应条件，特异性引物仅扩增与其相应的等位基因，而不扩增其他的等位基因。

PCR-SSP检测HLA-B27一、实验目的5EveryHLAallelehasitsownuniquesequencesEveryHLAallelehasitsownu6Specificsequenceprimer(SSP)isdesignedtobindtotheallelicsequencescomplementarily

Specificsequenceprimer(SSP)7SequencespecificprimerisusedtotypeHLAallelewithPCRSequencespecificprimerisus8SequencespecificprimerisusedtotypeHLAallelewithPCRSequencespecificprimerisus9实验步骤

PCR扩增琼脂糖凝胶电泳抽提DNA

实验步骤PCR扩增琼脂糖凝胶电泳抽提DNA10三、实验材料和方法

1、血样：0.2mlEDTA抗凝血2、红细胞裂解液3、白细胞裂解液4、PCR混合液PCRbufferHLA-B27SSPTaqdNTPinternalpositivereferenceprimers三、实验材料和方法11HLA-B27检测操作流程一、DNA的提取1、取1mlRBC裂解液入血样管中混匀，裂解RBC;2、离心4000rpm×1min;3、重复步骤1-2两次，最后用棉签吸干管壁液体；4、取40ul白细胞裂解液（SDS,ProteinaseK)入上述WBC管中混匀；5、将WBC管于60oC水浴消化20min；6、取出WBC管再于100oC，3-5min，灭活蛋白酶K；7、离心10000rpm×2min。上清即为富含DNA的PCR模板。HLA-B27检测操作流程一、DNA的提取12二、PCR扩增1、吸2ul模板DNA入装有PCR混合液的小管中（注意不要加到石蜡油层）；2、将小管置于PCR仪内进行扩增。（需80min）

×12×23

预变性：94oC2min

变性：94

oC

20sec

复性：67

oC30sec

延伸：72

oC30sec

变性：94

oC20sec

复性：60

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延伸：72

oC30sec

HLA-B27扩增程序二、PCR扩增×12×23预变性：94oC13三、电泳检测

吸PCR产物10ul加到2%琼脂糖凝胶孔内；将琼脂糖凝胶板置电泳槽内电泳160V×20min后取出，观察结果。三、电泳检测14四、结果观察

四、结果观察15SpecificbandscanbeseenwithHLA-B27(+)samples

Specificbandscanbeseenwit16HLA分型技术HLA分型技术17Variation>1%atasinglegeneticlocusinapopulationofindividualsEachpolymorphicvariantiscalledanalleleInthehumanpopulation,over1,695MHCalleleshavebeenidentifiedababab3559231263481DRDPDQClassII851506276ABCNoofpolymorphismsClassIDatafrom

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July2007PolymorphismintheMHCVariation>1%atasinglegene18Polymorphicresiduesarelocatedintheantigen-bindinggroove—VariationinaminoacidsequenceschangestheshapeofthegroovePolymorphicresiduesarelocat19HLA分型概述方法比较

血清学分型细胞学分型基因分型PCR-RFLPPCR-SSCPPCR-SSOPCR-SSP

应用移植配型疾病相关性研究法医学HLA分型概述方法比较应用20PCR-SSP检测HLA-B27

一、实验目的

掌握HLA基因分型的原理，学习PCR-SSP基因分型方法。二、实验原理

编码HLA的基因具有高度的多态性，每一个基因座位上有众多的复等位基因，而每一个等位基因都有其各自的DNA序列，因此可用相应的序列特异性引物（sequencespecificprimers，SSP）进行扩增。通过控制PCR反应条件，特异性引物仅扩增与其相应的等位基因，而不扩增其他的等位基因。

PCR-SSP检测HLA-B27一、实验目的21EveryHLAallelehasitsownuniquesequencesEveryHLAallelehasitsownu22Specificsequenceprimer(SSP)isdesignedtobindtotheallelicsequencescomplementarily

Specificsequenceprimer(SSP)23SequencespecificprimerisusedtotypeHLAallelewithPCRSequencespecificprimerisus24SequencespecificprimerisusedtotypeHLAallelewithPCRSequencespecificprimerisus25实验步骤

PCR扩增琼脂糖凝胶电泳抽提DNA

实验步骤PCR扩增琼脂糖凝胶电泳抽提DNA26三、实验材料和方法

1、血样：0.2mlEDTA抗凝血2、红细胞裂解液3、白细胞裂解液4、PCR混合液PCRbufferHLA-B27SSPTaqdNTPinternalpositivereferenceprimers三、实验材料和方法27HLA-B27检测操作流程一、DNA的提取1、取1mlRBC裂解液入血样管中混匀，裂解RBC;2、离心4000rpm×1min;3、重复步骤1-2两次，最后用棉签吸干管壁液体；4、取40ul白细胞裂解液（SDS,ProteinaseK)入上述WBC管中混匀；5、将WBC管于60oC水浴消化20min；6、取出WBC管再于100oC，3-5min，灭活蛋白酶K；7、离心10000rpm×2min。上清即为富含DNA的PCR模板。HLA-B27检测操作流程一、DNA的提取28二、PCR扩增1、吸2ul模板DNA入装有PCR混合液的小管中（注意不要加到石蜡油层）；2、将小管置于PCR仪内进行扩增。（需80min）

×12×23

预变性：94oC2min

变性：94

oC

20sec

复性：67

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延伸：72

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变性：94

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复性：60

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延伸：72

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