1-工具酶汇总课件

第一章工具酶(Enzymes)第一章工具酶(Enzymes)本章主要内容限制性内切酶甲基化酶DNA聚合酶其他分子克隆工具酶本章主要内容限制性内切酶限制与修饰(restrictionanmodification)限制性内切酶识别的序列限制性内切酶产生的末端末端长度对切割的影响位点偏爱(sitepreferences)酶切反应条件星星活性(staractivity)单链DNA的切割1.1限制性内切酶限制与修饰(restrictionanmodificat1.1.1限制与修饰50年代初，发现寄主控制的专一性(

hostcontrolledspecificity)，噬菌体在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时受到限制。E.coliKE.coliBE.coliCK110-41B10-411C10-410-411.1.1限制与修饰50年代初，发现寄主控制的专一性(h说明K和B菌株中存在一种限制系统(restrictionsystem),可排除外来的DNA;10-4的存活率是由宿主修饰系统作用的结果;甲基化：AN6甲基-腺膘呤

C5’甲基-胞嘧啶说明K和B菌株中存在一种限制系统(restrictions1.1.2限制性内切酶1970年美国约翰·霍布金斯大学H.Smith偶然发现流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）能迅速降解外源的噬菌体DNA(phageDNA),其细胞提取液可降解E.coliDNA,但不能降解自身DNA，即HindII酶。识别位点5’...GTPyPuAC...3’3’…CAPuPyTG...5’GTCGACGTTAACGTCAACGTTGACYR1.1.2限制性内切酶1970年美国约翰·霍布金斯大学限制酶的命名宿主：属名第一字母、种名头两个字母菌株或生物型号序号：罗马字

EcoRIG↓AATTCHindIIIA↓AGCTT限制酶的命名宿主：属名第一字母、种名头两个字母EcoR依据亚单位(subunit)组成、识别序列(recognitionsequence)的种类和是否需要辅助因子(cofactor)分类；RestrictionEnzymes3744种TypeI1%（既修饰又切割）TypeII93%（回文序列）TypeIIs5%（非分文序列）TypeIII<1%（识别和切割位点相距较远）限制修酶的分类依据亚单位(subunit)组成、识别序列(recognittypeII（93%）识别回文序列(palindromicsequence)，一般4-6bp，但有少数酶识别更长的序列或简并序列(degeneratesequence)；在回文序列内部或附近切割，切割位置因酶而异，产生带3’-OH和5’-P基团的DNA的产物；需Mg2+typeII（93%）识别回文序列(palindromitypeIIs（5%）识别位点(recognitionsite)非对称，4-7bp；切割位点可能在识别位点一侧20bp范围内；与typeII具有相同的辅助因子(cofactor)要求。typeIIs（5%）识别位点(recognitiontypeI（1%）R酶和M酶，另外还有负责识别DNA序列的S亚基，各作为一个亚基存在于酶分子中；分别由hsdR，hsdM，hsdS基因编码，属于同一操纵子(operon)（转录单位）；EcoK，R2M2S；EcoB，R2M4S2typeI（1%）R酶和M酶，另外还有负责识别DNA序列识别位点(recognitionsite)EcoBTGA*(N)8TGCTA*EcoKAA#C(N)6GTGCA#*甲基化位点；#可能的甲基化位点切割位点1000bp以外，无特异性识别位点(recognitionsite)typeIII(<1%)如EcoP1，EcoP15识别位点：AGACC，CAGCAG切割位点：下游24-26bp处typeIII(<1%)如EcoP1，EcoP151.1.3限制性内切酶识别的序列识别长度识别结构切割位点1.1.3限制性内切酶识别的序列识别长度识别长度4：Sau3AIGATC5：EcoRIICCWGGW=AorT

NciICCSGGS=CorG6：EcoRIGAATTC

HindIIIAAGCTT7：BbvCICCTCAGC

PpuMI

RGGWCCY8：NotIGCGGCCGC

识别长度4：Sau3AIGATC回文对称(palindrome)EcoRIGAATTCCTTAAGHindIIIAAGCTTTTCGAA识别结构回文对称(palindrome)识别结构非回文对称(non-symmetria)AccBSICCGCTCGGCGAGBssSICTCGTGGAGCAC多识别序列(degeneratesequence)AccIGTMKACHindIIGTYRAC非回文对称(non-symmetria)间断对称(interruptedsymmetria)AlwNICAGNNNCTGDdeICTNAG间断对称(interruptedsymmetria)简并碱基代表字母R=AorG

Y=CorTM=AorC

K=GorTS=CorG

W=AorTH=AorCorTB=CorGorTV=AorCorGD=AorGorTN=AorCorGorT简并碱基代表字母R=AorG切割位置内部两端EcoRIICCWGG

GGWCCSau3AIGATCCTAGNlaIIICATG

GTAC切割位置内部两侧10(N)CGA(N)6TGC(N)1212(N)GCT(N)6ACG(N)10NNCASTGNNNNGTSACNNTspRIBcgI两侧TspRIBcgI切割概率4Nt=44=2566Nt=46=4096即当识别序列(recognitionsequence)为4个或6个碱基时，它们可识别的序列在完全随机的情况下，平均每256个和4096个碱基会出现一个识别序列。切割概率1.1.4限制性内切酶产生的末端粘性末端(cohesiveends)5’突出末端EcoRIGAATTCCTTAAG…NNGAATTCNN……NNCTTAAGNN…3’突出末端KpnI

GGTACC

CCATGG1.1.4限制性内切酶产生的末端粘性末端(cohesiv平端(Bluntend)在对称轴上同时切割DNA的两条链HaeIIIGG↓CCEcoRVGAT↓ATCXmnIGAANN↓NNTTC非对称突出端非对称识别序列

BbvCICCTCAGCGGAGTCG简并序列间隔序列

DraIIICACNNNGTG平端(Bluntend)同裂酶(isoschizomer)识别相同序列的限制酶称同裂酶同序同切(同功酶)HindIIHincII

GTY/RACHpaIIHapII

C/CGGMobISau3AI

/GATC同序异切KpnIGGTAC/CAcc65IG/GTACCAsp718IG/GTACC同尾酶(Isocaudiners)平端(bluntend)

部分同裂酶(isoschizomer)同裂酶(isoschizomer)EcoRI

GAATTCMfeI

CAATTGApoI

RAATTYSpeI

ACTAGTNheI

GCTAGCXbaI

TCTAGABamHIGGATCCSau3AIGATCEcoRIGAATTCBamH1.1.5末端长度对切割的影响限制酶待切序列酶切活性(%)２h20hAccICCGGTCGACCGG00HindIIICAAGCTTGCCAAGCTTGGCCCAAGCTTGGG00150075EcoRIGGAATTCC>90>90PstIGCTGCAGCTGCACTGCAGTGCAAACTGCAG(N)14CTGCAG(N)20010>900010>9001.1.5末端长度对切割的影响限制酶待切序列酶切活性(%)1-工具酶汇总课件因此，在双酶切多克隆位点(multiplecloningsite)时，选择合适的酶切秩序；在设计PCR引物引入酶切位点时，应在位点之外引入所要求的碱基数，一般在末端另加4个；具体参照NEB操作手册。因此，在双酶切多克隆位点(multiplecloning1.1.6位点偏爱(sitepreference)某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割(preferenceincistion)；1975，EcoRI切割

phage(Lambda)中的5个位点，并不是随机的，靠近右端的位点，比分子中间的位点切割快10倍；1976，EcoRI在腺病毒2(adenovirus-2)DNA中的切割速率不同。1.1.6位点偏爱(sitepreference)某些1.1.7酶切反应条件pH：7.0-7.9(at25℃)，Tris-HCl，乙酸；离子强度：NaCl，高（100mM）、中（50mM）、低（０）；Mg2+

：10mMMgCl2orMgAc；DTT(dithiothreitol，二硫苏糖醇)：1mM；100g/mlBSA，少数需要。每一种酶都有其最适的反应条件，请参考产品说明书！1.1.7酶切反应条件pH：7.0-7.9(at25℃双酶切策略选用都合适的缓冲液或通用缓冲液；当缓冲液不可替代时：先低盐缓冲液再高盐缓冲液（DNA可纯化或不纯化）双酶切策略选用都合适的缓冲液或通用缓冲液；1-工具酶汇总课件注意事项取少量酶最后加酶、尽快操作减少反应体积延长反应时间分装保存注意事项取少量酶反应温度大多数为37℃一部分为50-65℃少数25-30℃反应终止EDTA终浓度10mM

加热65℃（80℃）20min反应温度大多数为37℃1.1.8星星活性(staractivity)在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性(staractivity)；实际上星星活性(staractivity)是限制性内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点。1.1.8星星活性(staractivity)在极端非标引起星星活性的因素

高甘油(glycerin)浓度（>5%）酶过量（>100U/l）低离子强度（<25mM）高pH(>8.0)有机溶剂：PMSD(二甲基亚砜)、乙醇(ethanol)、乙二醇(glycol)、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺dimethylformamide）和sulphalane等用其它二价阳离子如Mn２+、Cu２+

、Co２+或Zn２+代替Mg２+引起星星活性的因素

高甘油(glycerin)浓度（>5%）星星活性的抑制减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度保证反应体系中无有机溶剂或乙醇提高离子强度到100～150mM(在不抑制酶活性的前提下)降低反应pH至7.0使用Mg2+作为二价阳离子星星活性的抑制减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度1.1.9单链DNA的切割HinP1I,HhaI,MnlI，50％HaeIII，10%BstNI,DdeI,HgaI,HinfI,TaqI，1％AluI,BbvI,DpnI,FnuDII,FokI,HpaII,HphI,MobI,MobII,MspI,Sau3AI,SfaNI，不切割1.1.9单链DNA的切割HinP1I,HhaI,Mn1.1.10影响酶活性的因素“外因”底物的纯度“内因”sitepreference甲基化(methylation)底物的构象:切割cccDNA和linearDNA时表现的差异，与切割λDNA相比，EcoRI、PstI、SalI

需要至少5倍的酶来切割pBR322的I型DNA。1.1.10影响酶活性的因素“外因”1.1.11酶切位点在基因组中分布的不均一性基因组中，碱基对的排列是非均匀的，因此尽管GC含量相同的酶切位点，在基因组中出现的机率是不一样的。在E.coli中,酶切位点出现的平均长度AscI(GGCGCGCC)20kbNotI(GCGGCCGC)200kbEcoRI/HindIII5kbSpeI(ACTAGT)60kb1.1.11酶切位点在基因组中分布的不均一性基因组中，碱基细菌基因组(bacteriagenome)

在大多数富含A+T的细菌中，CCG和CGG的排列是最少见的，所以含有这两种序列的识别序列出现的机率就非常少；酵母基因组(yeastgenome)G+C%为38%，因此富含G+C的识别序列特别少；哺乳动物

G+C为41%，其中CG的序列比想象的低5倍之多，因此含CG序列的酶切位点在哺乳动物细胞相当稀少。而且在哺乳动物细胞中，大多数CG序列是甲基化的。细菌基因组(bacteriagenome)1.2甲基化酶（Methylase）真核生物(eukaryote)和原核生物(prokaryote)中存在大量的甲基化酶；原核生物的甲基化酶作为修饰系统，保护自身的DNA不被相应的限制酶切割；大肠杆菌有三种甲基化酶Dam甲基化酶Dcm甲基化酶EcoKI甲基化酶1.2甲基化酶（Methylase）真核生物(eukaryDam甲基化酶识别GATC，在腺嘌呤N6位置引入甲基(methyl)；PvuII、BamHI、BclI、BglII、XhoII、MboI、Sau3AI的识别位点中含GATC序列；ClaI(1/4)、XbaI(1/16)、TaqI(1/16)、MboII(1/16)、HphI(1/16)的部分识别序列含GATC序列，4个ClaI位点(ATCGATN)中有一个该序列；BclI、ClaI、MboI和XbaI受甲基化影响；BamHI、Sau3AI、BglII和PvuI等不受甲基化影响；一般哺乳动物DNA，不会在A-N6上甲基化。Dam甲基化酶识别GATC，在腺嘌呤N6位置引入甲基(metDcm甲基化酶识别CCAGG或CCTGG序列，在第二个C上C5位置上引入甲基；EcoRII/BstNI，CCA(T)GG，二者识别序列相同，但切点不同，EcoRII受dcm甲基化作用影响，BstNI可避免这一影响；受影响的酶：Acc65I、AlwNI、ApaI、EcoRII、EaeI不受影响的酶：KpnI、BanII、Bg1I、BstNI、NarI

Dcm甲基化酶识别CCAGG或CCTGG序列，在第二个C上CEcoKI甲基化酶识别AAC(N)6GTGC,在N6位置甲基化TTG(N)6CACG识别位点少(1/8kb)研究较少，而dam（1/256bp）dcm(1/512bp)EcoKI甲基化酶识别AAC(N)6GTGC,在N6位置甲SssI甲基化酶来自原核生物螺原体（Spiroplasma），可在CG序列中的C在C5位置上甲基化，又称CG甲基化酶；许多酶对此甲基化敏感，如AatII、ClaI、XhoI、SalI等；不敏感的有BamHI、EcoRI、SphI和KpnI。SssI甲基化酶来自原核生物螺原体（Spiroplasma）甲基化对限制酶切的影响修饰酶切位点TCGA中的A甲基化后，GTCGAC将不受HincII切割；构建DNA文库(DNAlibrary)时，用AluI(AG↓CT)和HaeⅢ(GG↓CC)部分消化基因组DNA，用甲基化酶处理，然后加上合成的EcoRI接头，当再用EcoRI来切割时只有接头上的位点可被切割。产生新的酶切位点TCGATCGAAGCTAGCT

TaqITaqITCGA*TCGA**AGCT*AGCTDpnI甲基化对限制酶切的影响修饰酶切位点1.3DNA聚合酶真核DNApolymeraseDNA聚合酶αDNA聚合酶δDNA聚合酶εDNA聚合酶γDNA聚合酶β原核DNApolymeraseI：一条多肽链，可催化单链或双链DNA的延长；II：一条多肽链，与低分子脱氧核苷酸链的延长有关；III：多聚酶，是促进DNA链延长的主要酶。1.3DNA聚合酶真核DNApolymeraseE.coliDNApolymeraseI5’→3’DNA聚合酶活性

Mg2+

、dNTPDNApolyI5’→3’外切核酸酶活性

Mg2+

DNApolyI+dNTP降解RNA:DNA中的RNA

(RNaseH活性)E.coliDNApolymeraseI5’→3’DN3’→5’外切酶活性

Mg2+

DNApolyI+dNTP3’→5’外切酶活性Mg2++dNTPDNApolymeraseI的用途切口平移法(nicktranslation)标记DNA

Mg2+，低限量DNaseIdNTP，DNApolyI若有放射性dNTP，则可标记成探针(probe)DNApolymeraseI的用途切口平移法(nick用于cDNA克隆中的第二链

即单纯的DNA聚合活性，但由于有5’---3’外切活性，已不再使用，而改用Klenow酶和反转录酶(reversetranscriptase)末端标记（endlabeling）（交换或置换反应）

Mg2+,DNApolyI[-P32]dATPA*TT4DNApolyT7DNApoly更好用于cDNA克隆中的第二链Mg2+,DNApolyIAKlenow酶DNApolymeraseI经蛋白酶（proteinase)（枯草杆菌蛋白酶）裂解,从全酶中除去5’—3’外切活性片段，而聚合活性和3’—5’外切活性不受影响，大小为76kDa；通过基因工程也可以构建得到；作用与DNApolymeraseI相似。Klenow酶DNApolymeraseI经蛋白酶（prT4DNApolymerase来源于T4phage感染的E.coli，114kDa；与Klenow酶相似，但3’--5’外切活性强200倍;用途补平或标记3’凹端，必须有高浓度dNTP（末端标记）置换反应：必须有高浓度dNTP(一种)末端标记T4DNApolymerase来源于T4phage感染T7噬菌体DNA聚合酶来源于T7phage感染的E.coli,为两种紧密结合的蛋白质复合体（噬菌体基因5蛋白和宿主的硫氧还蛋白）；与Klenow酶相似，但3’--5’外切活性强1000倍;T7DNApoly为持续合成能力最强的一个，产物平均长度要大得多，在测序时具有优势。用途:替代T4DNApoly的功能长模板的引物延伸(primerextension)T7噬菌体DNA聚合酶来源于T7phage感染的E.col反转录酶依赖于RNA的DNA聚合酶，5’→3’合成DNA，无3’→5’外切活性；来自禽成髓细胞瘤病毒（AMV），鼠白血病病毒（Mo-MLV）；AMV二链多肽(62kDa/94kDa)，同时具很强的RNaseH活性。因此，在反应开始时，引物(primer)和mRNA模板(template)杂交体可成为RNaseH的底物，此时，模板的降解和cDNA的合成相竞争；Mo-MLV单肽，84kDa，RNaseH活性弱，利于合成较长的cDNA。反转录酶依赖于RNA的DNA聚合酶，5’→3’合成DNA，末端转移酶来源于小牛胸腺，存在于前淋巴细胞(prolymphocyte)及分化早期的类淋巴样细胞内的一种不寻常的DNA聚合酶；在二价阳离子存在下，末端转移酶(terminaltransferase)催化dNTP加于DNA分子的3’羟基端；TorC→首选Co2+AorG→首选Mg2+末端转移酶来源于小牛胸腺，存在于前淋巴细胞(prolymph底物DNA，可短至3个核苷酸，3’突出低离子强度时，5’突出或平端DNA亦可，但效率低用途在3’端加同聚尾，cDNA或载体(vector)，用于克隆(clone)或标记(label)末端标记ddNTP底物同聚尾的长度

37℃15min随时间的延长尾亦长。同聚尾的长度37℃15min随时间的延长尾亦1.4其他分子克隆工具酶RNA聚合酶来源于噬菌体(phage)感染宿主后所产生SP6噬菌体RNA聚合酶，来源于感染鼠伤寒沙门氏菌LT2菌株；T4或T7噬菌体RNA聚合酶，来源于感染的大肠杆菌（E.coli）。活性这些RNA聚合酶实际上为转录过程中RNA合成的酶，识别DNA中特异的启动子序列，并沿此dsDNA模板起始RNA的合成。与DNA聚合酶不同，无需引物(primer)，但识别特异性位点。1.4其他分子克隆工具酶RNA聚合酶RNA聚合酶的用途体外(invitro)将这些RNA聚合酶特异性的启动子安装在载体中，如pGEM-3Z载体(2.74kb、p13)中，用于体外转录外源DNA；体内(invivo)将T7RNA聚合酶基因置于lacUV5启动子之下，插入到噬菌体DE3中，感染E.coli，整合于染色体的BL21处。将T7噬菌体启动子控制的目的基因经质粒导入该宿主菌中，在IPTG诱导下，启动外源基因的表达。RNA聚合酶的用途体外(invitro)1-工具酶汇总课件连接酶(Ligase)T4DNAligase68kDa，T4噬菌体感染大肠杆菌产生催化DNA5’磷酸基与3’羟基之间形成磷酸二酯键底物：DNAorRNA(效率低)

粘端(matchedend)、切口(nick)、平端(bluntend)10%PEG(聚乙二醇)，单价阳离子（150-200mMNaCl）提高平端连接速率。条件16℃－4hr；4℃－overnight，

需ATP连接酶(Ligase)T4DNAligaseE.coliDNAligase与T4DNAligase相似，但需烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸(NAD+)参与；平端连接效率低，不将RNA连接到DNA，不连接RNA。TaqDNAligase连接dsDNA中的缺口作用于45℃～65℃，需NAD+T4RNAligase催化ssDNA或RNA的5’-磷酸与3’羟基之间形成共价连接E.coliDNAligase核酸酶(nuclease)BAL31核酸酶来源于AlteromonasespejianaBAL31主要活性为3’外切核酸酶活性，可从线性DNA两条链的3’端去除单核苷酸；具有内切核酸酶活性，切除单链DNA;依赖Ca2+，EDTA可抑制其活性用途：从两头缩短DNA(用于缺失突变等）核酸酶(nuclease)BAL31核酸酶Sl核酸酶来源于米曲霉(Aspergillusoryzae)降解单链DNA或RNA对dsDNA，dsRNA，DNA:RNA不敏感酶量大可完全消化双链，中等酶量可在切口(nick)或小缺口(gap)处切割双链用途：去掉突出的单链尾，以产生平端打开dsDNA合成中产生的发荚环Sl核酸酶来源于米曲霉(Aspergillusoryzae绿豆核酸酶来源于绿豆芽与Slnuclease相似，但比Sl更温和核糖核酸酶A来源于牛胰，内切核酸酶；可特异攻击RNA上嘧啶残基的3’端；用途：除去DNA样品中的RNA除去DNA:RNA中未杂交的RNA区绿豆核酸酶来源于绿豆芽核糖核酸酶A来源于牛胰，内切核酸酶；DNaseI来源于牛胰，内切酶，可优先从嘧啶核苷酸的位置水解dsorssDNA；Mg2+：独立作用于每条DNA链，切割位点随机；Mn2+：两条链的大致同一位置切割dsDNA，产生平端或1-2个核苷酸突出；用途：切口平移(nicktranslation)标记，在dsDNA上随机产生切口随机克隆，以便安插在M13phage上测序分析蛋白:DNA复合物（DNA酶足迹法）除去RNA样品中的DNA（RNase-free）DNaseI来源于牛胰，内切酶，可优先从嘧啶核苷酸的位置水RNaseH内切核酸酶，特异性水解与DNA杂交的RNA上的磷酸二酯键，产生3’-OH和5’P末端的产物；不降解单链核酸、dsDNAordsRNA；许多酶附带该活性，比如AMV反转录酶；用途：在cDNA克隆，合成第二键之前去除RNA。RNaseOnePromega开发，基因工程酶，27kDa，可以将RNA降解至单核苷酸，可以在任意碱基处内切磷酸二酯键。RNaseH内切核酸酶，特异性水解与DNA杂交的RNA上的T4多核苷酸激酶催化ATP的-磷酸基转移至DNA或RNA的5’末端，也具有3’磷酸酶活性；高浓度ATP发挥最佳活性。NH4+强烈抑制剂；用途：用于对缺乏5’-磷酸的DNA进行磷酸化(phosphorylation)。以致可用于DNA连接；交换反应：过量的ATP可使该激酶将磷酸化的5’端磷酸转移给ADP，然后DNA从[-32p]ATP中获得放射性标记的-磷酸而重新磷酸化。T4多核苷酸激酶催化ATP的-磷酸基转移至DNA或RN碱性磷酸酶种类：牛小肠碱性磷酸酶（CIP，CIAP）细菌碱性磷酸酶（BAP）活性：除去DNAorRNA5’磷酸用途：防止DNA片段自身环化标记前（5’端）除5’磷酸碱性磷酸酶种类：第一章工具酶(Enzymes)第一章工具酶(Enzymes)本章主要内容限制性内切酶甲基化酶DNA聚合酶其他分子克隆工具酶本章主要内容限制性内切酶限制与修饰(restrictionanmodification)限制性内切酶识别的序列限制性内切酶产生的末端末端长度对切割的影响位点偏爱(sitepreferences)酶切反应条件星星活性(staractivity)单链DNA的切割1.1限制性内切酶限制与修饰(restrictionanmodificat1.1.1限制与修饰50年代初，发现寄主控制的专一性(

hostcontrolledspecificity)，噬菌体在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时受到限制。E.coliKE.coliBE.coliCK110-41B10-411C10-410-411.1.1限制与修饰50年代初，发现寄主控制的专一性(h说明K和B菌株中存在一种限制系统(restrictionsystem),可排除外来的DNA;10-4的存活率是由宿主修饰系统作用的结果;甲基化：AN6甲基-腺膘呤

C5’甲基-胞嘧啶说明K和B菌株中存在一种限制系统(restrictions1.1.2限制性内切酶1970年美国约翰·霍布金斯大学H.Smith偶然发现流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）能迅速降解外源的噬菌体DNA(phageDNA),其细胞提取液可降解E.coliDNA,但不能降解自身DNA，即HindII酶。识别位点5’...GTPyPuAC...3’3’…CAPuPyTG...5’GTCGACGTTAACGTCAACGTTGACYR1.1.2限制性内切酶1970年美国约翰·霍布金斯大学限制酶的命名宿主：属名第一字母、种名头两个字母菌株或生物型号序号：罗马字

EcoRIG↓AATTCHindIIIA↓AGCTT限制酶的命名宿主：属名第一字母、种名头两个字母EcoR依据亚单位(subunit)组成、识别序列(recognitionsequence)的种类和是否需要辅助因子(cofactor)分类；RestrictionEnzymes3744种TypeI1%（既修饰又切割）TypeII93%（回文序列）TypeIIs5%（非分文序列）TypeIII<1%（识别和切割位点相距较远）限制修酶的分类依据亚单位(subunit)组成、识别序列(recognittypeII（93%）识别回文序列(palindromicsequence)，一般4-6bp，但有少数酶识别更长的序列或简并序列(degeneratesequence)；在回文序列内部或附近切割，切割位置因酶而异，产生带3’-OH和5’-P基团的DNA的产物；需Mg2+typeII（93%）识别回文序列(palindromitypeIIs（5%）识别位点(recognitionsite)非对称，4-7bp；切割位点可能在识别位点一侧20bp范围内；与typeII具有相同的辅助因子(cofactor)要求。typeIIs（5%）识别位点(recognitiontypeI（1%）R酶和M酶，另外还有负责识别DNA序列的S亚基，各作为一个亚基存在于酶分子中；分别由hsdR，hsdM，hsdS基因编码，属于同一操纵子(operon)（转录单位）；EcoK，R2M2S；EcoB，R2M4S2typeI（1%）R酶和M酶，另外还有负责识别DNA序列识别位点(recognitionsite)EcoBTGA*(N)8TGCTA*EcoKAA#C(N)6GTGCA#*甲基化位点；#可能的甲基化位点切割位点1000bp以外，无特异性识别位点(recognitionsite)typeIII(<1%)如EcoP1，EcoP15识别位点：AGACC，CAGCAG切割位点：下游24-26bp处typeIII(<1%)如EcoP1，EcoP151.1.3限制性内切酶识别的序列识别长度识别结构切割位点1.1.3限制性内切酶识别的序列识别长度识别长度4：Sau3AIGATC5：EcoRIICCWGGW=AorT

NciICCSGGS=CorG6：EcoRIGAATTC

HindIIIAAGCTT7：BbvCICCTCAGC

PpuMI

RGGWCCY8：NotIGCGGCCGC

识别长度4：Sau3AIGATC回文对称(palindrome)EcoRIGAATTCCTTAAGHindIIIAAGCTTTTCGAA识别结构回文对称(palindrome)识别结构非回文对称(non-symmetria)AccBSICCGCTCGGCGAGBssSICTCGTGGAGCAC多识别序列(degeneratesequence)AccIGTMKACHindIIGTYRAC非回文对称(non-symmetria)间断对称(interruptedsymmetria)AlwNICAGNNNCTGDdeICTNAG间断对称(interruptedsymmetria)简并碱基代表字母R=AorG

Y=CorTM=AorC

K=GorTS=CorG

W=AorTH=AorCorTB=CorGorTV=AorCorGD=AorGorTN=AorCorGorT简并碱基代表字母R=AorG切割位置内部两端EcoRIICCWGG

GGWCCSau3AIGATCCTAGNlaIIICATG

GTAC切割位置内部两侧10(N)CGA(N)6TGC(N)1212(N)GCT(N)6ACG(N)10NNCASTGNNNNGTSACNNTspRIBcgI两侧TspRIBcgI切割概率4Nt=44=2566Nt=46=4096即当识别序列(recognitionsequence)为4个或6个碱基时，它们可识别的序列在完全随机的情况下，平均每256个和4096个碱基会出现一个识别序列。切割概率1.1.4限制性内切酶产生的末端粘性末端(cohesiveends)5’突出末端EcoRIGAATTCCTTAAG…NNGAATTCNN……NNCTTAAGNN…3’突出末端KpnI

GGTACC

CCATGG1.1.4限制性内切酶产生的末端粘性末端(cohesiv平端(Bluntend)在对称轴上同时切割DNA的两条链HaeIIIGG↓CCEcoRVGAT↓ATCXmnIGAANN↓NNTTC非对称突出端非对称识别序列

BbvCICCTCAGCGGAGTCG简并序列间隔序列

DraIIICACNNNGTG平端(Bluntend)同裂酶(isoschizomer)识别相同序列的限制酶称同裂酶同序同切(同功酶)HindIIHincII

GTY/RACHpaIIHapII

C/CGGMobISau3AI

/GATC同序异切KpnIGGTAC/CAcc65IG/GTACCAsp718IG/GTACC同尾酶(Isocaudiners)平端(bluntend)

部分同裂酶(isoschizomer)同裂酶(isoschizomer)EcoRI

GAATTCMfeI

CAATTGApoI

RAATTYSpeI

ACTAGTNheI

GCTAGCXbaI

TCTAGABamHIGGATCCSau3AIGATCEcoRIGAATTCBamH1.1.5末端长度对切割的影响限制酶待切序列酶切活性(%)２h20hAccICCGGTCGACCGG00HindIIICAAGCTTGCCAAGCTTGGCCCAAGCTTGGG00150075EcoRIGGAATTCC>90>90PstIGCTGCAGCTGCACTGCAGTGCAAACTGCAG(N)14CTGCAG(N)20010>900010>9001.1.5末端长度对切割的影响限制酶待切序列酶切活性(%)1-工具酶汇总课件因此，在双酶切多克隆位点(multiplecloningsite)时，选择合适的酶切秩序；在设计PCR引物引入酶切位点时，应在位点之外引入所要求的碱基数，一般在末端另加4个；具体参照NEB操作手册。因此，在双酶切多克隆位点(multiplecloning1.1.6位点偏爱(sitepreference)某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割(preferenceincistion)；1975，EcoRI切割

phage(Lambda)中的5个位点，并不是随机的，靠近右端的位点，比分子中间的位点切割快10倍；1976，EcoRI在腺病毒2(adenovirus-2)DNA中的切割速率不同。1.1.6位点偏爱(sitepreference)某些1.1.7酶切反应条件pH：7.0-7.9(at25℃)，Tris-HCl，乙酸；离子强度：NaCl，高（100mM）、中（50mM）、低（０）；Mg2+

：10mMMgCl2orMgAc；DTT(dithiothreitol，二硫苏糖醇)：1mM；100g/mlBSA，少数需要。每一种酶都有其最适的反应条件，请参考产品说明书！1.1.7酶切反应条件pH：7.0-7.9(at25℃双酶切策略选用都合适的缓冲液或通用缓冲液；当缓冲液不可替代时：先低盐缓冲液再高盐缓冲液（DNA可纯化或不纯化）双酶切策略选用都合适的缓冲液或通用缓冲液；1-工具酶汇总课件注意事项取少量酶最后加酶、尽快操作减少反应体积延长反应时间分装保存注意事项取少量酶反应温度大多数为37℃一部分为50-65℃少数25-30℃反应终止EDTA终浓度10mM

加热65℃（80℃）20min反应温度大多数为37℃1.1.8星星活性(staractivity)在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性(staractivity)；实际上星星活性(staractivity)是限制性内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点。1.1.8星星活性(staractivity)在极端非标引起星星活性的因素

高甘油(glycerin)浓度（>5%）酶过量（>100U/l）低离子强度（<25mM）高pH(>8.0)有机溶剂：PMSD(二甲基亚砜)、乙醇(ethanol)、乙二醇(glycol)、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺dimethylformamide）和sulphalane等用其它二价阳离子如Mn２+、Cu２+

、Co２+或Zn２+代替Mg２+引起星星活性的因素

高甘油(glycerin)浓度（>5%）星星活性的抑制减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度保证反应体系中无有机溶剂或乙醇提高离子强度到100～150mM(在不抑制酶活性的前提下)降低反应pH至7.0使用Mg2+作为二价阳离子星星活性的抑制减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度1.1.9单链DNA的切割HinP1I,HhaI,MnlI，50％HaeIII，10%BstNI,DdeI,HgaI,HinfI,TaqI，1％AluI,BbvI,DpnI,FnuDII,FokI,HpaII,HphI,MobI,MobII,MspI,Sau3AI,SfaNI，不切割1.1.9单链DNA的切割HinP1I,HhaI,Mn1.1.10影响酶活性的因素“外因”底物的纯度“内因”sitepreference甲基化(methylation)底物的构象:切割cccDNA和linearDNA时表现的差异，与切割λDNA相比，EcoRI、PstI、SalI

需要至少5倍的酶来切割pBR322的I型DNA。1.1.10影响酶活性的因素“外因”1.1.11酶切位点在基因组中分布的不均一性基因组中，碱基对的排列是非均匀的，因此尽管GC含量相同的酶切位点，在基因组中出现的机率是不一样的。在E.coli中,酶切位点出现的平均长度AscI(GGCGCGCC)20kbNotI(GCGGCCGC)200kbEcoRI/HindIII5kbSpeI(ACTAGT)60kb1.1.11酶切位点在基因组中分布的不均一性基因组中，碱基细菌基因组(bacteriagenome)

在大多数富含A+T的细菌中，CCG和CGG的排列是最少见的，所以含有这两种序列的识别序列出现的机率就非常少；酵母基因组(yeastgenome)G+C%为38%，因此富含G+C的识别序列特别少；哺乳动物

G+C为41%，其中CG的序列比想象的低5倍之多，因此含CG序列的酶切位点在哺乳动物细胞相当稀少。而且在哺乳动物细胞中，大多数CG序列是甲基化的。细菌基因组(bacteriagenome)1.2甲基化酶（Methylase）真核生物(eukaryote)和原核生物(prokaryote)中存在大量的甲基化酶；原核生物的甲基化酶作为修饰系统，保护自身的DNA不被相应的限制酶切割；大肠杆菌有三种甲基化酶Dam甲基化酶Dcm甲基化酶EcoKI甲基化酶1.2甲基化酶（Methylase）真核生物(eukaryDam甲基化酶识别GATC，在腺嘌呤N6位置引入甲基(methyl)；PvuII、BamHI、BclI、BglII、XhoII、MboI、Sau3AI的识别位点中含GATC序列；ClaI(1/4)、XbaI(1/16)、TaqI(1/16)、MboII(1/16)、HphI(1/16)的部分识别序列含GATC序列，4个ClaI位点(ATCGATN)中有一个该序列；BclI、ClaI、MboI和XbaI受甲基化影响；BamHI、Sau3AI、BglII和PvuI等不受甲基化影响；一般哺乳动物DNA，不会在A-N6上甲基化。Dam甲基化酶识别GATC，在腺嘌呤N6位置引入甲基(metDcm甲基化酶识别CCAGG或CCTGG序列，在第二个C上C5位置上引入甲基；EcoRII/BstNI，CCA(T)GG，二者识别序列相同，但切点不同，EcoRII受dcm甲基化作用影响，BstNI可避免这一影响；受影响的酶：Acc65I、AlwNI、ApaI、EcoRII、EaeI不受影响的酶：KpnI、BanII、Bg1I、BstNI、NarI

Dcm甲基化酶识别CCAGG或CCTGG序列，在第二个C上CEcoKI甲基化酶识别AAC(N)6GTGC,在N6位置甲基化TTG(N)6CACG识别位点少(1/8kb)研究较少，而dam（1/256bp）dcm(1/512bp)EcoKI甲基化酶识别AAC(N)6GTGC,在N6位置甲SssI甲基化酶来自原核生物螺原体（Spiroplasma），可在CG序列中的C在C5位置上甲基化，又称CG甲基化酶；许多酶对此甲基化敏感，如AatII、ClaI、XhoI、SalI等；不敏感的有BamHI、EcoRI、SphI和KpnI。SssI甲基化酶来自原核生物螺原体（Spiroplasma）甲基化对限制酶切的影响修饰酶切位点TCGA中的A甲基化后，GTCGAC将不受HincII切割；构建DNA文库(DNAlibrary)时，用AluI(AG↓CT)和HaeⅢ(GG↓CC)部分消化基因组DNA，用甲基化酶处理，然后加上合成的EcoRI接头，当再用EcoRI来切割时只有接头上的位点可被切割。产生新的酶切位点TCGATCGAAGCTAGCT

TaqITaqITCGA*TCGA**AGCT*AGCTDpnI甲基化对限制酶切的影响修饰酶切位点1.3DNA聚合酶真核DNApolymeraseDNA聚合酶αDNA聚合酶δDNA聚合酶εDNA聚合酶γDNA聚合酶β原核DNApolymeraseI：一条多肽链，可催化单链或双链DNA的延长；II：一条多肽链，与低分子脱氧核苷酸链的延长有关；III：多聚酶，是促进DNA链延长的主要酶。1.3DNA聚合酶真核DNApolymeraseE.coliDNApolymeraseI5’→3’DNA聚合酶活性

Mg2+

、dNTPDNApolyI5’→3’外切核酸酶活性

Mg2+

DNApolyI+dNTP降解RNA:DNA中的RNA

(RNaseH活性)E.coliDNApolymeraseI5’→3’DN3’→5’外切酶活性

Mg2+

DNApolyI+dNTP3’→5’外切酶活性Mg2++dNTPDNApolymeraseI的用途切口平移法(nicktranslation)标记DNA

Mg2+，低限量DNaseIdNTP，DNApolyI若有放射性dNTP，则可标记成探针(probe)DNApolymeraseI的用途切口平移法(nick用于cDNA克隆中的第二链

即单纯的DNA聚合活性，但由于有5’---3’外切活性，已不再使用，而改用Klenow酶和反转录酶(reversetranscriptase)末端标记（endlabeling）（交换或置换反应）

Mg2+,DNApolyI[-P32]dATPA*TT4DNApolyT7DNApoly更好用于cDNA克隆中的第二链Mg2+,DNApolyIAKlenow酶DNApolymeraseI经蛋白酶（proteinase)（枯草杆菌蛋白酶）裂解,从全酶中除去5’—3’外切活性片段，而聚合活性和3’—5’外切活性不受影响，大小为76kDa；通过基因工程也可以构建得到；作用与DNApolymeraseI相似。Klenow酶DNApolymeraseI经蛋白酶（prT4DNApolymerase来源于T4phage感染的E.coli，114kDa；与Klenow酶相似，但3’--5’外切活性强200倍;用途补平或标记3’凹端，必须有高浓度dNTP（末端标记）置换反应：必须有高浓度dNTP(一种)末端标记T4DNApolymerase来源于T4phage感染T7噬菌体DNA聚合酶来源于T7phage感染的E.coli,为两种紧密结合的蛋白质复合体（噬菌体基因5蛋白和宿主的硫氧还蛋白）；与Klenow酶相似，但3’--5’外切活性强1000倍;T7DNApoly为持续合成能力最强的一个，产物平均长度要大得多，在测序时具有优势。用途:替代T4DNApoly的功能长模板的引物延伸(primerextension)T7噬菌体DNA聚合酶来源于T7phage感染的E.col反转录酶依赖于RNA的DNA聚合酶，5’→3’合成DNA，无3’→5’外切活性；来自禽成髓细胞瘤病毒（AMV），鼠白血病病毒（Mo-MLV）；AMV二链多肽(62kDa/94kDa)，同时具很强的RNaseH活性。因此，在反应开始时，引物(primer)和mRNA模板(template)杂交体可成为RNaseH的底物，此时，模板的降解和cDNA的合成相竞争；Mo-MLV单肽，84kDa，RNaseH活性弱，利于合成较长的cDNA。反转录酶依赖于RNA的DNA聚合酶，5’→3’合成DNA，末端转移酶来源于小牛胸腺，存在于前淋巴细胞(prolymphocyte)及分化早期的类淋巴样细胞内的一种不寻常的DNA聚合酶；在二价阳离子存在下，末端转移酶(terminaltransferase)催化dNTP加于DNA分子的3’羟基端；TorC→首