超声法与酶切法随机打断基因组方法的比较

超声法与酶切法随机打断基因组方法的比较李莹;王阔鹏;于凌娇浏麒浏倩宏【摘要】将细菌基因组随机打断，是构建随机文库的第一步，也是构建随机、多样文库的一个重要保障物理法（超声波）和酶切法是两种常用的断裂基因组的方法.本试验采用超声法和酶切法对马耳他布鲁菌16M株基因组进行随机打断，并比较二者的打断效果，为后续建立布鲁菌基因组随机文库奠定基础.结果表明，用超声法（超声条件:输出功率50%,超声3s,间隔3s,超生次数10下）随机打断布鲁菌基因组效果最好.【期刊名称】《吉林农业科技学院学报》【年（卷），期】2018（027）004【总页数】4页（P4-7）【关键词】超声法;酶切法；Sau3AI【作者】李莹;王阔鹏;于凌娇浏麒浏倩宏【作者单位】吉林农业科技学院动物科技学院;;;;吉林农业科技学院动物科技学院吉林132101【正文语种】中文1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验材料及仪器马耳他布鲁菌16M株（标准热灭活）、NEB公司基因组提取试剂盒、琼脂糖、异丙醇、70%乙醇、0.2%漠酚蓝、50%蔗糖上样缓冲液、电泳缓冲液、1mg/mL漠化乙锭溶液(EB)、10x酶切缓冲液、Sau3AI限制性内切酶(NEB公司)。超声波细胞破碎仪(新芝SCIENTZ-IID型)、电泳仪、凝胶成像仪、高速离心机、超低温冰箱、高压灭菌锅、水浴锅、稳压电泳仪、电泳槽、紫外检测仪、EP管、离心管、微量移液器、量筒、烧杯、锥形瓶、吸嘴、剪刀、镊子、塑料手1.1.2试剂配制氨苄青霉素(Ampicillin)配置(浓度100mg/mL):称取5gAmp,在50mL离心管加入称好的Amp，并加入40mL无菌水，使其充分混合溶解之后，定容到50mL。采用规格为0.22pm的滤膜过滤除菌，再分装成小份(约1mL/管)，在-20°C中保存。无菌水的制备：量取50mL重整水，在100mL三角瓶中加入称量好的重整水，高压灭菌20min后，用高压灭菌后的EP管分装,-20C保存备用。1.2试验方法1.2.1基因组提取用NEB公司基因组提取试剂盒提取马耳他布鲁菌16M株基因组，具体按试剂盒操作，用1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组提取结果［1-5］。1.2.2软件DNAMAN分析基因组用DNAMAN分析16M株基因组序列，识别Sau3AI酶切位点，预测该酶可能的酶切片段大小［6］。1.2.3Sau3AI酶切基因组根据Sau3AI酶的使用说明书，进行如下操作：在0.5mLEP管中，建立基因组DNA酶解的混合体系；并将混合物置于55C水浴中，水浴15min,使基因组DNA片段被分散。10xSau3AI缓冲液5pL提取的基因组DNA20pL(25-60pg)无菌重整水75pL共100pL。将(1)中液体分装在5个Ep管中(Ep管需要标记数字1、2、3、4、5,便于区分)，其中1管为30pL,2管-4管各为20mL,5管为10pLo5个Ep管冰浴放置。⑶根据3-10U/pgDNA的量，加入Sau3AI酶于1笥轻轻弹动管壁，利于二者混匀，短暂离心2s后，收集反应物，并在冰上放置。⑷用微量移液器在1管中吸取10pL液体放入到2管中，立刻混匀，混匀后放置在冰上。梯度稀释。在2管中，用移液器取10pL液体到3笥在3管中取10pL液体至4管,4管10pL液体到5管。注意：连续稀释后，每管体积都是20pL。在37°C时，保温20min,然后在68°C水浴锅中水浴5-8min,使Sau3AI内切酶失活，在冰上放置。在各酶解产物管中分别取4pL，进行琼脂糖凝胶电泳检测，大约电泳5-16h,判断酶解产物的大小范围［7］。1.2.4超声裂解法打断基因组利用超声波细胞破碎仪(新芝SCIENTZ-IID型)随机打断布鲁菌基因组［8-9］。超声条件设定见表1。表1超声组别组别输出功率超声时间超声间隔超声次数150%3s3s30下250%3s3s20下350%3s3s10下1.2.51%琼脂糖凝胶电泳检测利用电泳检测两种方法随机打断基因组情况。制备1%琼脂糖凝胶：称取0.5g琼脂糖，放在锥形瓶中，加一倍浓度的电泳缓冲液(1X电泳缓冲液)，轻轻晃动几下，用微波炉加热，使融化均匀。加热之前，锥形瓶口要密封，减少在加热过程中水分的蒸发。制备胶板：把胶槽放到制胶板上，插上梳子，注意梳子齿末端与胶槽底部保留大约1mm距离。等到凝胶溶液冷却到50°C时，加浓度为0.5pL/mL的EB，轻轻地摇匀，慢慢将其倒入到制胶板中，要注意消灭气泡。等到凝胶冷却凝固后，将梳子拔出。将凝胶放入到电泳槽内，加1X电泳缓冲液，使缓冲液液面比琼脂糖凝胶面高一点点。加样：把样品DNA和样品缓冲液混合在点样板上，用10"微量移液器取样加在样品槽中，每次加样都要更换枪头，防止污染，影响结构。加样时要小心谨慎，勿触碰样品孔周围，记住加样顺序、加样量。注意：样品缓冲液不小于1X。⑷电泳：加样后，应立刻通电进行电泳。样品从黑色负电极移动至红色正电极。当漠酚蓝移至距离胶板下缘1cm处时，停止电泳。(5)拍照观察：电泳后取出凝胶。在波长为254nm的紫外线下，观察电泳胶板。可以看到在DNA存在的位置，有橘红色条带。用凝胶成像系统拍照并保存。图1布鲁菌基因组1.Marker从上到下大小依次为100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，1500bp，2000bp，3000bp，5000bp，10000bp；2.马尔他布鲁菌16M株DNA提取结果2试验结果2.1马耳他布鲁菌16M基因组提取结果用NEB公司基因组提取试剂盒提取布鲁菌16M基因组，用琼脂糖凝胶电泳进行检测分析，结果见图1。结果显示提取基因组成功，且DNA提取浓度较高；经OD260/280分析，基因组纯度也达到要求。2.2软件分析结果Sau3AI识别酶切位点为GATC。软件预测布鲁菌16M株基因组(NC_003317.1)经Sau3AI酶切图谱如图2。结果表明布鲁菌16M株基因组上有Sau3AI酶的酶切位点，且经酶切后得到的线性DNA片段大小分别为30bp,42bp,120bp,127bp,267bp,503bp;得到的环形DNA片段大小分别为30bp,42bp,120bp,127bp,770bp。酶切后得到线性DNA片段为30bp,42bp,120bp,127bp,267bp,503bp;得到的环形DNA为30bp,42bp,120bp,127bp,770bp。图2Sau3AI酶切位点图图3酶切法打断基因组l.Marker从上到下大小依次为100bp,250bp,500bp，750bp，1000bp，1500bp，2000bp，3000bp，5000bp，10000bp；2-3.Sau3AI酶切基因组结果图4超声法打断基因组1.Marker从上到下大小依次为100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，1500bp，2000bp，3000bp，5000bp，10000bp；2.超声30下；3超声20下；4.Marker；5.超声10下2.3酶切法随机打断基因组结果Sau3AI酶切马耳他布鲁菌16M株基因组，用琼脂糖凝胶电泳检测分析，结果见图3。结果表明酶切的基因片段比较小，并且分布均匀。2.4超声法随机打断基因组结果采用3组不同超声裂解条件，对16M株基因组随机打断，进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图4。结果表明输出功率50%，超声3s,间隔3s,超声次数为10下，效果最好。2.5基因组打断效果检测分析本试验的目的是为了建立布鲁菌基因组随机文库，通过用Sau3AI酶切和超声破碎基因组，得到想要的基因片段，为后续试验做准备。所需基因片段大小约为200-3000bp之间，片段均匀，大小适中。而通过电泳检测可知，酶法得到的基因片段大多数都是小片段，超声法得到的片段为一条抹带，范围在200-3000bp，符合后续试验需要。3分析与讨论利用超声法处理基因组具有设备简单，操作方便，样品损失少，处理速度快，有利于分离纯化，具有良好的通透性，易于实现连续化、自动化，样品处理量大，成本低，转化率高等优点。酶法显著的特点是专一性强，样品处理速度快，比较温和，并且能够更好的保留DNA完整性以及蛋白质的抗原表位。超声法对DNA的打断是随机的，且实验重复性较高。对于那些与DNA结合不紧密的蛋白或低丰度表达的蛋白，如调控因子、转录因子等通常需要用交联试剂固定样本(细胞或组织)以稳定蛋白质和DNA的形态，这种情况最好用超声法。如果样本无需交联，例如研究对象是与DNA结合紧密的蛋白或高丰度表达的蛋白，那么便可以使用酶法。但酶切法得到的DNA片段相对较短，不适合染色质免疫共沉淀技术及与芯片方法的结合(CHIP-Chip)实验和染色质免疫沉淀测序(CHIP-Seq)实验。研究拟利用随机打断的基因组DNA片段构建布鲁菌16M株随机文库，基因组DNA片段的质量(包括片段的浓度、大小等)直接决定构建文库的多样性及随机性。因此，本研究比较了酶切法和超声法对基因组DNA的随机打断效率，并对超声法裂解基因组DNA进行了条件优化，为后续随机文库构建你奠定基础。4结论试验通过比较超声法和酶切法随机打断布鲁菌16M株基因组效果，为后续建库奠定基础。结果表明，超声法(输出功率50%，超声3s,间隔3s,超声次数10下)效果更好。参考文献：【相关文献】薛鹏飞，柳鹏福，史吉平，等.盐单胞菌Fosmid文库构建及群体感应淬灭酶的筛选[J].江苏农业科学，2016，44(10):88-91.赵志祥，芦小飞，陈国华，等.温室黄瓜根结线虫发生地土壤微生物宏基因组文库的构建及其—个杀线虫蛋白酶基因的筛选[J].微生物学报，2010,50(8):1072-1079.陈诚,乔军,孟庆玲，等.绵羊肺炎支原体基因组DNA表达文库的构建与鉴定[J].西北农业学报,2016,25(5):646-651.赵晓宇，孟利强，曹旭，等.高效生防菌B29抗菌物质基因组文库的构建[J].黑龙江科学，2013(9):18-20.管健.植物基因组DNA提取及酶切技术的初步探讨[J].黑龙江科技信息，2013(30):128.吕燕宁，郭潇潇,陈丽娟，等.两株布鲁菌MLST新序列型(ST)的鉴定[J/OL].中国人兽共