第十六章-基因诊断技术及其应用课件

第十六章基因诊断技术及其应用

基因诊断是利用DNA分子杂交等分子生物学技术，直接探查人体基因组DNA存在的缺陷或是基因表达产物的异常，从而对人体状态和疾病作出诊断。基因诊断也称DNA诊断或DNA探针技术或基因探针技术，是20世纪70年代末迅速发展起来的一项应用技术。快速灵敏、准确可靠的现代分子生物学技术是基因诊断的先决条件。11第一节基因诊断的策略第二节基因诊断的常用技术方法第三节基因诊断的应用

2第一节基因诊断的策略2

第一节基因诊断的策略一、基因突变的检测当致病基因已和分子机制均确知时，直接检测和分析突变是分子诊断最有力和最准确的方法。基因突变检测法可检测基因大片段缺失和插入、小片段缺失和插入、点突变(只有一种类型的点突变，或像N-ras突变那样，突变类型很多但只有一两种占优势，或发生在限制酶识别位点上使酶切位点消失，或发生在隐蔽位点上使酶切位点增加、异常基因重排和异常基因融合等的检测。较大片段用Southern印迹法或PCR法。单个外显子突变采用双3第一节基因诊断的策略3引物PCR法，多个外显子突变采用multiplexPCR进行电泳条带分析，单个突变点采用PCR-SSCP法。测mRNA用RT-PCR法。二、基因连锁分析由于同一染色体上相邻近的基因一起被遗传而相互存在连锁关系，在只知致病基因在染色体上的大概位置而不知确切位置的情况下，只要鉴定与致病基因相连锁的有关基因的存在与否，就可以判断受检者是否带有致病基因。常采用限制性片段长度多态性（RFLP）遗传标志进行多态性分析。4引物PCR法，多个外显子突变采用multiplexPCR进行三、感染性疾病外源基因的检测这类检测一般根据已知病原生物基因组外源DNA或RNA顺序，采用PCR或RT-PCR的方法就可以进行快速、简便而准确的诊断。因此，这类疾病的基因诊断应用性极强，在严格掌握质控的前提下，可在临床广泛运用。四、基因异常表达的检测用mRNA作标本，采用RT-PCR法进行半定量和定量分析判断基因表达异常。5三、感染性疾病外源基因的检测5第二节基因诊断的常用技术方法一、核酸分子杂交技术㈠限制性内切酶酶谱分析法(图16-1)

6第二节基因诊断的常用技术方法6此方法是利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测是否存在基因变异。当待测DNA序列中发生突变时会导致某些限制性内切酶位点的改变，其特异的限制性酶切片段的状态(片段的大小或多少)在电泳迁移率上也会随之改变，借此可作出分析诊断。㈡DNA限制性片段长度多态性(restrictionfragnentlengthpolymor-phism,RFLP)分析在人类基因组中，平均约200对碱基可发生一对变异(称为中性突变)，中性突变导致个体间核苷酸序列的差异，称为DNA多态性。不少DNA多态性发生在限制性内切酶识别位点上，酶解该DNA片段就会产生长度不同的片段，称为限制性片段长度多态性。7此方法是利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测是否㈢等位基因特异寡核苷酸探针(allelespecificoligonucleotide,ASO)杂交法根据已知基因突变位点的核苷酸序列，人工合成两种寡核苷酸探针，一种是相应于突变基因碱基序列的寡核苷酸(M)，一种是相应于正常基因碱基序列的寡核苷酸(N)，用它们分别与受检者DNA进行分子杂交。8㈢等位基因特异寡核苷酸探针(allelespecific二、聚合酶链反应(PCR)(图16-2)根据待测基因两端的DNA顺序设计出一对引物，经PCR反应将目的基因片段扩增出来，即可进一步分析判断致病基因的存在与否，并了解其变异的形式。9二、聚合酶链反应(PCR)(图16-2)9三、基因测序分离出患者的有关基因，测定出其碱基排列顺序，找出其变异所在，这是最为确切的基因诊断方法。10三、基因测序10第四节基因诊断的应用一、基因诊断在恶性肿瘤中的应用㈠恶性肿瘤的特异性基因诊断在慢粒白血病中，具有t(9;22)染色体的易位及所产生的bcr-abl融合基因，因此可用检测特殊融合基因的方法进行某些白血病的诊断。在淋系白血病中存在大的Ig或TCR基因的V-(D)-J组合可作为B、T白血病的克隆标志。应用Southern杂交或PCR方法可检测这些标志。11第四节基因诊断的应用11㈡恶性肿瘤相关基因分析因此，通过对肿瘤相关基因的分析如癌基因，抑癌基因，凋亡和抗凋亡基因缺失，插入，扩增突变，表达过量。同样可对临床起到鉴别诊断、判断预后的作用，如对儿童神经母细胞瘤、神经上皮瘤所进行的鉴别诊断。

神经母细胞瘤神经上皮瘤N-myc-mRNA表达高极低C-myc-mRNA表达无高12㈡恶性肿瘤相关基因分析神经母细胞瘤神经上皮瘤N-myc-m㈢恶性肿瘤的分子病理学诊断原位杂交在肿瘤病理诊断中的应用至少包括如下几个方面：1.

肿瘤病毒的检出：肝穿刺查乙肝病毒2.肿瘤细胞遗传学改变的检测:FISH查标记染色体3.

细胞内基因结构和量的改变的检测：4.

基因表达产物的检测RT-PCR原位杂交5.肿瘤分化程度的确定：RT-PCR定量分析查转录拷贝数6.

实体瘤中抗药性肿瘤细胞的定位检测多重耐药基因（MDR1）基因扩增与表达的检测13㈢恶性肿瘤的分子病理学诊断13提问与解答环节QuestionsAndAnswers14提问与解答环节14谢谢聆听·学习就是为了达到一定目的而努力去干,是为一个目标去战胜各种困难的过程,这个过程会充满压力、痛苦和挫折LearningIsToAchieveACertainGoalAndWorkHard,IsAProcessToOvercomeVariousDifficultiesForAGoal15谢谢聆听LearningIsToAchieveAC第十六章基因诊断技术及其应用

基因诊断是利用DNA分子杂交等分子生物学技术，直接探查人体基因组DNA存在的缺陷或是基因表达产物的异常，从而对人体状态和疾病作出诊断。基因诊断也称DNA诊断或DNA探针技术或基因探针技术，是20世纪70年代末迅速发展起来的一项应用技术。快速灵敏、准确可靠的现代分子生物学技术是基因诊断的先决条件。161第一节基因诊断的策略第二节基因诊断的常用技术方法第三节基因诊断的应用

17第一节基因诊断的策略2

第一节基因诊断的策略一、基因突变的检测当致病基因已和分子机制均确知时，直接检测和分析突变是分子诊断最有力和最准确的方法。基因突变检测法可检测基因大片段缺失和插入、小片段缺失和插入、点突变(只有一种类型的点突变，或像N-ras突变那样，突变类型很多但只有一两种占优势，或发生在限制酶识别位点上使酶切位点消失，或发生在隐蔽位点上使酶切位点增加、异常基因重排和异常基因融合等的检测。较大片段用Southern印迹法或PCR法。单个外显子突变采用双18第一节基因诊断的策略3引物PCR法，多个外显子突变采用multiplexPCR进行电泳条带分析，单个突变点采用PCR-SSCP法。测mRNA用RT-PCR法。二、基因连锁分析由于同一染色体上相邻近的基因一起被遗传而相互存在连锁关系，在只知致病基因在染色体上的大概位置而不知确切位置的情况下，只要鉴定与致病基因相连锁的有关基因的存在与否，就可以判断受检者是否带有致病基因。常采用限制性片段长度多态性（RFLP）遗传标志进行多态性分析。19引物PCR法，多个外显子突变采用multiplexPCR进行三、感染性疾病外源基因的检测这类检测一般根据已知病原生物基因组外源DNA或RNA顺序，采用PCR或RT-PCR的方法就可以进行快速、简便而准确的诊断。因此，这类疾病的基因诊断应用性极强，在严格掌握质控的前提下，可在临床广泛运用。四、基因异常表达的检测用mRNA作标本，采用RT-PCR法进行半定量和定量分析判断基因表达异常。20三、感染性疾病外源基因的检测5第二节基因诊断的常用技术方法一、核酸分子杂交技术㈠限制性内切酶酶谱分析法(图16-1)

21第二节基因诊断的常用技术方法6此方法是利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测是否存在基因变异。当待测DNA序列中发生突变时会导致某些限制性内切酶位点的改变，其特异的限制性酶切片段的状态(片段的大小或多少)在电泳迁移率上也会随之改变，借此可作出分析诊断。㈡DNA限制性片段长度多态性(restrictionfragnentlengthpolymor-phism,RFLP)分析在人类基因组中，平均约200对碱基可发生一对变异(称为中性突变)，中性突变导致个体间核苷酸序列的差异，称为DNA多态性。不少DNA多态性发生在限制性内切酶识别位点上，酶解该DNA片段就会产生长度不同的片段，称为限制性片段长度多态性。22此方法是利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测是否㈢等位基因特异寡核苷酸探针(allelespecificoligonucleotide,ASO)杂交法根据已知基因突变位点的核苷酸序列，人工合成两种寡核苷酸探针，一种是相应于突变基因碱基序列的寡核苷酸(M)，一种是相应于正常基因碱基序列的寡核苷酸(N)，用它们分别与受检者DNA进行分子杂交。23㈢等位基因特异寡核苷酸探针(allelespecific二、聚合酶链反应(PCR)(图16-2)根据待测基因两端的DNA顺序设计出一对引物，经PCR反应将目的基因片段扩增出来，即可进一步分析判断致病基因的存在与否，并了解其变异的形式。24二、聚合酶链反应(PCR)(图16-2)9三、基因测序分离出患者的有关基因，测定出其碱基排列顺序，找出其变异所在，这是最为确切的基因诊断方法。25三、基因测序10第四节基因诊断的应用一、基因诊断在恶性肿瘤中的应用㈠恶性肿瘤的特异性基因诊断在慢粒白血病中，具有t(9;22)染色体的易位及所产生的bcr-abl融合基因，因此可用检测特殊融合基因的方法进行某些白血病的诊断。在淋系白血病中存在大的Ig或TCR基因的V-(D)-J组合可作为B、T白血病的克隆标志。应用Southern杂交或PCR方法可检测这些标志。26第四节基因诊断的应用11㈡恶性肿瘤相关基因分析因此，通过对肿瘤相关基因的分析如癌基因，抑癌基因，凋亡和抗凋亡基因缺失，插入，扩增突变，表达过量。同样可对临床起到鉴别诊断、判断预后的作用，如对儿童神经母细胞瘤、神经上皮瘤所进行的鉴别诊断。

神经母细胞瘤神经上皮瘤N-myc-mRNA表达高极低C-myc-mRNA表达无高27㈡恶性肿瘤相关基因分析神经母细胞瘤神经上皮瘤N-myc-m㈢恶性肿瘤的分子病理学诊断原位杂交在肿瘤病理诊断中的应用至少包括如下几个方面：1.

肿瘤病毒的检出：肝穿刺查乙肝病毒2.肿瘤细胞遗传学改变的检测:FISH查标记染色体3.

细胞内基因结构和量的改变的检测：4.

基因表达产物的检测RT-PCR原位杂交5.肿瘤分化程度的确定：RT-PCR定量分析查转录拷贝数6.

实体瘤中抗药性肿瘤细胞的定位检测多重耐药基因（MDR1）基因扩增