第14讲微阵列技术课件

生物信息学

第十四讲微阵列技术及其应用

生物信息学

第十四讲11997年，《财富》杂志就报道说，“在20世纪科技史上有两件事影响深远：一是微电子芯片，它是计算机和许多家电的‘心脏’，改变了我们的经济和文化生活，并已进入每一个家庭；另一就是生物芯片，它将改变生命科学的研究方式，革新医学诊断和治疗，极大地提高人口素质和健康水平。”1997年，《财富》杂志就报道说，“在20世纪科技史上有两件21.生物芯片的诞生

生物芯片（Biochip,Bioarray,microarray）：将高密度核酸、抗原、抗体、细胞或组织等生物识别分子按预先设置的排列固定于一种载体（如硅片、玻片及高聚物载体等）表面，利用生物分子的特意性亲和反应，如DNA-DNA杂交、DNA-RNA杂交、抗原-抗体以及受体-配体之间的特异性结合，检测生物样品中对应生物分子的有无、多少或者结构改变等。高通量、微型化和自动化

1.生物芯片的诞生生物芯片（Biochip,Bioarr3在许多情况下，生物学问题最终的解决都源于技术上的突破。

——MarkSchena

在许多情况下，生物学问题最终的解决都源于技术上的突破。4后基因组时代，蛋白组学，涌现出许多功能强大的研究方法和研究工具，最突出的就是细胞蛋白质二维凝胶电泳（2-D-gel）（及相应的质谱法测蛋白分子量）和生物芯片（Biochip）技术

生物科学正迅速地演变为一门信息科学生物芯片是信息时代的产物，横跨：生命科学、物理学、计算机科学、微电子技术光电技术、材料科学、等现代高科技

后基因组时代，蛋白组学，涌现出许多功能强大的研究方法和研究工5生物芯片发展历史Southern&NorthernBlotDotBlotMacroarrayMicroarraySouthernblot可以被看作是生物芯片的雏形

生物芯片发展历史Southern&NorthernDo62.生物芯片（微阵列）是如何定义的？必须符合：①有规则的；②显微尺度的；③平面的；④特异性的。2.生物芯片（微阵列）是如何定义的？必须符合：7①规则的微阵列微阵列上的点按照行和列规则地排列而非无规则排列；点的大小和点间距均一而非不均一；点的位置明确而非模棱两可。①规则的微阵列微阵列上的点按照行和列规则地排列而非无规则排列8②显微尺度的点显微尺度（microscopic):是一个物体若没有显微镜的帮助，不能清楚地被看见。一般以小于1mm为界。微阵列：光引导原位合成的点：15～30µm点制的点：50～350µm组织芯片的点：200～600µm②显微尺度的点显微尺度（microscopic):是一个物体9一块指甲大小基因芯片的密度：100-1millionDNA探针/1cm2一块指甲大小基因芯片的密度：100-1millionDN10③平面基片平面基片是像玻璃、塑料、硅片一样平行不能弯曲的基质载体。玻片是微阵列中用得最为广泛的基质载体。非平面基片：尼龙膜、硝酸纤维素膜等。平坦的表面优点：适合大规模自动化生产；为光掩膜、接触式针点样、喷墨式非接触点样和其它制备工序提供了精密的距离，确保制备微阵列的高质量；使扫描和成像变得容易。③平面基片平面基片是像玻璃、塑料、硅片一样平行不能弯曲的基质11④特异性吸附微阵列上的每一个点能与标记好的探针混合物中的一种分子发生吸附，才能对此基因或基因产物进行精确的检测④特异性吸附微阵列上的每一个点能与标记好的探针混合物中的一种12Principle：Hybridizationofthetargettotheprobe

Principle：Hybridizationofthe13核酸分子固相杂交方法菌落原位杂交（Colonyinsituhybridization）Southern印迹杂交（Southernblot）Northern印迹杂交（Northernblot）斑点杂交（Dotblot）组织原位杂交（Tissueinsituhybridization）核酸分子固相杂交方法菌落原位杂交（Colonyinsit14Hybridizationmethods

Hybridizationmethods15SouthernandNorthernblothybridizationSouthernandNorthernblothyb16ColonyinsituhybridizationColonyinsituhybridization17Fluorescentinsituhybridization(FISH)Fluorescentinsituhybridizat18抗原抗体酶联免疫吸附测定

(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)抗原抗体酶联免疫吸附测定(Enzyme-LinkedIm193.Biochip的类型

①狭义：微阵列芯片，主要包括cDNA微阵列、寡核苷酸微阵列、蛋白质微阵列和小分子化合物微阵列等②广义：能对生物成分或生物分子进行快速并行处理和分析的厘米见方的固体薄型器件，主要还包括微流体芯片和“芯片实验室”。3.Biochip的类型①狭义：微阵列芯片，主要包括cD20生物芯片的类型基因芯片genechip：又称DNA芯片,是根据核酸杂交的原理，将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析。蛋白质芯片proteinchip：利用抗体与抗原特异性结合即免疫反应的原理，将蛋白质分子（抗原或抗体）结合到固相支持物上，形成蛋白质微阵列，即蛋白质芯片。组织芯片tissuemicroarray芯片实验室(labs-on-chip)

：微流体芯片：微流控芯片技术(Microfluidics)是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程。生物芯片的类型基因芯片genechip：又称DNA芯片,是21第14讲微阵列技术课件22蛋白质芯片蛋白质芯片（proteinchip）,又称蛋白质微阵列，是指以蛋白质或多肽作为配基,将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列；用标记了荧光的蛋白质或其它分子与之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白质之间或蛋白质与其它分子之间的相互作用关系。蛋白质芯片蛋白质芯片（proteinchip）,又称蛋白23Therearetwogeneraltypesofproteinmicroarray:Analyticalproteinmicroarraysinvolveahigh-densityarrayofaffinityreagents(e.g.antibodiesorantigens)thatareusedfordetectingproteinsinacomplexmixture.Functionalproteinchipsareconstructedbyimmobilizinglargenumbersofpurifiedproteinsonasolidsurface.Ithasanenormouspotentialinassayingforawiderangeofbiochemicalactivities(protein-protein,protein-lipid,protein-nucleicacid,andenzyme-substrateinteractions),aswellasdruganddrugtargetidentification.Therearetwogeneraltypesof24组织芯片它将数十个甚至上千个不同个体的组织标本集成在一张固相载体上，为医学分子生物学提供了一种高通量、大样本以及快速的分子水平的分析工具研究者一次可有效利用成百上千份自然或出于疾病状态下的组织标本来研究特定基因及其所表达的蛋白质与疾病之间的相关关系对于疾病的分子诊断，预后指标和治疗靶点的定位，抗体和药物的筛选等方面均有十分重要的实用价值。组织芯片它将数十个甚至上千个不同个体的组织标本集成在一张固相25测序芯片任何线状的单链DNA或RNA序列均可被分解为一个序列固定、错落而重叠的寡核苷酸，又称亚序列（subsequence）。例如可把寡核苷酸序列TTAGCTCATATG分解成5个8nt亚序列；这5个亚序列依次错开一个碱基而重叠7个碱基。亚序列中，A、T、C、G4个碱基自由组合而形成的所有可能的序列共有65536种。

测序芯片任何线状的单链DNA或RNA序列均可被分解为一个序列26人工合成的已知序列的所有可能的nt寡核苷酸探针与一个未知的荧光标记DNA/RNA序列杂交，通过对杂交荧光信号检测，检出所有能与靶DNA杂交的寡核苷酸，从而推出靶DNA中的所有8nt亚序列，最后由计算机对大量荧光信号的谱型（pattern）数据进行分析，重构靶DNA的互补寡核苷酸序列。

测序芯片原理人工合成的已知序列的所有可能的nt寡核苷酸探针与一个未知的荧27测序芯片原理芯片测序的原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法。如图在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。

测序芯片原理芯片测序的原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序28ChIP-chip(chromatinimmunoprecipitation（ChIP)：在生理状态下把胞内蛋白质和DNA甲醛作用下交联在一起，用超声波打碎为0.2-2kb的染色体小片段，然后通过目的蛋白质特异性抗体沉淀此复合物，获得特异地作用于目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片段的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

ChIP-chip：将共沉淀的DNA和合适的对照用荧光标记，加在载玻片上，用于芯片分析。使用外源性DNA作为背景，免疫沉淀DNA与作为背景的对照进行比较，可以找到特异性蛋白在基因组中的结合位点。

POI，proteinofinterestChIP-chip(chromatinimmunoprec29表达谱芯片基因表达谱芯片是采用DNA片段作探针，固化在芯片上；将待测样品（处理组）与对照样品的cDNA以两种不同的荧光分子进行标记，然后同时与芯片进行杂交，通过分析两种样品与探针杂交的荧光强度的比值，来检测基因表达水平的变化。

表达谱芯片基因表达谱芯片是采用DNA片段作探针，固化在芯片上30单核苷酸多态芯片(SNP-chip)WhatareSNPs?SNPsmakeup90%ofallhumangeneticvariations,≥1%occurevery100to300basesalongthehumangenome,onaverage.SNPscanaffecthowhumansdevelopdiseases,respondtopathogens,chemicals,drugs,etc.AsaconsequenceSNPsareofgreatvaluetobiomedicalresearchandindevelopingpharmacyproducts.Wehavetwoalleles:Frommomandfromdad；EachoneiseitherAorB,soyoucanbeAA,AB,BBSNP-chipisusedtodeterminegenotypefor1000sSNPsatatime单核苷酸多态芯片(SNP-chip)WhatareSNP31单核苷酸多态芯片(SNP-chip)ThethreemandatorycomponentsoftheSNParraysare:Anarraycontainingimmobilizedallele-specificoligonucleotide(ASO)probes.SNP-chiphasmillionsofspots,eachcontainingadifferentsingle-strandedoligonucleotidethatcontainsasiteofvariation.（ASOprobes，600,000SNPsforanAffymetrixSNP-chip）EachoftheprobesoneachpositionofthechipcorrespondstoageneticlocusForeachsuchsite,thefouroligonucleotidescontainingeachofthefourpossiblebasesatthatsiteareadjacenttoeachotheronthechipFragmentednucleicacidsequencesoftarget,labeledwithfluorescentdyes.Adetectionsystemthatrecordsandinterpretsthehybridizationsignal.单核苷酸多态芯片(SNP-chip)Thethreema32单核苷酸多态芯片(SNP-chip)hybridizationconditions！单核苷酸多态芯片(SNP-chip)hybridizatio33第14讲微阵列技术课件34比较基因组杂交芯片（CGH-chip）Probe：severalthousandevenlyspacedclonedDNAfragmentsoroligonucleotides,whichhavebeenspottedintriplicateonthearray.比较基因组杂交芯片（CGH-chip）Probe：sever35Thesamplehasaduplication.Thesamplehasaduplication.364.DNA芯片进行实验过程生物学问题的提出、探针设计与制备以及芯片制备

“根和叶的基因表达有和不同？”把探针固定于载体表面样品制备（核酸提纯、扩增、标记）mRNA分离与富集、探针标记、PCR、微阵列点制杂交反应（样本与互补模板形成双链）杂交、基片处理、封闭、清洗结果探测（共聚焦扫描，双色激光）最常用荧光法：选择荧光通道、激光设置、生成图像数据处理和建模（定量软件，数据库检索）数据定量、计算比率、聚类分析

4.DNA芯片进行实验过程生物学问题的提出、探针设计与制备37Stepsinamicroarrayexperiment

Stepsinamicroarrayexperime38芯片制备①探针的设计：根据应用目的不同，设计不同的固定于芯片上的探针。表达型芯片探针的设计：不需要知道待测样品中靶基因的精确细节；序列的特异性应放在首要位置（特定区域的几套寡聚核苷酸）单核苷酸多态性检测芯片探针的设计：多态性分析、突变检测或者基因测序时，每个核苷酸或突变位点都必须检测出来。

等长移位设计法通常设计出一套四种寡聚核苷酸，在靶序列上跨越每个位点，只在中央位点碱基有所不同，根据每套探针在某一特点位点的杂交严谨程度，即可测定出该碱基的种类。基因表达检测芯片：只需设计出针对基因中的即可。特定突变位点探针的设计：叠瓦式策略

②探针的合成原位合成（insitusynthesis）PCR,RT-PCR（点样法）

芯片制备①探针的设计：根据应用目的不同，设计不同的固定于39AffymetrixGeneChipAffymetrixGeneChip40基因芯片的合成方法点样芯片：多用于大片段DNANaturalDNA(PCRProducts)geneexpressiongenomicDNAdetection光蚀刻原位合成法：适用于寡核苷酸ArtificialDNA(oligonucleotide，30nt左右)geneexpressionSNPgenotypinggenemutationon-chipSynthesis（insitusynthesis）spotting基因芯片的合成方法点样芯片：多用于大片段DNA光蚀刻原位合成41光蚀刻原位合成法原理是在经过处理的载玻片表面铺上一层连接分子（linker），其羟基上加有光敏保护基团，可用光照除去，用特制的光刻掩膜（photolithographicmask）保护不需要合成的部位，而暴露合成部位，在光作用下去除羟基上的保护基团，游离羟基，利用化学反应加上第一个核苷酸，所加核苷酸种类及在芯片上的部位预先设定，所引入的核苷酸带有光敏保护基团，以便下一步合成。然后按上述方法在其它位点加上另外三种核苷酸完成第一位核苷酸的合成，因而N个核苷酸长的芯片需要4N个步骤。每一个独特序列的探针称为一个“feature”，这样的芯片便具有4N个“feature”，包含了全部长度为N的核苷酸序列。光蚀刻原位合成法原理是在经过处理的载玻片表面铺上一层连接分子42原位光刻合成基因芯片原理光源遮蔽板芯片原位光刻合成基因芯片原理光源遮蔽板芯片43arrayprobesA3×3arrayCGACGACACGAGCGAGCNucleotideDepositionSequenceACGAMask1AAAAA光蚀刻原位合成法实例arrayprobesA3×3arrayCGACGAC44arrayprobesA3×3arrayCGACGACACGAGCGAGCNucleotideDepositionSequenceACGC

Mask2CCCCCCAAAAA光蚀刻原位合成法实例arrayprobesA3×3arrayCGACGAC45A3×3arrayCGACGACACGAGCGAGCGMask3CCCCCCAAAAAGGGGGGCGACGACGAGCGAGCAC光蚀刻原位合成法实例完成的芯片NucleotideDepositionSequenceACGA3×3arrayCGACGACACGAGCGAGCG46光蚀刻原位合成特征密集程度高可合成任意序列的寡聚核苷酸特异性较差寡聚核苷酸合成长度有限，约20-25个核苷酸碱基。随长度增加，合成错误率增高成本较高，设计和制造较烦琐费时常用于基因类型的分析，如突变、正常变异（多态性）光蚀刻原位合成特征密集程度高47点样预先合成好的探针通过类似于喷墨打印机的技术喷射到玻璃基片表面，或者用针头点在片基上。全部或部分cDNA：约5005000个核苷酸碱基，通常用于两种或以上样本的相关基因表达分析。点样预先合成好的探针通过类似于喷墨打印机的技术喷射到玻璃基片48点样仪点样仪49核酸提纯（mRNA分离）与富集（PCR）根据样品来源、基因含量及检测方法和分析目的不同，采用的基因分离、扩增及标记方法各异。当然，常规的基因分离、扩增及标记技术完全可以采用，但操作繁琐且费时。高度集成的微型样品处理系统如细胞分离芯片及基因扩增芯片等是实现上述目的的有效手段和发展方向。样品制备样品制备50cDNA“A”Cy5

labeledcDNA“B”Cy3

labeledHybridizationScanningLaser1Laser2+AnalysisImageCapture样品标记

为了获得基因的杂交信号必须对目的基因进行标记，目前采用的最普遍的荧光标记方法。cDNA“A”cDNA“B”HybridizationS51

表达检测需要长的杂交时间，更高的严谨性，更高的样品浓度和低温度，这有利于增加检测的特异性和低拷贝基因检测的灵敏度。突变检测，要鉴别出单碱基错配，需要更高的杂交严谨性和更短的时间！杂交杂交52Ayellow

spot→agenethathybridizedtobothgreenandredcDNA:expressedbothinhealthycellsandcancercells!检测用计算机控制的高分辨荧光扫描仪可获得结合于芯片上目的基因的荧光信号，通过计算机处理即可给出目的基因的结构或表达信息。Ayellowspot→agenethathy53生物芯片检测原理杂交信号的检测是DNA芯片技术中的重要组成部分。由于DNA芯片本身的结构及性质，需要确定杂交信号在芯片上的位置，尤其是大规模DNA芯片由于其面积小，密度大，点样量很少，所以杂交信号较弱，需要使用光电倍增管或冷却的电荷偶连照相机(charged-coupleddevicecamera，CCD)摄像机等弱光信号探测装置。此外，大多数DNA芯片杂交信号谱型除了分布位点以外还需要确定每一点上的信号强度，以确定是完全杂交还是不完全杂交，因而探测方法的灵敏度及线性响应也是非常重要的。杂交信号探测系统主要包括杂交信号产生、信号收集及传输和信号处理及成像三个部分组成。生物芯片检测原理杂交信号的检测是DNA芯片技术中的重要组成部54荧光标记杂交信号的检测方法生物素标记方法中的杂交信号探测荧光标记杂交信号的检测方法55荧光标记杂交信号的检测方法激光扫描荧光显微镜:将杂交后的芯片经处理后固定在计算机控制的二维传动平台上，并将一物镜置于其上方，由氩离子激光器产生激发光经滤波后通过物镜聚焦到芯片表面，激发荧光标记物产生荧光，光斑半径约为5－10μm。同时通过同一物镜收集荧光信号经另一滤波片滤波后，由冷却的光电倍增管探测，经模数转换板转换为数字信号。通过计算机控制传动平台X－Y方向上步进平移，DNA芯片被逐点照射，所采集荧光信号构成杂交信号谱型，送计算机分析处理，最后形成20μm象素的图像。这种方法分辨率高、图像质量较好。荧光标记杂交信号的检测方法激光扫描荧光显微镜:将杂交后的芯片56

激光扫描共焦显微镜与激光扫描荧光显微镜结构非常相似，但是由于采用了共焦技术因而更具优越性。这种方法可以在荧光标记分子与DNA芯片杂交的同时进行杂交信号的探测，而无须清洗掉未杂交分子，从而简化了操作步骤大大提高了工作效率。通过计算机控制激光束或样品池的移动，便可实现对芯片的二维扫描，移动步长与芯片上寡核苷酸的间距匹配，在几分钟至几十分钟内即可获得荧光标记杂交信号图谱。其特点是灵敏度和分辨率较高，扫描时间长，比较适合研究用。现在Affymetrix公司已推出商业化样机，整套系统约12万美元。

激光扫描共焦显微镜与激光扫描荧光显微镜结构非常相似，但是由57采用了CCD相机的荧光显微镜这种探测装置与以上的扫描方法都是基于荧光显微镜，但是以CCD相机作为信号接收器而不是光电倍增管，因而无须扫描传动平台。由于采用了CCD相机，因而大大提高了获取荧光图像的速度，曝光时间可缩短至零点几秒至十几秒。其特点是扫描时间短，灵敏度和分辨率较低，比较适合临床诊断用

采用了CCD相机的荧光显微镜这种探测装置与以上的扫描方法都是58②生物素标记方法中的杂交信号探测

②生物素标记方法中的杂交信号探测595.基因芯片的应用基因功能分析研究检测与疾病相关的基因,进而用于疾病诊断药物筛选,检测基因突变其他(环境化学毒物的筛选

\体质医学的研究)5.基因芯片的应用基因功能分析研究60目前市场情况:基因芯片:>90%药物筛选:40%诊断:10%基因型检测:25%其他:<1%目前市场情况:基因芯片:>90%61基因功能分析研究将成千上万个我们克隆到的特异性靶基因固定在一块芯片上，对来源于不同个体不同组织不同细胞周期不同发育阶段不同分化阶段不同病变不同刺激（包括不同诱导不同治疗手段）下细胞内的mRNA或逆转录所得的cDNA进行检测，从而对这些基因表达的个体特异性组织特异性发育阶段特异性分化阶段特异性。进行综合评定与判断，极大加快这些基因功能的确立。基因功能分析研究将成千上万个我们克隆到的特异性靶基因62癌症、心血管疾病、血液病、遗传性疾病、神经系统疾病、感染性疾病、免疫反应相关性疾病毒物引起的损伤个体化医学等检测与疾病相关的基因,

进而用于疾病诊断癌症、检测与疾病相关的基因,63第14讲微阵列技术课件64药物筛选

在基因功能研究基础上，特别是确立了与某些疾病相关基因的表达变化情况后，就可针对疾病发生机理进行药物筛选工作。将这些基因特异性片段固定在芯片上，研究病变组织和正常组只在某些药物刺激下这些基因表达的变化，可快速判断药物作用的效果，并进行高通量筛选（highthroughoutscreening），可使新药开发获得技术上的突破。药物筛选在基因功能研究基础上，特别是确立了与某些疾病65基因芯片的发展方向进一步提高探针阵列的集成度，如有多家公司的芯片阵列的集成度已达1.0×105左右，这样基因数量在1.0×105以下的生物体（大多数生物体）的基因表达情况只用一块芯片即可包括。

提高检测的灵敏度和特异性。如检测系统的优化组合和采用高灵敏度的荧光标志。多重检测以提高特异性，减少假阳性。高自动化、方法趋于标准化、简单化，成本降低。价格高昂是目前推广应用的主要障碍之一，但随着技术的革新，基因芯片的价格将会大大降低。基因芯片的发展方向进一步提高探针阵列的集成度，如有多家公司的66高稳定性。寡核苷酸探针、RNA均不稳定，易受破坏。而肽核酸（PNA）有望取代普通RNA/DNA探针，可以确保探针的高稳定性。研制新的应用芯片，如1999年美国环保局(EPA)组织专家研讨会，讨论了毒理学芯片的发展策略。近来多种新的生物芯片不断问世，这是物理学、生物学与计算机科学共同的结晶。研制芯片新检测系统和分析软件，以充分利用生物信息。芯片技术将与其它技术结合使用，如基因芯片PCR、纳米芯片等。不同生物芯片间综合应用，如蛋白质芯片与基因芯片间相互作用等，可用于了解蛋白质与基因间相互作用的关系。成为常规的实验技术，正如个人电脑的迅速普及一样！高稳定性。寡核苷酸探针、RNA均不稳定，易受破坏。而肽核酸（67第14讲微阵列技术课件68Lab-on-a-chip芯片实验室是指通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建的微型生物化学分析系统，把生物和化学等领域中所涉及的样品制备、生物与化学反应、分离检测等基本操作单位集成或基本集成于几平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的一种技术原来要在很大的实验室中需要很多个试管来完成的实验反应，现在在一张小小的芯片上就完成了。计算机芯片使计算微型化，芯片实验室使实验室微型化Lab-on-a-chip芯片实验室是指通过微加工技术和微电69把化学生物实验室缩小并集成到芯片的尺度，为化学生物过程提供微平台芯片实验室生物亲和芯片微流控芯片

(微全分析系统)基因芯片蛋白质芯片组织芯片分离芯片(电泳芯片)合成芯片反应芯片(PCR芯片)细胞芯片－－操纵，筛选，计数等等把化学生物实验室缩小并集成到芯片的尺度，为化学生物过程提供微70为什么需要芯片实验室

生命领域(如医疗诊断制药等等)对生物体系的分离分析工作量猛增要求：高效率低成本少样品低消耗低污染大量生产可携带为什么需要芯片实验室生命领域(如医疗诊断制药等等)对生物体71将传统实验室加以芯片化的

主要困难在于尺度效应

尺度变化:长度100-1000倍面积1万－1百万倍体积1百万倍-10亿倍制造上的困难检测灵敏度的困难（光程短）将传统实验室加以芯片化的

主要困难在于尺度效应尺度变72实验室加以芯片化原理上的转化液体量度,输运,混合,热传导等等传统过程和设备必须适应尺寸效应表面自由能与表面张力现象上升为主导液体运动的因素，可利用以控制液体的存储和导向分配流动，成为基于新原理的限定体积、驱动、阀门利用表面张力控制界面的亲水、憎水性以实现：芯片中的纳升级液体的定体积取样，注样，混合等等；利用电迁移率差异及电场控制：实现分离并聚焦的聚焦电泳技术利用双电层的电荷效应实现灵巧电渗泵－－芯片中的的样品多道注入原来依靠实验室人员利用移液管、量筒、注射器、输液泵、阀门等等实验仪器进行的加样等动作必须代以自动化的微流操纵必须研究基于新原理的限定体积、驱动、阀门以及其他微小而又能实现各种功能的部件实验室加以芯片化原理上的转化液体量度,输运,混合,热传导等等73TheGenotyper,aDNAlabcondensedtoasiliconchip,mayonedaybeabletoquicklydecipherdifferentstrainsofinfluenza.

TheGenotyper,aDNAlabconde74

生物信息学

第十四讲微阵列技术及其应用

生物信息学

第十四讲751997年，《财富》杂志就报道说，“在20世纪科技史上有两件事影响深远：一是微电子芯片，它是计算机和许多家电的‘心脏’，改变了我们的经济和文化生活，并已进入每一个家庭；另一就是生物芯片，它将改变生命科学的研究方式，革新医学诊断和治疗，极大地提高人口素质和健康水平。”1997年，《财富》杂志就报道说，“在20世纪科技史上有两件761.生物芯片的诞生

生物芯片（Biochip,Bioarray,microarray）：将高密度核酸、抗原、抗体、细胞或组织等生物识别分子按预先设置的排列固定于一种载体（如硅片、玻片及高聚物载体等）表面，利用生物分子的特意性亲和反应，如DNA-DNA杂交、DNA-RNA杂交、抗原-抗体以及受体-配体之间的特异性结合，检测生物样品中对应生物分子的有无、多少或者结构改变等。高通量、微型化和自动化

1.生物芯片的诞生生物芯片（Biochip,Bioarr77在许多情况下，生物学问题最终的解决都源于技术上的突破。

——MarkSchena

在许多情况下，生物学问题最终的解决都源于技术上的突破。78后基因组时代，蛋白组学，涌现出许多功能强大的研究方法和研究工具，最突出的就是细胞蛋白质二维凝胶电泳（2-D-gel）（及相应的质谱法测蛋白分子量）和生物芯片（Biochip）技术

生物科学正迅速地演变为一门信息科学生物芯片是信息时代的产物，横跨：生命科学、物理学、计算机科学、微电子技术光电技术、材料科学、等现代高科技

后基因组时代，蛋白组学，涌现出许多功能强大的研究方法和研究工79生物芯片发展历史Southern&NorthernBlotDotBlotMacroarrayMicroarraySouthernblot可以被看作是生物芯片的雏形

生物芯片发展历史Southern&NorthernDo802.生物芯片（微阵列）是如何定义的？必须符合：①有规则的；②显微尺度的；③平面的；④特异性的。2.生物芯片（微阵列）是如何定义的？必须符合：81①规则的微阵列微阵列上的点按照行和列规则地排列而非无规则排列；点的大小和点间距均一而非不均一；点的位置明确而非模棱两可。①规则的微阵列微阵列上的点按照行和列规则地排列而非无规则排列82②显微尺度的点显微尺度（microscopic):是一个物体若没有显微镜的帮助，不能清楚地被看见。一般以小于1mm为界。微阵列：光引导原位合成的点：15～30µm点制的点：50～350µm组织芯片的点：200～600µm②显微尺度的点显微尺度（microscopic):是一个物体83一块指甲大小基因芯片的密度：100-1millionDNA探针/1cm2一块指甲大小基因芯片的密度：100-1millionDN84③平面基片平面基片是像玻璃、塑料、硅片一样平行不能弯曲的基质载体。玻片是微阵列中用得最为广泛的基质载体。非平面基片：尼龙膜、硝酸纤维素膜等。平坦的表面优点：适合大规模自动化生产；为光掩膜、接触式针点样、喷墨式非接触点样和其它制备工序提供了精密的距离，确保制备微阵列的高质量；使扫描和成像变得容易。③平面基片平面基片是像玻璃、塑料、硅片一样平行不能弯曲的基质85④特异性吸附微阵列上的每一个点能与标记好的探针混合物中的一种分子发生吸附，才能对此基因或基因产物进行精确的检测④特异性吸附微阵列上的每一个点能与标记好的探针混合物中的一种86Principle：Hybridizationofthetargettotheprobe

Principle：Hybridizationofthe87核酸分子固相杂交方法菌落原位杂交（Colonyinsituhybridization）Southern印迹杂交（Southernblot）Northern印迹杂交（Northernblot）斑点杂交（Dotblot）组织原位杂交（Tissueinsituhybridization）核酸分子固相杂交方法菌落原位杂交（Colonyinsit88Hybridizationmethods

Hybridizationmethods89SouthernandNorthernblothybridizationSouthernandNorthernblothyb90ColonyinsituhybridizationColonyinsituhybridization91Fluorescentinsituhybridization(FISH)Fluorescentinsituhybridizat92抗原抗体酶联免疫吸附测定

(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)抗原抗体酶联免疫吸附测定(Enzyme-LinkedIm933.Biochip的类型

①狭义：微阵列芯片，主要包括cDNA微阵列、寡核苷酸微阵列、蛋白质微阵列和小分子化合物微阵列等②广义：能对生物成分或生物分子进行快速并行处理和分析的厘米见方的固体薄型器件，主要还包括微流体芯片和“芯片实验室”。3.Biochip的类型①狭义：微阵列芯片，主要包括cD94生物芯片的类型基因芯片genechip：又称DNA芯片,是根据核酸杂交的原理，将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析。蛋白质芯片proteinchip：利用抗体与抗原特异性结合即免疫反应的原理，将蛋白质分子（抗原或抗体）结合到固相支持物上，形成蛋白质微阵列，即蛋白质芯片。组织芯片tissuemicroarray芯片实验室(labs-on-chip)

：微流体芯片：微流控芯片技术(Microfluidics)是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程。生物芯片的类型基因芯片genechip：又称DNA芯片,是95第14讲微阵列技术课件96蛋白质芯片蛋白质芯片（proteinchip）,又称蛋白质微阵列，是指以蛋白质或多肽作为配基,将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列；用标记了荧光的蛋白质或其它分子与之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白质之间或蛋白质与其它分子之间的相互作用关系。蛋白质芯片蛋白质芯片（proteinchip）,又称蛋白97Therearetwogeneraltypesofproteinmicroarray:Analyticalproteinmicroarraysinvolveahigh-densityarrayofaffinityreagents(e.g.antibodiesorantigens)thatareusedfordetectingproteinsinacomplexmixture.Functionalproteinchipsareconstructedbyimmobilizinglargenumbersofpurifiedproteinsonasolidsurface.Ithasanenormouspotentialinassayingforawiderangeofbiochemicalactivities(protein-protein,protein-lipid,protein-nucleicacid,andenzyme-substrateinteractions),aswellasdruganddrugtargetidentification.Therearetwogeneraltypesof98组织芯片它将数十个甚至上千个不同个体的组织标本集成在一张固相载体上，为医学分子生物学提供了一种高通量、大样本以及快速的分子水平的分析工具研究者一次可有效利用成百上千份自然或出于疾病状态下的组织标本来研究特定基因及其所表达的蛋白质与疾病之间的相关关系对于疾病的分子诊断，预后指标和治疗靶点的定位，抗体和药物的筛选等方面均有十分重要的实用价值。组织芯片它将数十个甚至上千个不同个体的组织标本集成在一张固相99测序芯片任何线状的单链DNA或RNA序列均可被分解为一个序列固定、错落而重叠的寡核苷酸，又称亚序列（subsequence）。例如可把寡核苷酸序列TTAGCTCATATG分解成5个8nt亚序列；这5个亚序列依次错开一个碱基而重叠7个碱基。亚序列中，A、T、C、G4个碱基自由组合而形成的所有可能的序列共有65536种。

测序芯片任何线状的单链DNA或RNA序列均可被分解为一个序列100人工合成的已知序列的所有可能的nt寡核苷酸探针与一个未知的荧光标记DNA/RNA序列杂交，通过对杂交荧光信号检测，检出所有能与靶DNA杂交的寡核苷酸，从而推出靶DNA中的所有8nt亚序列，最后由计算机对大量荧光信号的谱型（pattern）数据进行分析，重构靶DNA的互补寡核苷酸序列。

测序芯片原理人工合成的已知序列的所有可能的nt寡核苷酸探针与一个未知的荧101测序芯片原理芯片测序的原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法。如图在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。

测序芯片原理芯片测序的原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序102ChIP-chip(chromatinimmunoprecipitation（ChIP)：在生理状态下把胞内蛋白质和DNA甲醛作用下交联在一起，用超声波打碎为0.2-2kb的染色体小片段，然后通过目的蛋白质特异性抗体沉淀此复合物，获得特异地作用于目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片段的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

ChIP-chip：将共沉淀的DNA和合适的对照用荧光标记，加在载玻片上，用于芯片分析。使用外源性DNA作为背景，免疫沉淀DNA与作为背景的对照进行比较，可以找到特异性蛋白在基因组中的结合位点。

POI，proteinofinterestChIP-chip(chromatinimmunoprec103表达谱芯片基因表达谱芯片是采用DNA片段作探针，固化在芯片上；将待测样品（处理组）与对照样品的cDNA以两种不同的荧光分子进行标记，然后同时与芯片进行杂交，通过分析两种样品与探针杂交的荧光强度的比值，来检测基因表达水平的变化。

表达谱芯片基因表达谱芯片是采用DNA片段作探针，固化在芯片上104单核苷酸多态芯片(SNP-chip)WhatareSNPs?SNPsmakeup90%ofallhumangeneticvariations,≥1%occurevery100to300basesalongthehumangenome,onaverage.SNPscanaffecthowhumansdevelopdiseases,respondtopathogens,chemicals,drugs,etc.AsaconsequenceSNPsareofgreatvaluetobiomedicalresearchandindevelopingpharmacyproducts.Wehavetwoalleles:Frommomandfromdad；EachoneiseitherAorB,soyoucanbeAA,AB,BBSNP-chipisusedtodeterminegenotypefor1000sSNPsatatime单核苷酸多态芯片(SNP-chip)WhatareSNP105单核苷酸多态芯片(SNP-chip)ThethreemandatorycomponentsoftheSNParraysare:Anarraycontainingimmobilizedallele-specificoligonucleotide(ASO)probes.SNP-chiphasmillionsofspots,eachcontainingadifferentsingle-strandedoligonucleotidethatcontainsasiteofvariation.（ASOprobes，600,000SNPsforanAffymetrixSNP-chip）EachoftheprobesoneachpositionofthechipcorrespondstoageneticlocusForeachsuchsite,thefouroligonucleotidescontainingeachofthefourpossiblebasesatthatsiteareadjacenttoeachotheronthechipFragmentednucleicacidsequencesoftarget,labeledwithfluorescentdyes.Adetectionsystemthatrecordsandinterpretsthehybridizationsignal.单核苷酸多态芯片(SNP-chip)Thethreema106单核苷酸多态芯片(SNP-chip)hybridizationconditions！单核苷酸多态芯片(SNP-chip)hybridizatio107第14讲微阵列技术课件108比较基因组杂交芯片（CGH-chip）Probe：severalthousandevenlyspacedclonedDNAfragmentsoroligonucleotides,whichhavebeenspottedintriplicateonthearray.比较基因组杂交芯片（CGH-chip）Probe：sever109Thesamplehasaduplication.Thesamplehasaduplication.1104.DNA芯片进行实验过程生物学问题的提出、探针设计与制备以及芯片制备

“根和叶的基因表达有和不同？”把探针固定于载体表面样品制备（核酸提纯、扩增、标记）mRNA分离与富集、探针标记、PCR、微阵列点制杂交反应（样本与互补模板形成双链）杂交、基片处理、封闭、清洗结果探测（共聚焦扫描，双色激光）最常用荧光法：选择荧光通道、激光设置、生成图像数据处理和建模（定量软件，数据库检索）数据定量、计算比率、聚类分析

4.DNA芯片进行实验过程生物学问题的提出、探针设计与制备111Stepsinamicroarrayexperiment

Stepsinamicroarrayexperime112芯片制备①探针的设计：根据应用目的不同，设计不同的固定于芯片上的探针。表达型芯片探针的设计：不需要知道待测样品中靶基因的精确细节；序列的特异性应放在首要位置（特定区域的几套寡聚核苷酸）单核苷酸多态性检测芯片探针的设计：多态性分析、突变检测或者基因测序时，每个核苷酸或突变位点都必须检测出来。

等长移位设计法通常设计出一套四种寡聚核苷酸，在靶序列上跨越每个位点，只在中央位点碱基有所不同，根据每套探针在某一特点位点的杂交严谨程度，即可测定出该碱基的种类。基因表达检测芯片：只需设计出针对基因中的即可。特定突变位点探针的设计：叠瓦式策略

②探针的合成原位合成（insitusynthesis）PCR,RT-PCR（点样法）

芯片制备①探针的设计：根据应用目的不同，设计不同的固定于113AffymetrixGeneChipAffymetrixGeneChip114基因芯片的合成方法点样芯片：多用于大片段DNANaturalDNA(PCRProducts)geneexpressiongenomicDNAdetection光蚀刻原位合成法：适用于寡核苷酸ArtificialDNA(oligonucleotide，30nt左右)geneexpressionSNPgenotypinggenemutationon-chipSynthesis（insitusynthesis）spotting基因芯片的合成方法点样芯片：多用于大片段DNA光蚀刻原位合成115光蚀刻原位合成法原理是在经过处理的载玻片表面铺上一层连接分子（linker），其羟基上加有光敏保护基团，可用光照除去，用特制的光刻掩膜（photolithographicmask）保护不需要合成的部位，而暴露合成部位，在光作用下去除羟基上的保护基团，游离羟基，利用化学反应加上第一个核苷酸，所加核苷酸种类及在芯片上的部位预先设定，所引入的核苷酸带有光敏保护基团，以便下一步合成。然后按上述方法在其它位点加上另外三种核苷酸完成第一位核苷酸的合成，因而N个核苷酸长的芯片需要4N个步骤。每一个独特序列的探针称为一个“feature”，这样的芯片便具有4N个“feature”，包含了全部长度为N的核苷酸序列。光蚀刻原位合成法原理是在经过处理的载玻片表面铺上一层连接分子116原位光刻合成基因芯片原理光源遮蔽板芯片原位光刻合成基因芯片原理光源遮蔽板芯片117arrayprobesA3×3arrayCGACGACACGAGCGAGCNucleotideDepositionSequenceACGAMask1AAAAA光蚀刻原位合成法实例arrayprobesA3×3arrayCGACGAC118arrayprobesA3×3arrayCGACGACACGAGCGAGCNucleotideDepositionSequenceACGC

Mask2CCCCCCAAAAA光蚀刻原位合成法实例arrayprobesA3×3arrayCGACGAC119A3×3arrayCGACGACACGAGCGAGCGMask3CCCCCCAAAAAGGGGGGCGACGACGAGCGAGCAC光蚀刻原位合成法实例完成的芯片NucleotideDepositionSequenceACGA3×3arrayCGACGACACGAGCGAGCG120光蚀刻原位合成特征密集程度高可合成任意序列的寡聚核苷酸特异性较差寡聚核苷酸合成长度有限，约20-25个核苷酸碱基。随长度增加，合成错误率增高成本较高，设计和制造较烦琐费时常用于基因类型的分析，如突变、正常变异（多态性）光蚀刻原位合成特征密集程度高121点样预先合成好的探针通过类似于喷墨打印机的技术喷射到玻璃基片表面，或者用针头点在片基上。全部或部分cDNA：约5005000个核苷酸碱基，通常用于两种或以上样本的相关基因表达分析。点样预先合成好的探针通过类似于喷墨打印机的技术喷射到玻璃基片122点样仪点样仪123核酸提纯（mRNA分离）与富集（PCR）根据样品来源、基因含量及检测方法和分析目的不同，采用的基因分离、扩增及标记方法各异。当然，常规的基因分离、扩增及标记技术完全可以采用，但操作繁琐且费时。高度集成的微型样品处理系统如细胞分离芯片及基因扩增芯片等是实现上述目的的有效手段和发展方向。样品制备样品制备124cDNA“A”Cy5

labeledcDNA“B”Cy3

labeledHybridizationScanningLaser1Laser2+AnalysisImageCapture样品标记

为了获得基因的杂交信号必须对目的基因进行标记，目前采用的最普遍的荧光标记方法。cDNA“A”cDNA“B”HybridizationS125

表达检测需要长的杂交时间，更高的严谨性，更高的样品浓度和低温度，这有利于增加检测的特异性和低拷贝基因检测的灵敏度。突变检测，要鉴别出单碱基错配，需要更高的杂交严谨性和更短的时间！杂交杂交126Ayellow

spot→agenethathybridizedtobothgreenandredcDNA:expressedbothinhealthycellsandcancercells!检测用计算机控制的高分辨荧光扫描仪可获得结合于芯片上目的基因的荧光信号，通过计算机处理即可给出目的基因的结构或表达信息。Ayellowspot→agenethathy127生物芯片检测原理杂交信号的检测是DNA芯片技术中的重要组成部分。由于DNA芯片本身的结构及性质，需要确定杂交信号在芯片上的位置，尤其是大规模DNA芯片由于其面积小，密度大，点样量很少，所以杂交信号较弱，需要使用光电倍增管或冷却的电荷偶连照相机(charged-coupleddevicecamera，CCD)摄像机等弱光信号探测装置。此外，大多数DNA芯片杂交信号谱型除了分布位点以外还需要确定每一点上的信号强度，以确定是完全杂交还是不完全杂交，因而探测方法的灵敏度及线性响应也是非常重要的。杂交信号探测系统主要包括杂交信号产生、信号收集及传输和信号处理及成像三个部分组成。生物芯片检测原理杂交信号的检测是DNA芯片技术中的重要组成部128荧光标记杂交信号的检测方法生物素标记方法中的杂交信号探测荧光标记杂交信号的检测方法129荧光标记杂交信号的检测方法激光扫描荧光显微镜:将杂交后的芯片经处理后固定在计算机控制的二维传动平台上，并将一物镜置于其上方，由氩离子激光器产生激发光经滤波后通过物镜聚焦到芯片表面，激发荧光标记物产生荧光，光斑半径约为5－10μm。同时通过同一物镜收集荧光信号经另一滤波片滤波后，由冷却的光电倍增管探测，经模数转换板转换为数字信号。通过计算机控制传动平台X－Y方向上步进平移，DNA芯片被逐点照射，所采集荧光信号构成杂交信号谱型，送计算机分析处理，最后形成20μm象素的图像。这种方法分辨率高、图像质量较好。荧光标记杂交信号的检测方法激光扫描荧光显微镜:将杂交后的芯片130

激光扫描共焦显微镜与激光扫描荧光显微镜结构非常相似，但是由于采用了共焦技术因而更具优越性。这种方法可以在荧光标记分子与DNA芯片杂交的同时进行杂交信号的探测，而无须清洗掉未杂交分子，从而简化了操作步骤大大提高了工作效率。通过计算机控制激光束或样品池的移动，便可实现对芯片的二维扫描，移动步长与芯片上寡核苷酸的间距匹配，在几分钟至几十分钟内即可获得荧光标记杂交信号图谱。其特点是灵敏度和分辨率较高，扫描时间长，比较适合研究用。现在Affymetrix公司已推出商业化样机，整套系统约12万美元。

激光扫描共焦显微镜与激光扫描荧光显微镜结构非常相似，但是由131采用了CCD相机的荧光显微镜这种探测装置与以上的扫描方法都是基于荧光显微镜，但是以CCD相机作为信号接收器而不是光电倍增管，因而无须扫描传动平台。由于采