荧光光谱分析方法及原理课件

参考书赵南明,周海梦.生物物理学,高等教育出版社,2000EmissionSpectroscopy,Chapter11,inK.E.vanHolde.W.C.JohnsonandP.S.HoedsPrinciplesofPhysicalBiochemistry,Prentice-Hall1998参考书1某些物质被一定波长的光照射时,会在一定时间内发射出波长比入射光长的光,如果这个时间比较短,这种光就称为荧光。荧光由一种能发荧光的矿物——茧石fluospa)而得名。我们这里要介绍的荧光,是指物质在吸收紫外光和可见光后发出的波长较长的紫外荧光或可见荧光除了紫外光和可见光可能激发荧光外,其它的光如红外光、X射线也可能激发出荧光,因此除紫外荧光或可见荧光外,还有红外荧光、X射线荧光等。某些物质被一定波长的光照射时,会在一定时2IndiscussingabsorptionwehavebeenconcernedentirelywiththeexcitationofamoleculefromitsgroundstatetoahigherenergylevelandhavegivennoconsiderationtothesubsequentfateoftheexcitedmoleculeInmanycasesthesequelisnotveryinterestingtheenergyistransferredasheattothesurroundingsInsomecaseslightisemittedbythesampleeitherasfluorescenceorphosphorescenceWewilldiscussthegeneralcharacteristicsofemissionandignoretheexceptionsIndiscussingabsorptionweha3荧光光谱的特点荧光光谱的特点4FluorescenceisatechniquefordetectingbiologicalmaterialsBarakandWebbdemonstratedthatboundtolowdensitylipoproteinmoleculescanbedetectedoncellsurfacesbymicroscopyusingasensitivevideocamera.Withevenmoresophisticatedmethodsothershavemovedtowarddetectionofsinglefluorophoremoleculesinalaser-excitedflowstream.Becausethissensitivitycancombinewitheaseofuseandthepotentialformultiparameteranalysis,fluorescencehasbecomewidelyusedinbiologyandmedicineFluorescenceisa5荧光光谱灵敏度高的原因荧头七辐射的波长比激发光浪长长,测量到的荧光频率与入射光的频率不同;荧光在各个方向上都有发射,因此可以在与入射光成直角的方向上检测这样,荧光不受来自激发光的本底的干扰,灵敏度大大高于紫外可见吸收光谱,测量用的样品量很少,且测量方法简便。荧光光谱灵敏度高的原因6荧光光谱第二个特点是荧光光谱能提供较多的参数,例如激发谱、发射谱、峰位、峰强度、荧光寿命、荧光偏振度等。荧光光谱还可以检测一些紫外-可见吸收光谱检测不到的时间过程过程。紫外和可见荧光涉及的是电子能级之间的跃迁,荧光产生包括两个过程:吸收以及随之而来的发射。每个过程发生的时间与跃迁频率的倒数是同一时间量级(大约1015秒),但两个过程中有一个时间延搁,大约为10秒,这段时间内分子处于激发态。激发态的寿命取决于辐射与非辐射之间的竟争。由于荧光有一定的寿命,因此可以检测一些时间过程与其寿命相当的过程。例如,生色团及其环境的变化过程在紫外可见吸收的10秒的过程中基本上是静止不变的,因此无法用紫外可见吸收光谱检测,但可以用荧光光谱检测荧光光谱第二个特点是7基本原理基本原理8fluorescence系间交连三线态(10°-1)102s-)电子能级基态Fluorescenceisemissionfromasingletstatewheretheelectronspinsinthemoleculearepairedfluorescence9fuorescenceexcitationbyabsorptionofenergylosesenergyasheatbyinternalconversionthemoleculehesitatesatthelowestvibrationallevelofthefirstsinglet,becausearelativelylargeamountofenergymustbelosttogotothegroundstateduringthishesitationoneofthreethingsmayhappenithemoleculemayfluoresceitmayconverttothetriplet(intersystemcrossingitmaygotothegroundstatewithoutemittingaphoton(anonradiativetransitionfuorescence10荧光光谱分析方法及原理课件11荧光光谱分析方法及原理课件12荧光光谱分析方法及原理课件13荧光光谱分析方法及原理课件14荧光光谱分析方法及原理课件15荧光光谱分析方法及原理课件16荧光光谱分析方法及原理课件17荧光光谱分析方法及原理课件18荧光光谱分析方法及原理课件19荧光光谱分析方法及原理课件20荧光光谱分析方法及原理课件21荧光光谱分析方法及原理课件22荧光光谱分析方法及原理课件23荧光光谱分析方法及原理课件24荧光光谱分析方法及原理课件25荧光光谱分析方法及原理课件26荧光光谱分析方法及原理课件27荧光光谱分析方法及原理课件28荧光光谱分析方法及原理课件29荧光光谱分析方法及原理课件30荧光光谱分析方法及原理课件31荧光光谱分析方法及原理课件32荧光光谱分析方法及原理课件33荧光光谱分析方法及原理课件34荧光光谱分析方法及原理课件35荧光光谱分析方法及原理课件36荧光光谱分析方法及原理课件37荧光光谱分析方法及原理课件38荧光光谱分析方法及原理课件39荧光光谱分析方法及原理课件40荧光光谱分析方法及原理课件41荧光光谱分析方法及原理课件42荧光光谱分析方法及原理课件43荧光光谱分析方法及原理课件44荧光光谱分析方法及原理课件45荧光光谱分析方法及原理课件46荧光光谱分析方法及原理课件47荧光光谱分析方法及原理课件48荧光光谱分析方法及原理课件49荧光光谱分析方法及原理课件50荧光光谱分析方法及原理课件51荧光光谱分析方法及原理课件52荧光光谱分析方法及原理课件53荧光光谱分析方法及原理课件54荧光光谱分析方法及原理课件55荧光光谱分析方法及原理课件56荧光光谱分析方法及原理课件57荧光光谱分析方法及原理课件58荧光光谱分析方法及原理课件59荧光光谱分析方法及原理课件60荧光光谱分析方法及原理课件61荧光光谱分析方法及原理课件62荧光光谱分析方法及原理课件63荧光光谱分析方法及原理课件64荧光光谱分析方法及原理课件65荧光光谱分析方法及原理课件66荧光光谱分析方法及原理课件67荧光光谱分析方法及原理课件68荧光光谱分析方法及原理课件69荧光光谱分析方法及原理课件70荧光光谱分析方法及原理课件71荧光光谱分析方法及原理课件72荧光光谱分析方法及原理课件73荧光光谱分析方法及原理课件74荧光光谱分析方法及原理课件75荧光光谱分析方法及原理课件76荧光光谱分析方法及原理课件77荧光光谱分析方法及原理课件78荧光光谱分析方法及原理课件79荧光光谱分析方法及原理课件80荧光光谱分析方法及原理课件81荧光光谱分析方法及原理课件82荧光光谱分析方法及原理课件83荧光光谱分析方法及原理课件84荧光光谱分析方法及原理课件85荧光光谱分析方法及原理课件86荧光光谱分析方法及原理课件87荧光光谱分析方法及原理课件88荧光光谱分析方法及原理课件89荧光光谱分析方法及原理课件90荧光光谱分析方法及原理课件91荧光光谱分析方法及原理课件92荧光光谱分析方法及原理课件93荧光光谱分析方法及原理课件94荧光光谱分析方法及原理课件95荧光光谱分析方法及原理课件96荧光光谱分析方法及原理课件97荧光光谱分析方法及原理课件98荧光光谱分析方法及原理课件99荧光光谱分析方法及原理课件100荧光光谱分析方法及原理课件101荧光光谱分析方法及原理课件102荧光光谱分析方法及原理课件103荧光光谱分析方法及原理课件104荧光光谱分析方法及原理课件105荧光光谱分析方法及原理课件106荧光光谱分析方法及原理课件107荧光光谱分析方法及原理课件108荧光光谱分析方法及原理课件109荧光光谱分析方法及原理课件110荧光光谱分析方法及原理课件111荧光光谱分析方法及原理课件112荧光光谱分析方法及原理课件113荧光光谱分析方法及原理课件114荧光光谱分析方法及原理课件115荧光光谱分析方法及原理课件116荧光光谱分析方法及原理课件117荧光光谱分析方法及原理课件118荧光光谱分析方法及原理课件119荧光光谱分析方法及原理课件120荧光光谱分析方法及原理课件121荧光光谱分析方法及原理课件122荧光光谱分析方法及原理课件123荧光光谱分析方法及原理课件124荧光光谱分析方法及原理课件125荧光光谱分析方法及原理课件126荧光光谱分析方法及原理课件127荧光光谱分析方法及原理课件128荧光光谱分析方法及原理课件129荧光光谱分析方法及原理课件130荧光光谱分析方法及原理课件131荧光光谱分析方法及原理课件132荧光光谱分析方法及原理课件133荧光光谱分析方法及原理课件134荧光光谱分析方法及原理课件135荧光光谱分析方法及原理课件136荧光光谱分析方法及原理课件137荧光光谱分析方法及原理课件138荧光光谱分析方法及原理课件139荧光光谱分析方法及原理课件140荧光光谱分析方法及原理课件141荧光光谱分析方法及原理课件142荧光光谱分析方法及原理课件143荧光光谱分析方法及原理课件144荧光光谱分析方法及原理课件145荧光光谱分析方法及原理课件146荧光光谱分析方法及原理课件147荧光光谱分析方法及原理课件148荧光光谱分析方法及原理课件149荧光光谱分析方法及原理课件150荧光光谱分析方法及原理课件151荧光光谱分析方法及原理课件152荧光光谱分析方法及原理课件153荧光光谱分析方法及原理课件154荧光光谱分析方法及原理课件155荧光光谱分析方法及原理课件156荧光光谱分析方法及原理课件157荧光光谱分析方法及原理课件158荧光光谱分析方法及原理课件159荧光光谱分析方法及原理课件160荧光光谱分析方法及原理课件161荧光光谱分析方法及原理课件162荧光光谱分析方法及原理课件163荧光光谱分析方法及原理课件164荧光光谱分析方法及原理课件165荧光光谱分析方法及原理课件166荧光光谱分析方法及原理课件167荧光光谱分析方法及原理课件168荧光光谱分析方法及原理课件169荧光光谱分析方法及原理课件170荧光光谱分析方法及原理课件171荧光光谱分析方法及原理课件172荧光光谱分析方法及原理课件173荧光光谱分析方法及原理课件174荧光光谱分析方法及原理课件175荧光光谱分析方法及原理课件176荧光光谱分析方法及原理课件177荧光光谱分析方法及原理课件178荧光光谱分析方法及原理课件179荧光光谱分析方法及原理课件180荧光光谱分析方法及原理课件181荧光光谱分析方法及原理课件182荧光光谱分析方法及原理课件183荧光光谱分析方法及原理课件184荧光光谱分析方法及原理课件185荧光光谱分析方法及原理课件186荧光光谱分析方法及原理课件187荧光光谱分析方法及原理课件188荧光光谱分析方法及原理课件189荧光光谱分析方法及原理课件190荧光光谱分析方法及原理课件191参考书赵南明,周海梦.生物物理学,高等教育出版社,2000EmissionSpectroscopy,Chapter11,inK.E.vanHolde.W.C.JohnsonandP.S.HoedsPrinciplesofPhysicalBiochemistry,Prentice-Hall1998参考书192某些物质被一定波长的光照射时,会在一定时间内发射出波长比入射光长的光,如果这个时间比较短,这种光就称为荧光。荧光由一种能发荧光的矿物——茧石fluospa)而得名。我们这里要介绍的荧光,是指物质在吸收紫外光和可见光后发出的波长较长的紫外荧光或可见荧光除了紫外光和可见光可能激发荧光外,其它的光如红外光、X射线也可能激发出荧光,因此除紫外荧光或可见荧光外,还有红外荧光、X射线荧光等。某些物质被一定波长的光照射时,会在一定时193IndiscussingabsorptionwehavebeenconcernedentirelywiththeexcitationofamoleculefromitsgroundstatetoahigherenergylevelandhavegivennoconsiderationtothesubsequentfateoftheexcitedmoleculeInmanycasesthesequelisnotveryinterestingtheenergyistransferredasheattothesurroundingsInsomecaseslightisemittedbythesampleeitherasfluorescenceorphosphorescenceWewilldiscussthegeneralcharacteristicsofemissionandignoretheexceptionsIndiscussingabsorptionweha194荧光光谱的特点荧光光谱的特点195FluorescenceisatechniquefordetectingbiologicalmaterialsBarakandWebbdemonstratedthatboundtolowdensitylipoproteinmoleculescanbedetectedoncellsurfacesbymicroscopyusingasensitivevideocamera.Withevenmoresophisticatedmethodsothershavemovedtowarddetectionofsinglefluorophoremoleculesinalaser-excitedflowstream.Becausethissensitivitycancombinewitheaseofuseandthepotentialformultiparameteranalysis,fluorescencehasbecomewidelyusedinbiologyandmedicineFluorescenceisa196荧光光谱灵敏度高的原因荧头七辐射的波长比激发光浪长长,测量到的荧光频率与入射光的频率不同;荧光在各个方向上都有发射,因此可以在与入射光成直角的方向上检测这样,荧光不受来自激发光的本底的干扰,灵敏度大大高于紫外可见吸收光谱,测量用的样品量很少,且测量方法简便。荧光光谱灵敏度高的原因197荧光光谱第二个特点是荧光光谱能提供较多的参数,例如激发谱、发射谱、峰位、峰强度、荧光寿命、荧光偏振度等。荧光光谱还可以检测一些紫外-可见吸收光谱检测不到的时间过程过程。紫外和可见荧光涉及的是电子能级之间的跃迁,荧光产生包括两个过程:吸收以及随之而来的发射。每个过程发生的时间与跃迁频率的倒数是同一时间量级(大约1015秒),但两个过程中有一个时间延搁,大约为10秒,这段时间内分子处于激发态。激发态的寿命取决于辐射与非辐射之间的竟争。由于荧光有一定的寿命,因此可以检测一些时间过程与其寿命相当的过程。例如,生色团及其环境的变化过程在紫外可见吸收的10秒的过程中基本上是静止不变的,因此无法用紫外可见吸收光谱检测,但可以用荧光光谱检测荧光光谱第二个特点是198基本原理基本原理199fluorescence系间交连三线态(10°-1)102s-)电子能级基态Fluorescenceisemissionfromasingletstatewheretheelectronspinsinthemoleculearepairedfluorescence200fuorescenceexcitationbyabsorptionofenergylosesenergyasheatbyinternalconversionthemoleculehesitatesatthelowestvibrationallevelofthefirstsinglet,becausearelativelylargeamountofenergymustbelosttogotothegroundstateduringthishesitationoneofthreethingsmayhappenithemoleculemayfluoresceitmayconverttothetriplet(intersystemcrossingitmaygotothegroundstatewithoutemittingaphoton(anonradiativetransitionfuorescence201荧光光谱分析方法及原理课件202荧光光谱分析方法及原理课件203荧光光谱分析方法及原理课件204荧光光谱分析方法及原理课件205荧光光谱分析方法及原理课件206荧光光谱分析方法及原理课件207荧光光谱分析方法及原理课件208荧光光谱分析方法及原理课件209荧光光谱分析方法及原理课件210荧光光谱分析方法及原理课件211荧光光谱分析方法及原理课件212荧光光谱分析方法及原理课件213荧光光谱分析方法及原理课件214荧光光谱分析方法及原理课件215荧光光谱分析方法及原理课件216荧光光谱分析方法及原理课件217荧光光谱分析方法及原理课件218荧光光谱分析方法及原理课件219荧光光谱分析方法及原理课件220荧光光谱分析方法及原理课件221荧光光谱分析方法及原理课件222荧光光谱分析方法及原理课件223荧光光谱分析方法及原理课件224荧光光谱分析方法及原理课件225荧光光谱分析方法及原理课件226荧光光谱分析方法及原理课件227荧光光谱分析方法及原理课件228荧光光谱分析方法及原理课件229荧光光谱分析方法及原理课件230荧光光谱分析方法及原理课件231荧光光谱分析方法及原理课件232荧光光谱分析方法及原理课件233荧光光谱分析方法及原理课件234荧光光谱分析方法及原理课件235荧光光谱分析方法及原理课件236荧光光谱分析方法及原理课件237荧光光谱分析方法及原理课件238荧光光谱分析方法及原理课件239荧光光谱分析方法及原理课件240荧光光谱分析方法及原理课件241荧光光谱分析方法及原理课件242荧光光谱分析方法及原理课件243荧光光谱分析方法及原理课件244荧光光谱分析方法及原理课件245荧光光谱分析方法及原理课件246荧光光谱分析方法及原理课件247荧光光谱分析方法及原理课件248荧光光谱分析方法及原理课件249荧光光谱分析方法及原理课件250荧光光谱分析方法及原理课件251荧光光谱分析方法及原理课件252荧光光谱分析方法及原理课件253荧光光谱分析方法及原理课件254荧光光谱分析方法及原理课件255荧光光谱分析方法及原理课件256荧光光谱分析方法及原理课件257荧光光谱分析方法及原理课件258荧光光谱分析方法及原理课件259荧光光谱分析方法及原理课件260荧光光谱分析方法及原理课件261荧光光谱分析方法及原理课件262荧光光谱分析方法及原理课件263荧光光谱分析方法及原理课件264荧光光谱分析方法及原理课件265荧光光谱分析方法及原理课件266荧光光谱分析方法及原理课件267荧光光谱分析方法及原理课件268荧光光谱分析方法及原理课件269荧光光谱分析方法及原理课件270荧光光谱分析方法及原理课件271荧光光谱分析方法及原理课件272荧光光谱分析方法及原理课件273荧光光谱分析方法及原理课件274荧光光谱分析方法及原理课件275荧光光谱分析方法及原理课件276荧光光谱分析方法及原理课件277荧光光谱分析方法及原理课件278荧光光谱分析方法及原理课件279荧光光谱分析方法及原理课件280荧光光谱分析方法及原理课件281荧光光谱分析方法及原理课件282荧光光谱分析方法及原理课件283荧光光谱分析方法及原理课件284荧光光谱分析方法及原理课件285荧光光谱分析方法及原理课件286荧光光谱分析方法及原理课件287荧光光谱分析方法及原理课件288荧光光谱分析方法及原理课件289荧光光谱分析方法及原理课件290荧光光谱分析方法及原理课件291荧光光谱分析方法及原理课件292荧光光谱分析方法及原理课件293荧光光谱分析方法及原理课件294荧光光谱分析方法及原理课件295荧光光谱分析方法及原理课件296荧光光谱分析方法及原理课件297荧光光谱分析方法及原理课件298荧光光谱分析方法及原理课件299荧光光谱分析方法及原理课件300荧光光谱分析方法及原理课件301荧光光谱分析方法及原理课件302荧光光谱分析方法及原理课件303荧光光谱分析方法及原理课件304荧光光谱分析方法及原理课件305荧光光谱分析方法及原理课件306荧光光谱分析方法及原理课件307荧光光谱分析方法及原理课件308荧光光谱分析方法及原理课件309荧光光谱分析方法及原理课件310荧光光谱分析方法及原理课件311荧光光谱分析方法及原理课件312荧光光谱分析方法及原理课件313荧光光谱分析方法及原理课件314荧光光谱分析方法及原理课件315荧光光谱分析方法及原理课件316荧光光谱分析方法及原理课件317荧