9紫外-可见分光光度法课件

1第九章紫外-可见分光光度法◆学习目的⊙◆知识要求⊙◆能力要求⊙1第九章紫外-可见分光光度法◆学习目的⊙2◆学习目的通过学习光谱分析法概论、紫外-可见分光光度法的基本原理、分光光度计的基本构造、降低测量误差的方法、常用的定性、定量方法等知识，了解光学分析法的知识体系，熟悉紫外-可见分光光度法的实际应用，会用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度，并对有关物质进行定性定量分析，为学习红外分光光度法、荧光分光光度法、核磁共振波谱法及药物分析课中有关药品的定性鉴别、杂质检查和含量测定方法奠定基础。

2◆学习目的通过学习光谱分析法概论、紫外-可见分光光度法的基3◆知识要求1．掌握朗伯-比尔定律概念、表示及条件，吸光系数和吸收光谱的意义、表示，常用的定量分析方法原理和应用。2．熟悉紫外-可见吸收光谱的产生机制、分光光度计的基本结构、偏离朗伯-比尔定律的主要因素。3．了解光谱分析法的分类、测量条件的选择、定性分析的依据和方法。3◆知识要求1．掌握朗伯-比尔定律概念、表示及条件，吸光系数4◆能力要求1.能够用朗伯-比尔定律解决定量计算问题

。2.能够绘制吸收光谱曲线，找出被测物质的最大吸收波长。3.能够制备标准曲线，并能应用标准曲线对样品进行定量分析。4.会使用常见的紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度。

4◆能力要求1.能够用朗伯-比尔定律解决定量计算问题。5第一节光谱分析法概论

第一节光谱分析法概论

一、电磁辐射与电磁波谱

电磁辐射：电磁辐射，也叫电磁波，具有波粒二象性。

c＝λυ

E＝hυ电磁波谱：把电磁辐射按照波长大小顺序排列起来，就称为电磁波谱。紫外光区和可见光区仅是电磁波谱中的一小部分。

5第一节光谱分析法概论第一节光谱分析法概论6

表9-1电磁波谱分区表电磁辐射区段波长范围能级跃迁的类型射线10-3~0.1nm原子核能级X射线0.1~10nm内层电子能级远紫外辐射10~200nm内层电子能级紫外辐射200~400nm价电子或成键电子能级可见光区400~760nm价电子或成键电子能级近红外辐射0.76~2.5μm

涉及氢原子的振动能级中红外辐射2.5~50μm

原子或分子的振动能级远红外辐射50~500μm

分子的转动能级微波区0.3mm~1m分子的转动能级无线电波区1~1000m磁场诱导核自旋能级第一节光谱分析法概论

6表9-1电磁778第一节光谱分析法概论二、光谱分析法的分类（一）发射光谱法发射光谱法：物质的原子、分子或离子在一定条件下，由低能态（基态）跃迁至高能态（激发态），再由高能态跃迁至低能态，同时产生电磁辐射，根据这种光谱而建立的分析方法称为发射光谱法。发射光谱法分类：原子发射光谱法、原子荧光光谱法、分子荧光光谱法、X射线荧光谱法。8第一节光谱分析法概论二、光谱分析法的分类9第一节光谱分析法概论二、光谱分析法的分类（二）吸收光谱法吸收光谱法：利用物质对电磁辐射的选择性吸收而建立的分析方法称为吸收光谱法。吸收光谱法分类：原子吸收光谱法、紫外-可见分光光度法、红外分光光度法、磁共振波谱法。9第一节光谱分析法概论二、光谱分析法的分类10第一节光谱分析法概论三、紫外-可见分光光度的特点1.灵敏度高2.准确度高3.精密度好4.选择性好5.仪器设备简单，价格低廉，易于普及；操作简便，测定快速6.应用范围广泛10第一节光谱分析法概论三、紫外-可见分光光度的特点11第二节紫外-可见分光光度法第二节紫外-可见分光光度法一、紫外-可见吸收光谱的产生当分子（或离子）受到光照射时，能够吸收具有一定能量的光量子，由能量较低的基态能级E1跃迁到能量较高的激发态能级E2

，即物质对光具有选择性吸收。紫外-可见光的能量(h)与分子（或离子）发生电子能级跃迁前后的能量差（E2-E1）恰好相等，电磁辐射与被测物发生能量交换，产生紫外-可见吸收光谱。11第二节紫外-可见分光光度法第二节紫外-可见分光光度法12吸光光度法的基本原理

(一)物质的颜色及对光的选择性吸收

1、可见光

人们日常所看到的日光、白炽灯光只是电磁波中的一个很小的波段。人的眼睛能觉察到的那一小部分波段称为可见光，波长范围在400～760nm。在可见光谱区内不同波长的光有着不同的颜色。从波长较短的紫色光到波长较长的红色光。12吸光光度法的基本原理(一)物质的颜色及对光的选择性吸收13各种单色光的波长范围

（可见光波长范围：400~760纳米）

红光：中心波长：660纳米；波长范围：760~622纳米；

橙光：中心波长：610纳米；波长范围：622~597纳米；

黄光：中心波长：570纳米；波长范围：597~577纳米；

绿光：中心波长：550纳米；波长范围：577~492纳米；

青光：中心波长：460纳米；波长范围：492~450纳米；

蓝光：中心波长：440纳米；波长范围：450~435纳米；

紫光：中心波长：410纳米；波长范围：435~400纳米。

13各种单色光的波长范围

（可见光波长范围：400~760纳14吸光光度法的基本原理2、复合光由不同波长的光混合而成的光称为复合光。实验证明，日光、白炽灯光等可见光都是复合光。如果让一束白光通过棱镜，便可分解为红、橙、黄、绿、青、蓝、紫七种颜色的光，这种现象称为光的色散。3、单色光只具一种颜色的光即单一波长的光称为单色光。分光光度计则是依靠单色光器中的棱镜或光栅（色散元件）把复合光色散成所需要的单色光。14吸光光度法的基本原理2、复合光15吸光光度法的基本原理4、互补色光将两种适当颜色的单色光按一定强度比例混合可成为白光。这两种单色光称为互补色光。（二）溶液的颜色在漆黑的夜晚，我们看不到任何物质的颜色，只有在白天我们才能欣赏到多彩的世界。物质呈现何种颜色跟光源有关，也跟该物质的结构（本性）有关。物质的结构（本性）不同，物质对光的性质就会不同，物质的颜色也就不一样。图13-1光的互补色15吸光光度法的基本原理4、互补色光图13-1光的互补色16吸光光度法的基本原理1、有色溶液当光束照射到物体上时，如果物质对各种波长的光完全吸收，则呈现黑色；如果物质对各种波长的光均匀吸收，则呈现灰色；如果完全反射，则呈现白色；如果选择性地吸收某些波长的光。当一束白光通过某种溶液时，如果它选择性地吸收了白光中某种色光。那么溶液呈现的是它吸收光的补色光（透过光）的颜色。

例如硫酸铜溶液因吸收了白光中的黄色光而呈现蓝色，高锰酸钾溶液因吸收了白光中的绿色光而呈现紫色。16吸光光度法的基本原理1、有色溶液17吸光光度法的基本原理由此可见，有色溶液的颜色是被吸收光颜色的补色。吸收越多，则补色的颜色越深。比较溶液颜色的深度，实质上就是比较溶液对它所吸收光的吸收程度。2、无色溶液当光束照射到物体上时，如果物质对各种波长的光既不吸收也不反射，则呈现无色（透明）。当一束白光通过某种溶液时，如果它对白光中的任何颜色的光都没有吸收和反射，则溶液呈现无色（透明），为无色溶液。图13-1光的互补色17吸光光度法的基本原理由此可见，有色溶液的颜色是被吸收光颜181819第二节紫外-可见分光光度法二、透光率与吸光度

当一束单色光穿过均匀、透明介质时，一部分光被溶液吸收，还有的透过、反射。I0＝Ia+It+Ir

I0＝Ia+It

I0入射光强度Ia吸收光强度It透射光强度Ir反射光强度19第二节紫外-可见分光光度法二、透光率与吸光度20透光率T:透射光强度It与入射光强度I0的比值称为透光率或透光度。吸光度A:对透光率的倒数取对数，称为吸光度即：第二节紫外-可见分光光度法

20透光率T:透射光强度It与入射光强度I0的比值称为透光率21第二节紫外-可见分光光度法三、朗伯-比尔定律

当一束平行的单色光通过均匀、无散射的含有吸光性物质的溶液时，在入射光的波长、强度及溶液的温度等条件不变的情况下，该溶液的吸光度A与溶液的浓度c及液层厚度L的乘积成正比:

A＝K·L·c朗伯-比尔定律是定量分析的理论依据。21第二节紫外-可见分光光度法三、朗伯-比尔定律22朗伯-比尔定律不仅适用于可见光，而且也适用于紫外光和红外光；不仅适用于均匀、无散射的溶液，而且也适用于均匀、无散射的固体和气体。实验证明：溶液对光的吸光度具有加和性。如果溶液中同时存在两种或两种以上的吸光性物质，则测得的该溶液的吸光度等于溶液中各吸光性物质吸光度的总和，即： A（a+b+c）＝Aa＋Ab＋Ac

第二节紫外-可见分光光度法22朗伯-比尔定律不仅适用于可见光，而且也适用于紫外光和红外23第二节紫外-可见分光光度法四、吸光系数摩尔吸光系数：在入射光波长一定时，溶液浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时所测得的吸光度称为摩尔吸光系数，常用ε表示。吸收系数不可能直接用1mol/L浓度的吸光物质测量，一般是由较稀溶液的吸光系数换算得到。

23第二节紫外-可见分光光度法四、吸光系数24例1：已知含Fe3+为500µg/L溶液用KSCN显色，在波长480nm处用2cm吸收池测得A=0.197,计算摩尔吸光系数ε。解：

答：摩尔吸光系数ε为1.1×104L/mol•cm。24例1：已知含Fe3+为500µg/L溶液用KSCN显色，25第二节紫外-可见分光光度法四、吸光系数百分吸光系数：在入射光波长一定时，溶液浓度为1﹪（g/100ml）、液层厚度为1cm时所测得的吸光度称为百分吸光系数，常用表示。摩尔吸光系数和百分吸光系数的关系：

25第二节紫外-可见分光光度法四、吸光系数26第二节紫外-可见分光光度法五、吸收光谱曲线

概念：以波长λ为横坐标，吸光度A为纵坐标所描绘的曲线，称为吸收光谱曲线，简称吸收光谱。26第二节紫外-可见分光光度法五、吸收光谱曲线272728吸收光谱曲线的特征参数第二节紫外-可见分光光度法λsh28吸收光谱曲线的特征参数第二节紫外-可见分光光度法λsh29第二节紫外-可见分光光度法五、吸收光谱曲线

特点:

（1）在相同条件下，同一物质的不同浓度的溶液，其吸收光谱曲线相似，且λmax相同。这是定性分析的基础。（2）测定条件一定时，吸光性物质的浓度越大，其吸光度也越大。这是定量分析的基础。29第二节紫外-可见分光光度法五、吸收光谱曲线30在正常情况下，选用同一种物质的几种不同浓度的溶液所测得的吸收光谱曲线的图形是完全相似的，λmax值也是固定不变的。图9-3是四种不同浓度的KMnO4溶液的四条吸收曲线，这四条吸收曲线的形状完全相似，λmax值相同，这说明物质对不同波长的光吸收的程度是不一样的（选择性吸收），这个特性只与溶液中物质的结构有关，而与溶液的浓度无关。30在正常情况下，选用同一种物质的几种不同浓度的溶液所测得的31第二节紫外-可见分光光度法六、偏离朗伯-比尔定律的因素化学因素:(1)溶液的浓度(2)物质的化学变化(3)溶剂的影响光学因素:(1)非单色光

(2)杂散光

(3)非平行光

(4)反射现象

(5)散射现象31第二节紫外-可见分光光度法六、偏离朗伯-比尔定律的因素32第二节紫外-可见分光光度法32第二节紫外-可见分光光度法33第二节紫外-可见分光光度法七、紫外-可见分光光度计基本结构：

光源—单色器—吸收池—检测器—显示器基本类型:(1)可见分光光度计

(2)紫外-可见分光光度计

1）单波长分光光度计单光束分光光度计双光束分光光度计

2）双波长分光光度计

33第二节紫外-可见分光光度法七、紫外-可见分光光度计34紫外-可见分光光度计

34紫外-可见分光光度计35第二节紫外-可见分光光度法35第二节紫外-可见分光光度法36一、分光光度计的结构紫外-可见分光光度计的基本结构是由五个部分组成：即光源、单色器、吸收池、检测器和信号显示系统。光源单色器吸收池检测器显示器36一、分光光度计的结构光源单色器吸收池检测器显示器37（一）光源

对光源的基本要求是应在仪器操作所需的光谱区域(整个紫外光区或可见光谱区)内能够发射连续辐射、有足够的辐射强度和良好的稳定性，而且辐射能量随波长的变化应尽可能小,较长的使用寿命。

分光光度计中常用的光源有热辐射光源和气体放电光源两类。

37（一）光源对光源的基本要求是应在仪器38

热辐射光源用于可见光区，如钨丝灯和卤钨灯，可使用的范围在340~2500nm。这类光源的辐射能量与施加的外加电压有关，因此必须严格控制灯丝电压，仪器必须配有稳压装置。

气体放电光源用于紫外光区，如氢灯和氘灯。可使用的范围在185~375nm。氘灯的灯管内充有氢的同位素氘，它是紫外光区应用最广泛的一种光源，其光谱分布与氢灯类似，但光强度比相同功率的氢灯要大3~5倍。38热辐射光源用于可393940（二）单色器

单色器是能从光源辐射的复合光中分出单色光的光学装置，其主要功能：产生光谱纯度高的波长且波长在紫外可见区域内任意可调。

单色器的组成：①入射狭缝：光源的光由此进入单色器；②准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束；③色散元件：将复合光分解成单色光；④聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；⑤出射狭缝。40（二）单色器41

单色器的核心部分是色散元件，起分光的作用。单色器的性能直接影响入射光的单色性，从而也影响到测定的灵敏度、选择性及校准曲线的线性关系等。

能起分光作用的色散元件主要是棱镜和光栅。棱镜有玻璃和石英两种材料。它们的色散原理是依据不同的波长光通过棱镜时有不同的折射率而将不同波长的光分开。由于玻璃可吸收紫外光，所以玻璃棱镜只能用于350~3200nm的波长范围，即只能用于可见光域内。石英棱镜可使用的波长范围较宽，可从185~4000nm，即可用于紫外、可见和近红外三个光域。41424243

光栅是利用光的衍射与干涉作用制成的，它可用于紫外、可见及红外光域，而且在整个波长区具有良好的、几乎均匀一致的分辨能力。它具有色散波长范围宽、分辨本领高、成本低、便于保存和易于制备等优点。缺点是各级光谱会重叠而产生干扰。

入射、出射狭缝，透镜及准光镜等光学元件中狭缝在决定单色器性能上起重要作用。狭缝的大小直接影响单色光纯度，但过小的狭缝又会减弱光强。43光栅44（三）吸收池

吸收池又叫比色皿，用于盛放待测溶液和决定透光液层厚度的器件。一般有石英和玻璃材料两种。石英池适用于可见光区及紫外光区，玻璃吸收池只能用于可见光区。为减少光的损失，吸收池的光学面必须完全垂直于光束方向。

在高精度的分析测定中（紫外区尤其重要），吸收池要挑选配对。因为吸收池材料的本身吸光特征以及吸收池的光程长度的精度等对分析结果都有影响。44（三）吸收池

吸45（四）检测器

利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的检测器有光电池、光电管和光电倍增管等。

硒光电池对光的敏感范围为300~800nm，其中又以500~600nm最为灵敏。这种光电池的特点是能产生可直接推动微安表或检流计的光电流，但由于容易出现疲劳效应而只能用于低档的分光光度计中。45（四）检测器利用光电效应将透过吸收池的光信号46

光电管在紫外-可见分光光度计上应用较为广泛。

光电倍增管是检测微弱光最常用的光电元件，灵敏度比一般的光电管要高200倍，因此可使用较窄的单色器狭缝，从而对光谱的精细结构有较好的分辨能力。46光电管在紫外-可见分光光度计上应用较为广泛。47（五）信号指示系统（显示器）

作用是放大信号并以适当方式指示或记录下来。

常用的信号指示装置有直读检流计、电位调节指零装置以及数字显示或自动记录装置等。很多型号的分光光度计装配有微处理机，一方面可对分光光度计进行操作控制，另一方面可进行数据处理。47（五）信号指示系统（显示器）作用是放大48二、紫外-可见分光光度计的类型1、单光束分光光度计经单色器分光后的一束平行光，轮流通过参比溶液和样品溶液，以进行吸光度的测定。这种简易型分光光度计结构简单，价廉，操作方便，维修容易，适于在给定波长处测量吸光度或透光度。48二、紫外-可见分光光度计的类型1、单光束分光光度计491、单光束分光光度计

它的特点是结构简单，价格较便宜，主要适用于作定量分析。其缺点是测定结果受光源强度波动的影响较大，往往给定量分析带来较大的误差。常用的单光色束可见分光光度计有国产的72G型、721型、721B、722S型等。常用的单光束紫外-可见分光光度计有国产的751型、751G型、752型、752C型、756MC型，日本岛津的QV-50型等。491、单光束分光光度计

它的特点是结构简单，价格较便宜5050512、双光束分光光度计经单色器分光后经反射镜分解为强度相等的两束光，一束通过参比池，一束通过样品池。光度计能自动比较两束光的强度，此比值即为试样的透射比，经对数变换将它转换成吸光度并作为波长的函数记录下来。

可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的引起的误差，特别适合于结构分析。仪器复杂，自动记录，快速全波段扫描。512、双光束分光光度计52它的两束光几乎同时通过参比溶液和样品溶液，因此可以消除光源强度的变化以及检测系统波动的影响，测量准确度高。双光束型仪器一般都采用自动记录仪直接扫描出组分的吸收光谱，操作方便，但仪器结构复杂，价格昂贵。常用的双光束紫外-可见分光光度计有国产的710型、730型、760MC型、760CRT型，日本岛津的UV-210型等。52它的两束光几乎同时通过参比溶液和样品溶液，因此可以消除光53双光束紫外-可见分光光度计53双光束紫外-可见分光光度计543、双波长分光光度计由同一光源发出的光被分成两束，分别经过两个单色器，得到两束不同波长（1和2）的单色光，利用切光器使两束光以一定的频率交替照射同一吸收池，然后经过光电倍增管和电子控制系统，最后由显示器显示出两个波长处的吸光度差值ΔA（ΔA=A1-A2）。

对于多组分混合物、混浊试样（如生物组织液）分析，以及存在背景干扰或共存组分吸收干扰的情况下，利用双波长分光光度法，往往能提高方法的灵敏度和选择性。543、双波长分光光度计55它的特点是不需要参比溶液，只用一个待测溶液，因此完全消除了背景吸收的干扰(包括样品溶液与参比溶液组成的不同及吸收池厚度差异的影响)，提高了测定的准确度。但仪器价格昂贵。常用的双波长紫外-可见分光光度计有国产的WFZ800S型，日本岛津的UV-300型、UV-365型等。55它的特点是不需要参比溶液，只用一个待测溶液，因此完全消除56双波长分光光度计56双波长分光光度计57二、紫外-可见分光光度计的类型57二、紫外-可见分光光度计的类型58复习提问：1.物质的颜色和光的选择性吸收之间有什么关系？2.分光光度法的基本原理是什么定律？适用范围如何？3.分光光度计的主要部件有哪些？58复习提问：1.物质的颜色和光的选择性吸收之间有什么关系？59第二节紫外-可见分光光度法59第二节紫外-可见分光光度法60复习提问：1.物质的颜色和光的选择性吸收之间有什么关系？图9-2光的互补色60复习提问：1.物质的颜色和光的选择性吸收之间有什么关系？61复习提问：2.分光光度法的基本原理是什么定律？适用范围如何？A＝εc

L61复习提问：A＝εcL623.分光光度计的主要部件有哪些？紫外-可见分光光度计的基本结构是由五个部分组成：即光源、单色器、吸收池、检测器和显示器。光源单色器吸收池检测器显示器复习提问：623.分光光度计的主要部件有哪些？光源单色器吸收池检测器显63第二节紫外-可见分光光度法八、测量误差与分析条件的选择（一）测量误差（二）仪器测量条件的选择（三）显色反应条件的选择(四)参比溶液的选择

63第二节紫外-可见分光光度法八、测量误差与分析条件的选择64第二节紫外-可见分光光度法八、测量误差与分析条件的选择（一）测量误差:(1)仪器误差

光源不稳定；吸收池厚度不均匀；光电源灵敏性差；光电流测量不准；读数标尺刻度不够准确。(2)操作误差

仪器使用不够熟练；处理标液和试液条件不完全相同，如溶液的稀释、显色剂的用量、反应的酸度、温度，放置时间的差异等。

操作马虎，吸收池没有清洗、吸收池光学面不干净、吸收池没有用待测定溶液荡洗等属于过失。64第二节紫外-可见分光光度法八、测量误差与分析条件的选择65（二）仪器测量条件的选择：(1)选择最大吸收波长作为入射光。在实验分析时，为了获得较高的灵敏度和准确度，一般是选择溶液的最大吸收波长max为测量波长，因为在此波长处摩尔吸光系数ε最大，测量的灵敏度最高。

65（二）仪器测量条件的选择：66高锰酸钾溶液吸收光谱曲线66高锰酸钾溶液吸收光谱曲线67（二）仪器测量条件的选择：(1)选择最大吸收波长作为入射光。一般选最大吸收波长，因为此时的灵敏度最高。如果有干扰物质在此波长也有较大的吸收，则可选择灵敏度稍低，则能避免共存组分的干扰。

67（二）仪器测量条件的选择：68例如显色剂和钴配合物在420nm处都有最大吸收峰，见图。如果在此波长下测定钴，则未反应的显色剂就会干扰测定结果。因此，必须选择显色剂没有吸收的500nm波长作入射光来测定，这样灵敏度虽有所下降，却消除了干扰，提高了测定的准确度和选择性。图吸收曲线A钴配合物B显色剂68例如显色剂和钴配合物在420nm处都有最大吸收峰，见图。69总结：入射光的波长应根据被测液光谱吸收曲线选择。以“最大吸收，最小干扰”为原则。即无干扰，选λmax作为入射光波长；有干扰，选灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长。69总结：70（二）仪器测量条件的选择：(2)读数范围的选择吸光度读数范围应控制在吸光度为0.2~0.7、透光率为20%~65%之间。根据理论推导及测试经验，将配制的标准溶液和待测溶液吸光度读数控制在0.2～0.7范围内，能够使测量的相对误差最小。A＝εc

L70（二）仪器测量条件的选择：A＝εcL71控制读数范围的方法：①计算并控制试样的称取量，含量低时，多取样或萃取富集；含量高时，少取样或稀释试样。②如果溶液已显色，则可通过改变比色皿的厚度来调节吸光度值的大小。A＝εc

L71控制读数范围的方法：A＝εcL72第二节紫外-可见分光光度法八、测量误差与分析条件的选择（三）显色反应条件的选择：M+R⇌MR(被测组分)(显色剂)(有色化合物)1.对显色剂及显色反应的要求

显色剂是指能与待测组分形成有色化合物的试剂称为显色剂。它分为无机显色剂和有机显色剂。在分析中有机显色剂用得较普遍，而无机显色剂由于其灵敏度和选择性都不太高，用得比较少。

72第二节紫外-可见分光光度法八、测量误差与分析条件的选择73第二节紫外-可见分光光度法八、测量误差与分析条件的选择（三）显色反应条件的选择：

1.对显色剂及显色反应的要求

将被测组分转变为有色化合物的反应叫显色反应。显色反应主要是配位反应，其次是氧化还原反应。（1）选择性好。（2）灵敏度高。（3）有色化合物的组成恒定、性质稳定。（4）显色剂与生成的有色化合物之间的颜色要有较大差别。（5）显色反应的条件应易于控制。73第二节紫外-可见分光光度法八、测量误差与分析条件的选择74第二节紫外-可见分光光度法八、测量误差与分析条件的选择（三）显色反应条件的选择：2.控制合适的显色反应条件

(1)显色剂用量显色剂用量的确定：常在显色反应中，固定其他条件，只改变显色剂的用量，测定相应的A值，以显色剂c(mol/L)为横坐标，A为纵坐标绘制曲线，确定显色剂的用量。74第二节紫外-可见分光光度法八、测量误差与分析条件的选择75

图吸光度与显色剂浓度的关系曲线75762.控制合适的显色反应条件

(2)溶液的酸度许多有色物质的颜色随着溶液的酸度而改变，同时显色反应的历程也大多对溶液的酸度有一定的要求。因此，可采用缓冲溶液控制溶液的酸度。显色反应的适宜酸度可通过实验绘制A－pH曲线来确定。762.控制合适的显色反应条件

(2)溶液的酸度772.控制合适的显色反应条件

(3)显色时间显色反应的速度不同，有的瞬间即可完成，且颜色能保持较长时间稳定不变；有的只能维持短暂的稳定时间，放置稍久就会分解褪色。因此，要严格控制显色过程和测定前放置的时间，至于每个显色反应所需的时间和颜色能稳定的地保持多久，须通过实验来确定。772.控制合适的显色反应条件

782.控制合适的显色反应条件

(4)温度大多数显色反应在常温下进行，有些显色反应必须加热才能完成。升高温度可加快反应速度，但也可能产生副反应，所以，应根据具体的反应选择适当的温度。(5)干扰离子的消除如果在样品中含有性质相似的其它组分，它们或是本身具有颜色，或是与显色剂反应生成有色物质干扰测定，那就必须设法将这些离子分离或掩蔽。

选择合适的参比溶液可以消除某些干扰。782.控制合适的显色反应条件

(4)温度79

在分光光度法测定中，选用适当的参比溶液，可以消除由于吸收池壁及溶剂、试剂对入射光的反射和吸收带来的误差，并可扣除干扰的影响，提高分析的准确度。八、测量误差与分析条件的选择(四)参比溶液的选择：79在分光光度法测定中，选用适80第二节紫外-可见分光光度法八、测量误差与分析条件的选择(四)参比溶液的选择：

参比溶液的作用：一是调节仪器读数标尺满标度，即校正仪器读数装置A=0或T=100%，以作为测量的相对标准；二是用来抵消测定过程中某些因素的干扰，以减小测量误差。

80第二节紫外-可见分光光度法八、测量误差与分析条件的选择81第二节紫外-可见分光光度法八、测量误差与分析条件的选择(四)参比溶液的选择：常用的参比溶液有溶剂参比、试剂参比和样品参比三种。溶剂参比：是以纯溶剂如蒸馏水作为参比，可消除溶剂干扰；

当加入的试剂及显色剂均无色，只有待测物显色时，用纯溶剂做参比溶液。如一般常用的溶剂蒸馏水。81第二节紫外-可见分光光度法八、测量误差与分析条件的选择82第二节紫外-可见分光光度法八、测量误差与分析条件的选择(四)参比溶液的选择：常用的参比溶液有溶剂参比、试剂参比和样品参比三种。试剂参比：不加待测组分，加入同样的试剂和溶剂作为参比溶液，是最常用的一种参比溶液，可消除试剂干扰。

当试剂和显色剂在测定波长处有吸收时，选用试剂参比。即用蒸馏水代替样品，其它所加试剂及操作与样品完全相同，此溶液就是试剂参比，常称“试剂空白”。

多数情况下都是采用此种溶液做参比。82第二节紫外-可见分光光度法八、测量误差与分析条件的选择83第二节紫外-可见分光光度法八、测量误差与分析条件的选择(四)参比溶液的选择：常用的参比溶液有溶剂参比、试剂参比和样品参比三种。样品参比：是以不加显色剂的试样溶液作为参比溶液，可消除样品干扰。

当样品溶液有颜色，而试剂、显色剂无色时，应采用不加显色剂的样品溶液做参比，称为“样品空白”。83第二节紫外-可见分光光度法八、测量误差与分析条件的选择84九、定性与定量分析方法

紫外-可见分光光度法主要用于物质的定性分析、结构分析和定量分析。主要介绍该方法在有机物定性和定量分析上的应用。

根据不同有机物的吸收光谱不相同，比较吸收光谱的特征可以对纯物质进行鉴定；利用吸光度与浓度的正比关系，可进行一些药物与制剂的定量分析。84九、定性与定量分析方法

紫外-可见分光光度法主要用于物85第二节紫外-可见分光光度法九、定性与定量分析方法（一）定性分析定性分析依据:最大吸收波长、吸光系数和吸收光谱曲线的形状。

定性分析方法:(1)比较光谱的一致性(2)比较吸收光谱的特征数据及比值的一致性

85第二节紫外-可见分光光度法九、定性与定量分析方法86（一）定性分析

1.光谱一致性比较在相同条件下，测定未知物和已知标准物的吸收光谱，并对图谱进行严格的对比。如果没有标准化合物，可将未知物的吸收光谱与《中国药典》中收录的该药物的标准图谱进行对照比较。

图谱的一致性，表现在吸收曲线的形状、吸收峰的数目、吸收峰的位置、吸收峰的强度等。86（一）定性分析

1.光谱一致性比较87中国药典(2010年版)规定：贝诺酯加无水乙醇制成每1ml约含7.5的溶液，在240nm处有最大吸收，相应的百分吸光系数()应为730～760。贝诺酯是一种新型抗炎、解热、镇痛药。主要用于类风湿性关节炎、急慢性风湿性关节炎、风湿痛、感冒发烧、头痛、神经痛及术后疼痛等。实例分析87中国药典(2010年版)规定：贝诺酯加无水乙醇制成每1m88（一）定性分析

1.光谱一致性比较如果两者的吸收光谱有明显差别，则可肯定不是同一种化合物。高锰酸钾吸收曲线硫氰酸铁吸收曲线88（一）定性分析

1.光谱一致性比较高锰酸钾吸收曲线硫氰酸89可的松的紫外光谱图氢化可的松的的紫外光谱图8990

如果二者吸收光谱完全相同，则待测物质与标准物则可能是同一种化合物，但还需用其它分析方法进一步证实。

这是由于紫外-可见分光光度法表现的是主要官能团的特性，因此某些官能团相同的物质，可能会产生非常相似的、甚至相同的吸收光谱。1.光谱一致性比较90如果二者吸收光谱完全相同，则待91（一）定性分析

2.吸收光谱特征数据比较用于吸收光谱特征数据比较的有λmax、εmax。其中鉴别最常用的光谱特征数据是最大吸收峰所在的波长λmax，如果一个化合物有几个吸收蜂，并存在谷和肩峰，这些特征数据应同时作为鉴定的依据，这样更能显示光谱特征的全面性。91（一）定性分析

2.吸收光谱特征数据比较92（一）定性分析

2.吸收光谱特征数据比较如紫罗兰酮是重要的香料。它有α-和β-两种异构体，其中α-型异构体的香气要比β-型好，常用于化妆品中，而后者一般只用作皂用香精。用紫外光谱比其他波谱方法更容易区别它们，因为α-型是两个双键共轭的α,β-不饱和酮，其λmax为228nm，而β-型异构体是三个双键共轭的α,β-不饱和酮，其λmax为298nm。92（一）定性分析

2.吸收光谱特征数据比较93（一）定性分析

3.吸光度（或吸光系数）比值的比较如果化合物同时有几个吸收蜂，可用在不同吸收峰(或峰与谷)处测得的吸光度的比值作为鉴别的依据，因为用的是同一浓度溶液和同一厚度的吸收池，其吸光度比值也就是吸光系数的比值，且可消除浓度和厚度不准确所带来的影响。

如维生素B12有三个吸收峰，分别在278nm、361nm、550nm波长处，它们的吸光度比值应为：A361nm/A278nm在1.70～1.88之间，A361nm/A550nm在3.15～3.45之间。93（一）定性分析

3.吸光度（或吸光系数）比值的比较94实例分析(中国药典2010年版)维生素B12滴眼液WeishengsuB12DiyanyeVitaminB12EyeDrops本品含维生素B12(C63H88CoN14O14P)应为标示量的90.0%～110.0%。【性状】本品为粉红色的澄明液体。【鉴别】取本品为供试品

，照紫外-可见分光光度法(附录ⅣΑ)测定，在361nm与550nm的波长处有最大吸收；361nm波长处与550nm波长处的吸收度的比值应为3.15～3.45。第二节紫外-可见分光光度法94实例分析(中国药典2010年版)第二节紫外-可95维生素B12滴眼液【检查】pH值应为5.5～6.5(附录ⅥΗ)。渗透压应为270～330mOsM（附录IXG）。其他应符合眼用制剂项下有关的各项规定(附录ⅠG)。【含量测定】避光操作。精密量取本品适量，加水定量稀释制成每1ml中约含维生素B1225μg的溶液，照紫外-可见分光光度法(附录ⅣΑ)，在361nm的波长处测定吸光度，按C63H88CoN14O14P的吸收系数()为207计算，即得。【类别】同维生素B12【规格】10ml：2mg【贮藏】遮光，密封保存。95维生素B12滴眼液【检查】pH值应为5.5～6.96（二）纯度检查将药品光谱与药品标准光谱相对照，利用杂质的特征吸收，可以检测出微量杂质。在药品无吸收的紫外－可见光区杂质有吸收在杂质吸收峰处药品无吸收96（二）纯度检查将药品光谱与药品标准光谱相对照，97三聚氰胺的紫外光谱图97三聚氰胺的紫外光谱图98第二节紫外-可见分光光度法（三）定量分析定量分析依据:A＝εc

L

A＝K

·c

定量分析方法：

1.单组分溶液的定量方法(1)标准曲线法

(2)标准溶液对比法

(3)吸光系数法

98第二节紫外-可见分光光度法（三）定量分析99第二节紫外-可见分光光度法1标准曲线法:标准曲线法是紫外-可见分光光度法中最经典的定量方法。具体测定的方法和步骤如下：①配制一系列不同浓度的标准溶液，选择合适的参比溶液，在相同条件下，以待测组分的最大吸收波长作为入射光，分别测定各标准溶液对应的吸光度。②以浓度c为横坐标、吸光度A为纵坐标描绘曲线，称为标准曲线，也叫工作曲线。③按照相同的实验条件和操作程序，用待测溶液配制未知试样溶液并测定其吸光度A样，在标准曲线上找到与之对应的未知试样溶液的浓度c样。

99第二节紫外-可见分光光度法1标准曲线法:100第二节紫外-可见分光光度法100第二节紫外-可见分光光度法101第二节紫外-可见分光光度法2标准对比法:在相同的条件下（使用同一波长的入射光，采用同样的比色皿，测定同样的物质）。配制浓度为cs的标准溶液和浓度为cx的试样溶液，在最大吸收波长处，分别测定二者的吸光度值为As、Ax

，依据朗伯-比尔定律得：As=εcsLAx=εcxL

则:101第二节紫外-可见分光光度法2标准对比法:102第二节紫外-可见分光光度法3吸光系数法:吸光系数法又称绝对法，是直接利用朗伯-比尔定律的数学表达式A＝KcL进行计算的定量分析方法。在手册中查出待测物质在最大吸收波长处的吸光系数或,并在相同条件下测量样品溶液的吸光度A，则其浓度为：

或102第二节紫外-可见分光光度法3吸光系数法:103第二节紫外-可见分光光度法有时也可以将待测样品溶液的吸光度换算成样品组分的吸光系数，计算与标准品的吸光系数的比值，求出样品中待测组分的质量分数。或103第二节紫外-可见分光光度法有时也可以将待测样品溶液的104第二节紫外-可见分光光度法例如：维生素B12水溶液在=361nm处的百分吸光系数=207。取维生素B12样品30.0mg，加纯化水溶解，用1L的容量瓶定容。将溶液盛于1cm的吸收池，测得361nm波长处的吸光度A=0.600，试求样品中维生素B12的质量分数。解：104第二节紫外-可见分光光度法例如：维生素B12水溶液在105多组分的测定如果在一个待测溶液中需要同时测定两个或两个以上组分的含量，就是多组分测定。吸光度的加和性是多组分同时测定的依据，可根据各组分吸收光谱相互重叠的程度分别考虑测定的方法。105多组分的测定106第二节紫外-可见分光光度法（三）定量分析定量分析依据:A＝εc

L

A＝K

·c

定量分析方法：2.双组分溶液的定量方法

(1)解联立方程组法

(2)等吸收波长消去法

(3)差示分光光度法

106第二节紫外-可见分光光度法（三）定量分析107第二节紫外-可见分光光度法

二元组分溶液的定量方法

1解联立方程组法当试样溶液中各待测组分相互干扰不太严重时，可根据吸光度具有加和性的特点，在同一试样溶液中同时测定两个或两个以上的待测组分。

假设要测定试样中有两个待测组分a和b，如果分别绘制a、b两个纯物质的吸收光谱，则有三种情况。107第二节紫外-可见分光光度法二元组分溶液的定量方法108第二节紫外-可见分光光度法108第二节紫外-可见分光光度法109第二节紫外-可见分光光度法（Ⅰ）表明，两个待测组分在各自的最大吸收波长处，另一组分没有吸收，可以用测定单组分的方法，分别在λ1波长处测定组分a的吸收度,在λ2波长处测定组分b的吸收度，再由偏离朗伯-比尔定律求得ca、cb。测定时互不干扰。

109第二节紫外-可见分光光度法（Ⅰ）表明，两个待测组分在110第二节紫外-可见分光光度法（Ⅱ）表明，在待测组分a的最大吸收波长λ1处，待测组分b无吸收，即组分b对组分a的测定无干扰，而在待测组分b的最大吸收波长λ2处，组分a有吸收，即组分a对组分b的测定有干扰。这时，可以在波长λ1处用测定单组分的方法，单独测量组分a；然后在波长λ2处测量溶液的总吸光度及a、b纯物质的吸收系数，根据吸光度的加和性，从而可以求出cb。

110第二节紫外-可见分光光度法（Ⅱ）表明，在待测组分a的111第二节紫外-可见分光光度法（Ⅲ）表明，两个待测组分彼此相互干扰，此时，在波长λ1和λ2处分别测定试样溶液的总吸光度及，同时测定a、b纯物质的吸光系数、和、，根据吸光度的加和性，则由联立方程组求得ca、cb。

111第二节紫外-可见分光光度法（Ⅲ）表明，两个待测组分彼112第二节紫外-可见分光光度法2等吸收波长消去法（双波长分光光度法）当试样中两个待测组分的相互干扰比较严重时，用解联立方程组的方法进行定量分析会产生较大的误差，这时可以用等吸收波长消去法进行测定。在试样中含有两个待测组分a和b时，若要测定组分b，组分a有干扰，应设法消除组分a的吸收干扰。首先选择待测组分b的最大吸收波长λ2作为测量波长，然后用作图的方法选择参比波长λ1，使组分a在这两个波长处的吸光度相等。112第二节紫外-可见分光光度法2等吸收波长消去法（双113第二节紫外-可见分光光度法试样溶液在λ2和λ1两个波长处的吸光度之差，只与待测组分b（a）的浓度成正比，而与干扰组分的浓度无关。

113第二节紫外-可见分光光度法试样溶液在λ2和λ1两个波114选择1和2，符合以下条件：①干扰组分在两波长处的吸光度要相等。②被测组分在两波长处的吸光度要足够大。根据吸光度的加和原则，混合物在1和2处的吸光度分别为：

Aλ1=AAλ1+ABλ1Aλ2=AAλ2+ABλ2

ΔA=Aλ2-Aλ1=ABλ2-ABλ1=（εBλ2-εBλ1）cBL114选择1和2，符合以下条件：1153差示分光光度法当待测组分含量过高时，吸光度超出了准确测量的读数范围，会造成较大的误差，可以采用差示分光光度法，弥补这一缺点。差示光度法是用一个比试样溶液浓度稍低的标准溶液作为参比溶液，将分光光度计调零（透光率100%），测得的吸光度就是被测试样溶液试液与参比溶液的吸光度差值（相对吸光度）。根据朗伯-比尔定律得：△A＝Ax－As＝ΕL(cx－cs)

待测溶液与参比溶液的吸光度差值与两溶液的浓度之差成正比，这就是差示分光光度法的基本原理。第二节紫外-可见分光光度法1153差示分光光度法第二节紫外-可见分光光度法116

浓度示差分光光度法是采用比待测溶液浓度稍低的标准溶液做参比溶液（cx＞cs），调整仪器的吸光度为“0”然后测量待测溶液的吸光度。根据朗伯-比尔定律得：As=εcsLAx=εcxL则：△Ax=Ax—As=ε(cx—cs)L=ε△cxL用△A对相应的浓度差△c作标准曲线，根据测得的待测液的△Ax

，在图中查出△cx值，则cx=cs+△cx。116浓度示差分光光度法是采用比待测溶液117布置作业：P166:2;3117布置作业：P166:2;3118第九章紫外-可见分光光度法◆学习目的⊙◆知识要求⊙◆能力要求⊙1第九章紫外-可见分光光度法◆学习目的⊙119◆学习目的通过学习光谱分析法概论、紫外-可见分光光度法的基本原理、分光光度计的基本构造、降低测量误差的方法、常用的定性、定量方法等知识，了解光学分析法的知识体系，熟悉紫外-可见分光光度法的实际应用，会用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度，并对有关物质进行定性定量分析，为学习红外分光光度法、荧光分光光度法、核磁共振波谱法及药物分析课中有关药品的定性鉴别、杂质检查和含量测定方法奠定基础。

2◆学习目的通过学习光谱分析法概论、紫外-可见分光光度法的基120◆知识要求1．掌握朗伯-比尔定律概念、表示及条件，吸光系数和吸收光谱的意义、表示，常用的定量分析方法原理和应用。2．熟悉紫外-可见吸收光谱的产生机制、分光光度计的基本结构、偏离朗伯-比尔定律的主要因素。3．了解光谱分析法的分类、测量条件的选择、定性分析的依据和方法。3◆知识要求1．掌握朗伯-比尔定律概念、表示及条件，吸光系数121◆能力要求1.能够用朗伯-比尔定律解决定量计算问题

。2.能够绘制吸收光谱曲线，找出被测物质的最大吸收波长。3.能够制备标准曲线，并能应用标准曲线对样品进行定量分析。4.会使用常见的紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度。

4◆能力要求1.能够用朗伯-比尔定律解决定量计算问题。122第一节光谱分析法概论

第一节光谱分析法概论

一、电磁辐射与电磁波谱

电磁辐射：电磁辐射，也叫电磁波，具有波粒二象性。

c＝λυ

E＝hυ电磁波谱：把电磁辐射按照波长大小顺序排列起来，就称为电磁波谱。紫外光区和可见光区仅是电磁波谱中的一小部分。

5第一节光谱分析法概论第一节光谱分析法概论123

表9-1电磁波谱分区表电磁辐射区段波长范围能级跃迁的类型射线10-3~0.1nm原子核能级X射线0.1~10nm内层电子能级远紫外辐射10~200nm内层电子能级紫外辐射200~400nm价电子或成键电子能级可见光区400~760nm价电子或成键电子能级近红外辐射0.76~2.5μm

涉及氢原子的振动能级中红外辐射2.5~50μm

原子或分子的振动能级远红外辐射50~500μm

分子的转动能级微波区0.3mm~1m分子的转动能级无线电波区1~1000m磁场诱导核自旋能级第一节光谱分析法概论

6表9-1电磁1247125第一节光谱分析法概论二、光谱分析法的分类（一）发射光谱法发射光谱法：物质的原子、分子或离子在一定条件下，由低能态（基态）跃迁至高能态（激发态），再由高能态跃迁至低能态，同时产生电磁辐射，根据这种光谱而建立的分析方法称为发射光谱法。发射光谱法分类：原子发射光谱法、原子荧光光谱法、分子荧光光谱法、X射线荧光谱法。8第一节光谱分析法概论二、光谱分析法的分类126第一节光谱分析法概论二、光谱分析法的分类（二）吸收光谱法吸收光谱法：利用物质对电磁辐射的选择性吸收而建立的分析方法称为吸收光谱法。吸收光谱法分类：原子吸收光谱法、紫外-可见分光光度法、红外分光光度法、磁共振波谱法。9第一节光谱分析法概论二、光谱分析法的分类127第一节光谱分析法概论三、紫外-可见分光光度的特点1.灵敏度高2.准确度高3.精密度好4.选择性好5.仪器设备简单，价格低廉，易于普及；操作简便，测定快速6.应用范围广泛10第一节光谱分析法概论三、紫外-可见分光光度的特点128第二节紫外-可见分光光度法第二节紫外-可见分光光度法一、紫外-可见吸收光谱的产生当分子（或离子）受到光照射时，能够吸收具有一定能量的光量子，由能量较低的基态能级E1跃迁到能量较高的激发态能级E2

，即物质对光具有选择性吸收。紫外-可见光的能量(h)与分子（或离子）发生电子能级跃迁前后的能量差（E2-E1）恰好相等，电磁辐射与被测物发生能量交换，产生紫外-可见吸收光谱。11第二节紫外-可见分光光度法第二节紫外-可见分光光度法129吸光光度法的基本原理

(一)物质的颜色及对光的选择性吸收

1、可见光

人们日常所看到的日光、白炽灯光只是电磁波中的一个很小的波段。人的眼睛能觉察到的那一小部分波段称为可见光，波长范围在400～760nm。在可见光谱区内不同波长的光有着不同的颜色。从波长较短的紫色光到波长较长的红色光。12吸光光度法的基本原理(一)物质的颜色及对光的选择性吸收130各种单色光的波长范围

（可见光波长范围：400~760纳米）

红光：中心波长：660纳米；波长范围：760~622纳米；

橙光：中心波长：610纳米；波长范围：622~597纳米；

黄光：中心波长：570纳米；波长范围：597~577纳米；

绿光：中心波长：550纳米；波长范围：577~492纳米；

青光：中心波长：460纳米；波长范围：492~450纳米；

蓝光：中心波长：440纳米；波长范围：450~435纳米；

紫光：中心波长：410纳米；波长范围：435~400纳米。

13各种单色光的波长范围

（可见光波长范围：400~760纳131吸光光度法的基本原理2、复合光由不同波长的光混合而成的光称为复合光。实验证明，日光、白炽灯光等可见光都是复合光。如果让一束白光通过棱镜，便可分解为红、橙、黄、绿、青、蓝、紫七种颜色的光，这种现象称为光的色散。3、单色光只具一种颜色的光即单一波长的光称为单色光。分光光度计则是依靠单色光器中的棱镜或光栅（色散元件）把复合光色散成所需要的单色光。14吸光光度法的基本原理2、复合光132吸光光度法的基本原理4、互补色光将两种适当颜色的单色光按一定强度比例混合可成为白光。这两种单色光称为互补色光。（二）溶液的颜色在漆黑的夜晚，我们看不到任何物质的颜色，只有在白天我们才能欣赏到多彩的世界。物质呈现何种颜色跟光源有关，也跟该物质的结构（本性）有关。物质的结构（本性）不同，物质对光的性质就会不同，物质的颜色也就不一样。图13-1光的互补色15吸光光度法的基本原理4、互补色光图13-1光的互补色133吸光光度法的基本原理1、有色溶液当光束照射到物体上时，如果物质对各种波长的光完全吸收，则呈现黑色；如果物质对各种波长的光均匀吸收，则呈现灰色；如果完全反射，则呈现白色；如果选择性地吸收某些波长的光。当一束白光通过某种溶液时，如果它选择性地吸收了白光中某种色光。那么溶液呈现的是它吸收光的补色光（透过光）的颜色。

例如硫酸铜溶液因吸收了白光中的黄色光而呈现蓝色，高锰酸钾溶液因吸收了白光中的绿色光而呈现紫色。16吸光光度法的基本原理1、有色溶液134吸光光度法的基本原理由此可见，有色溶液的颜色是被吸收光颜色的补色。吸收越多，则补色的颜色越深。比较溶液颜色的深度，实质上就是比较溶液对它所吸收光的吸收程度。2、无色溶液当光束照射到物体上时，如果物质对各种波长的光既不吸收也不反射，则呈现无色（透明）。当一束白光通过某种溶液时，如果它对白光中的任何颜色的光都没有吸收和反射，则溶液呈现无色（透明），为无色溶液。图13-1光的互补色17吸光光度法的基本原理由此可见，有色溶液的颜色是被吸收光颜13518136第二节紫外-可见分光光度法二、透光率与吸光度

当一束单色光穿过均匀、透明介质时，一部分光被溶液吸收，还有的透过、反射。I0＝Ia+It+Ir

I0＝Ia+It

I0入射光强度Ia吸收光强度It透射光强度Ir反射光强度19第二节紫外-可见分光光度法二、透光率与吸光度137透光率T:透射光强度It与入射光强度I0的比值称为透光率或透光度。吸光度A:对透光率的倒数取对数，称为吸光度即：第二节紫外-可见分光光度法

20透光率T:透射光强度It与入射光强度I0的比值称为透光率138第二节紫外-可见分光光度法三、朗伯-比尔定律

当一束平行的单色光通过均匀、无散射的含有吸光性物质的溶液时，在入射光的波长、强度及溶液的温度等条件不变的情况下，该溶液的吸光度A与溶液的浓度c及液层厚度L的乘积成正比:

A＝K·L·c朗伯-比尔定律是定量分析的理论依据。21第二节紫外-可见分光光度法三、朗伯-比尔定律139朗伯-比尔定律不仅适用于可见光，而且也适用于紫外光和红外光；不仅适用于均匀、无散射的溶液，而且也适用于均匀、无散射的固体和气体。实验证明：溶液对光的吸光度具有加和性。如果溶液中同时存在两种或两种以上的吸光性物质，则测得的该溶液的吸光度等于溶液中各吸光性物质吸光度的总和，即： A（a+b+c）＝Aa＋Ab＋Ac

第二节紫外-可见分光光度法22朗伯-比尔定律不仅适用于可见光，而且也适用于紫外光和红外140第二节紫外-可见分光光度法四、吸光系数摩尔吸光系数：在入射光波长一定时，溶液浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时所测得的吸光度称为摩尔吸光系数，常用ε表示。吸收系数不可能直接用1mol/L浓度的吸光物质测量，一般是由较稀溶液的吸光系数换算得到。

23第二节紫外-可见分光光度法四、吸光系数141例1：已知含Fe3+为500µg/L溶液用KSCN显色，在波长480nm处用2cm吸收池测得A=0.197,计算摩尔吸光系数ε。解：

答：摩尔吸光系数ε为1.1×104L/mol•cm。24例1：已知含Fe3+为500µg/L溶液用KSCN显色，142第二节紫外-可见分光光度法四、吸光系数百分吸光系数：在入射光波长一定时，溶液浓度为1﹪（g/100ml）、液层厚度为1cm时所测得的吸光度称为百分吸光系数，常用表示。摩尔吸光系数和百分吸光系数的关系：

25第二节紫外-可见分光光度法四、吸光系数143第二节紫外-可见分光光度法五、吸收光谱曲线

概念：以波长λ为横坐标，吸光度A为纵坐标所描绘的曲线，称为吸收光谱曲线，简称吸收光谱。26第二节紫外-可见分光光度法五、吸收光谱曲线14427145吸收光谱曲线的特征参数第二节紫外-可见分光光度法λsh28吸收光谱曲线的特征参数第二节紫外-可见分光光度法λsh146第二节紫外-可见分光光度法五、吸收光谱曲线

特点:

（1）在相同条件下，同一物质的不同浓度的溶液，其吸收光谱曲线相似，且λmax相同。这是定性分析的基础。（2）测定条件一定时，吸光性物质的浓度越大，其吸光度也越大。这是定量分析的基础。29第二节紫外-可见分光光度法五、吸收光谱曲线147在正常情况下，选用同一种物质的几种不同浓度的溶液所测得的吸收光谱曲线的图形是完全相似的，λmax值也是固定不变的。图9-3是四种不同浓度的KMnO4溶液的四条吸收曲线，这四条吸收曲线的形状完全相似，λmax值相同，这说明物质对不同波长的光吸收的程度是不一样的（选择性吸收），这个特性只与溶液中物质的结构有关，而与溶液的浓度无关。30在正常情况下，选用同一种物质的几种不同浓度的溶液所测得的148第二节紫外-可见分光光度法六、偏离朗伯-比尔定律的因素化学因素:(1)溶液的浓度(2)物质的化学变化(3)溶剂的影响光学因素:(1)非单色光

(2)杂散光

(3)非平行光

(4)反射现象

(5)散射现象31第二节紫外-可见分光光度法六、偏离朗伯-比尔定律的因素149第二节紫外-可见分光光度法32第二节紫外-可见分光光度法150第二节紫外-可见分光光度法七、紫外-可见分光光度计基本结构：

光源—单色器—吸收池—检测器—显示器基本类型:(1)可见分光光度计

(2)紫外-可见分光光度计

1）单波长分光光度计单光束分光光度计